Vitória Tobias Santos. Estudo do Gene Policistrônico mille-pattes na Embriogênese do hemiptera Rhodnius prolixus

Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências

Vitória Tobias Santos

Estudo do Gene Policistrônico mille-pattes

na Embriogênese do hemiptera Rhodnius prolixus

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências

Vitória Tobias Santos

Estudo do Gene Policistrônico mille-pattes na Embriogênese do hemiptera Rhodnius prolixus

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências

Vitória Tobias Santos

Estudo do Gene Policistrônico mille-pattes na Embriogênese do hemiptera Rhodnius prolixus

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé para obtenção do título de Mestre em Produtos e Bioativos e Biociências.

Orientador: Rodrigo Nunes da Fonseca

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências

Vitória Tobias Santos

Estudo do Gene Policistrônico mille-pattes na Embriogênese do hemiptera Rhodnius prolixus

Orientador Prof. Dr. Rodrigo Nunes da Fonseca

Dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós Graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé Aloísio Teixeira, em Setembro de 2017, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre.

Trabalho apresentado em 06 de setembro de 2017.

____________________________________________ Rodrigo Nunes da Fonseca

Professor Adjunto da Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Macaé ORIENTADOR

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________ Helena Maria Marcolla Araújo

Professora Associada do Instituto de Ciências Biomédicas Universidade Federal do Rio de Janeiro

___________________________________________________ Isabela Barbosa Ramos

Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica Universidade Federal do Rio de Janeiro

____________________________________________________ Magdalena Nascimento Rennó

Professora Adjunta do Nucleo em Ecologia e Desenvolvimento SocioAmbiental de Macaé

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Professor Aloísio Teixeira

____________________________________________________ Flávia Borges Mury – Membro Suplente

Professora Adjunta do Nucleo em Ecologia e Desenvolvimento SocioAmbiental de Macaé

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Professor Aloísio Teixeira

Aprovado pela Banca Examinadora em ____/____/2017.

Dedico aos meus pais, que sempre motivaram minha curiosidade.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus, quem me capacita.

À minha família por todo o suporte e compreensão em relação às minhas escolhas. Ao meu pai pela motivação. Ao meu irmão Israel por me buscar no NUPEM quando tive que ficar no laboratório até depois do último ônibus por causa de um experimento.

Agradeço às minhas tias, avó e minha prima, que sempre estiveram presentes em todas essas etapas.

Ao meu orientador por essas oportunidades, por toda a instrução, acompanhamento, discussões e por ter auxiliado grandemente no meu desenvolvimento acadêmico. Além de tudo, sempre foi um grande amigo.

Agradeço ao Roland Zimm pelo carinho, suporte, amizade, motivação e paciência nos momentos de estresse, além das discussões científicas.

Aos meus amigos, que tornaram essa jornada mais suave sempre providenciando momentos de alegria e descontração que serviram para manter o ânimo e tentar de novo mesmo depois de várias falhas.

Dentre os amigos, agradeço aos mais próximos, que permaneceram comigo e participaram da construção dessa etapa: Lupis Ribeiro, Natália Feitosa, Rebeca Reis, Paula Veronesi, Mateus Berni, Renata Coutinho e Leonardo Oliveira.

Às professoras Flávia Mury e Cintia Barros e aos professores José Roberto, José Nepomuceno e Jackson Menezes, que também auxiliaram na orientação e na minha formação.

Aos membros do Laboratório Integrado de Ciências Morfofuncionais. Aos membros do Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda. Aos que colaboraram financeiramente com este projeto quando o financiamento não foi suficiente ou as agências de fomento se mostraram negligentes.

Ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências por esta oportunidade.

"A espantosa realidade das cousas É a minha descoberta de todos os dias.

Cada cousa é o que é,

E é difícil explicar a alguém quanto isso me alegra,

E quanto isso me basta."

ÍNDICE DE IMAGENS

Figura 1: Ciclo de vida de R. prolixus. O ovo logo após a oviposição apresenta uma coloração alaranjada e mais avermelhada ao final da embriogênese. A ninfa quando eclode não está com o exoesqueleto completamente formado, apresentando ainda uma coloração avermelhada. Até o final do primeiro dia após a eclosão o exoesqueleto já estará formado. O R. prolixus apresenta cinco estágios de ninfa, sendo que no quinto, que precede a fase adulta, já começa a formação dos brotos das asas. Quando a ninfa de quinto estágio passa para a fase adulta as asas completam sua formação. O intervalo entre cada muda varia de acordo com a alimentação, umidade e temperatura (Vitória Santos, SDB Core 2016). ... 1 Figura 2: Estágios do desenvolvimento embrionário em R. prolixus. (A) Estágio de blastoderma. (B) Formação da banda germinal. (D, G, J, M, P, S, T, V, W) Visão ventral dos estágios. (B, E, H, K, N) Visão dorsal dos estágios de desenvolvimento. (Q) Visão lateral do estágio 6. (C, F, I, L, O, R, U, X) Esquema ilustrando os principais eventos que demarcam cada estágio (BERNI et al., 2014). ... 4 Figura 3: Anatrepsis e katatrepsis. A banda germinal sofre uma rotação na região posterior do ovo, durante o início da embriogênese, que inverte a polaridade antero-posterior e dorso-ventral do embrião em relação ao ovo (anatrepsis) e essa polaridade é posteriormente revertida, quando mais tarde durante o desenvolvimento, o embrião sofre uma nova rotação na região posterior do ovo que fará com que novamente o embrião tenha a mesma polaridade do ovo (katatrepsis) (NUNES-DA-FONSECA et al., 2017). ... 5 Figura 4 : Função dos genes gap durante o desenvolvimento de insetos. (A) Em D.

melanogaster, exemplificando o que ocorre em embriões banda longa, a ativação

dos genes gap é realizada e determinada pelos genes maternais que definem a polaridade ântero-posterior do embrião. Em sequência, os genes gap ativam a expressão dos genes da regra do pares (pair-rule), que estabelecem os limites dos parasegmentos para a posterior ativação dos genes de polaridade dos segmentos durante a segmentação. (B) Em O. fasciatus como modelo, exemplificando como ocorre em embriões de banda curta, há a determinação maternal da região posterior, que orientará a expressão dos genes gap que ativará a expressão dos genes de polaridade dos segmentos para posterior segmentação, Adaptado de LIU; KAUFMAN (2005). ... 7 Figura 5: Expressão dos genes Hox em D. melanogaster durante a embriogênese e

no indivíduo adulto. Da região anterior para a posterior, os genes são expressos na

mesma sequência em que se encontram no cromossomo (GILBERT et al., 'Developmental Biology' 8th ed). ... 8 Figura 6: Comparação entre o processo de segmentação dos embriões de banda

segmentação ocorre simultaneamente ao longo de toda a banda germinal, enquanto em T. castaneum a segmentação ocorre da região anterior para a posterior, onde são acrescidos os segmentos a partir da zona de crescimento (KIMELMAN; MARTIN, 2012). ... 9 Figura 7: Modelo de como a segmentação acontece a partir da zona de crescimento

em Oncopeltus fasciatus. A segmentação é dividida em três etapas e regiões

diferentes: na primeira temos o segmento anteriormente formado, com uma alta taxa de proliferação celular, delimitada pela expressão de invected (inv) e engrailed (en); a segunda é marcada por por re-arranjo celular e constrição da região anterior da zona de crescimento, com expressão de genes da regra dos pares, como

even-skipped (eve); a terceira ocorre na região posterior da zona de crescimento, que

estende-se, levando as etapas anteriores a resultarem num novo segmento (AUMAN et al., 2017). ... 11 Figura 8: Esquema de como são gerados pequenos peptídeos biologicamente

ativos. (A) Hormônios e peptídeos são gerados no núcleo através de longos

precursores de RNAm (azul), depois são traduzidos pelos ribossomos (verde) a partir de uma única região de iniciação de transcrição e por fim processados no retículo endoplasmático e aparato de Golgi em peptídeos menores, que serão exocitados em vesículas para agir distante de sua fonte de produção. (B) smORFs policistrônicas (vermelho) podem ser traduzidas por vários ribossomos (verde) em vários pequenos peptídeos a partir de um único RNAm, liberados por excreção celular. Os peptídeos originados por smORFs também podem agir distantes da célula que os secretaram. Esquema adaptado de HASHIMOTO et al.(2008) (ALBUQUERQUE et al., 2015). ... 15 Figura 9: Comparação entre mlpt RNAm em D. melanogaster e T. castaneum. (A) Em T. castaneum a principal função de mlpt é a de um gene gap, regulando e sendo regulados pelos genes Krüppel (Kr) e giant (gt). (B) Em D. melanogaster, o RNAm de mlpt apresenta 5 smORFs, que produzem peptídeos diferentes e em T.

castaneum o mlpt apresenta 4 smORFS, com uma variação menor entre o tamanho

dos peptídeos produzidos, porém a sequência motivo das smORFs é conservada (TOUR; MCGINNIS, 2006). ... 16 Figura 10: Fenótipo obtido com o silenciamento de mlpt em T. castaneum. Quando o mlpt é silenciado em T. castaneum, há uma transformação dos segmentos abdominais em segmentos torácicos, ocorre uma perda dos segmentos mais posteriores e há também uma má formação da porção distal das pernas no fenótipo mais severo. (A) larva controle, (B-E) larvas silenciadas para mlpt, as alterações são mais severas quanto maior o silenciamento (SAVARD et al., 2006). ... 17 Figura 11: pri transforma Svb de repressor a ativador. A transcrição de pri é ativada pela ecdisona (20E) e os peptídeos de pri gerados se ligam à Ubr3 (ligase E3),

permitindo que Ubr3 reconheça a região N-terminal de Svb (quadrado azul). Ubr3 se conjugará com a enzima Ubc6, que irá realizar a ubiquitinação (Ub) da regiçao N-terminal e conseguinte, levará à degradação da região que contém o domínio repressor (R), liberando a porção ativadora (A) de Svb que contém o “zinc-finger” (ZF)(ZANET et al., 2016). ... 19 Figura 12: Evolução do mlpt. É conhecido o papel do mlpt em D. melanogaster e em

T. castaneum, mas não é conhecida a função original de mlpt, se fazendo

necessário o estudo de sua função em organismos mais basais (ALBUQUERQUE et al., 2015). ... 20 Figura 13: Mecanismo de RNAi. Esquema ilustrando o processo de degradação da fita dupla de RNA que leva ao silenciamento gênico (VAN RIJ, 2008). ... 26 Figura 14: Injeção de dsRNA em R. prolixus. A ponta da agulha é colocada na região lateral da fêmea, perfurando esse pele lateral que é elástica e que se regenera com facilidade. ... 28 Figura 15: Padrão de expressão de mlpt. Durante os primeiros estágios o mlpt é expresso na borda dos futuros lobos da cabeça e na região de invaginação do embrião (A-D). Durante a extensão da banda germinal, inicialmente o mlpt é expresso na região torácica (E-F), depois é expresso no tórax e abdome em faixas (G-J) e mais tarde na extremidade da região posterior, últimos segmentos (K) Após, o mlpt também é expresso nas regiões mais distais dos apêndices e dos lobos da cabeça (L). Por fim, o mlpt é expresso lateralmente em toda a extensão do embrião (M) e nos últimos estágios é expresso nos últimos segmentos da antena (N). Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 34 Figura 16: Redução da expressão de mlpt após o silenciamento. Houve um silenciamento de aproximadamente 70% comparado ao controle (ctrl). ... 34 Figura 17: Fenótipos observados após o silenciamento de mlpt. (A-E) embriões controle injetados com dsRNA não relacionado (dsNeo), apresentando o fenótipo de tipo selvagem (wild type-WT). (A'-E') embriões injetados com dsRNA de mlpt, apresentando as classes de fenótipos estabelecidas em diversos estágios do desenvolvimento embrionário. Marcação por DAPI. Barra de escala: 500µm. ... 36 Figura 18: Efeitos tardios do silenciamento de mlpt. Indivíduos que foram submetidos ao RNAi, mas que conseguiram se desenvolver parcialmente ou quase completamente, chegando ao estágio de ninfa pré-eclosão, mas ainda apresentando características das classes fenotípicas listadas. Embriões nas visões ventral, lado esquerdo (left), lado direito (right) e dorsal. (A-A’’’) Embrião do grupo controle (ctrl). (B-B’’’) Embrião silenciado para mlpt de Classe 2. (C-C’’’) Embrião silenciado para

mlpt de Classe 1. (D-D’’’) Embrião silenciado para mlpt de Classe 3. T1-T4: segmentos torácicos; A1-A10: segmentos abdominais; (*): segmentos fusionados. Barra de escala: 500µm. ... 38 Figura 19: Ninfas injetadas com dsRNA mlpt, que chegaram ao estágio de ninfa, mas não conseguiram deixar o ovo completamente. (A) A ninfa desenvolveu o abdome adequadamente, mas teve os dois primeiros segmentos torácicos parcialmente fusionados, gerando uma perna fusionada e mal formada no lado direito (*) e duas pernas normais no lado esquerdo (**). (B) Detalhe da região onde os segmentos estão parcialmente fusionados. (C) Diferenças morfológicas entre as pernas L1 direita (*) e esquerda (**). (D) Detalhe da porção mais distal da perna fusionada mostrando uma perna bifurcada, mas incompletamente formada. ... 38 Figura 20: Diferentes deformações e alterações na morfologia dos tarsos de pernas

do terceiro segmento torácico (L3). (A) tarso (Ts) do controle, com sua morfologia

alongada e com a presença de dois ganchos (C- claw) na sua extremidade. (B) Tarso não formado. (C) tarso apresentando multiplicação dos ganchos, com dois pares de ganchos. (D) presença de tarso duplicado, sendo um deles mal formado. (E) tarso mal formado e com um broto de duplicação. Barra de escala: 500µm. ... 39 Figura 21: Formação do exoesqueleto incompleta. O indivíduo consegue deixar o ovo, mas parte de seu exoesqueleto não sofre maturação, esse indivíduo apresenta dificuldades de locomoção por suas pernas posteriores não possuírem estabilidade. ... 39 Figura 22: Segmentação comprometida na ausência de mlpt. Marcação para hh, indicando o limite posterior dos segmentos. A formação dos segmentos é afetada conforme o silenciamento de mlpt, alguns segmentos não se formam corretamente, outros apresentam-se fusionados e em outros o processo de segmentação parece ter sido interrompido. As setas indicam onde os segmentos apresentam-se fusionados e o asterisco indica uma má formação da cabeça presente somente nos fenótipos mais severos do silenciamento de mlpt. Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 41 Figura 23: Atuação do mlpt sobre a regulação de genes gap. (A, B) controle injetado com dsRNA não relacionado, mostrando o padrão de expressão do Kr (A) e gt (B). (A', B') RNAi para mlpt. (A’) A expressão de Kr é extendida nos lobos da cabeça (seta) e mais disperso na região posterior (setas). (B’) A expressão de gt não aparenta estar afetada. Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in

situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala:

Figura 24: mlpt não afeta a expressão do gene gap Kr em estágios tardios. Nos estágios mais tardios, mesmo apresentando um fenótipo bem alterado, o padrão de expressão de Kr não se apresenta alterado. As setas em A’ indicam uma formação incompleta do abdome e a fusão do primeiro e do segundo segmento torácico. Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 42 Figura 25: Atuação de genes gap sobre a expressão de mlpt. (A e A’) controle injetado com dsRNA não relacionado, mostrando o padrão de expressão do mlpt na presença de Kr. (B e B’) RNAi para Kr, a expressão de mlpt se estende lateralmente pelo abdome (B, seta) e por toda a região das pernas. Nos estágios mais tardios, a expressão de mlpt é mantida lateralmente, mas perdida nas pernas e na região da cabeça, Há uma más formação das pernas (B’, seta branca). (C) Em embriões silenciados para gt, a expressão de mlpt aparentemente não foi alterada na região da cabeça e tórax, mesmo que o embrião não apresente todos os segmentos gnatos e o abdome esteja incompleto. Há uma fusão dos segmentos entre a transição tórax/abdome (B’, setas amarelas). Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 44 Figura 26: A expressão de pb na ausência de mlpt em relação aos genes gap. pb é expresso na região distal do terceiro apêndice gnato no controle, o mesmo é observado na ausência de mlpt porém, na ausência de Kr, essa expressão é estendida até o segundo par de apêndices torácicos. Na ausência de gt, a expressão de pb é reduzida e há uma perda dos dois primeiros pares de apêndices gnatos. A setas indicam más formações na região abdominal: formação incompleta (-mlpt, -gt, -hb e -svb) e deformações que aparentam serem brotos de pernas (-Kr). Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 46 Figura 27: A expressão de Ubx na ausência de mlpt em relação aos genes gap. A padrão de expressão do Ubx é uma forte marcação no primeiro segmento abdominal, estabelecendo o limite entre tórax e abdome (ctrl). Na ausência de mlpt, a expressão de Ubx se mantém semelhante ao controle, podendo ter um pouco de dispersão quando o fenótipo é muito alterado (-mlpt, a seta indicam abdome incompleto). Na ausência de Kr, o domínio de Ubx é estendido à toda porção abdominal (-Kr, setas indicam o início do abdome e a região onte Ubx é mais expresso). Quando gt é silenciado, a marcação de Ubx está presente somente nas pernas do último segmento torácico (-gt, a seta indica a não formação do abdome). Quando hb é silenciado, os segmentos gnatos e torácicos sofrem alterações honeóticas, sendo Ubx expresso em diversos segmentos alternado (-hb, a seta

indica uma má formação no abdome). O embriões silenciados para svb apresentam o desenvolvimento dos apêndice e abdome interrompidom mas a expressão de Ubx é mantida na região onde seria formado o primeiro segmento abdominal (-svb, seta). (*) a cabeça não é formada corretamente. Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e falsa coloração da hibridização in situ em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 46 Figura 28: A expressão de Antp na ausência de mlpt em relação aos genes gap. Independente da perda ou duplicação de segmentos torácicos, a expressão de Antp é mantida no tórax, com os seus limites em relação à região da cabeça e apêndices gnatos e região abdominal mantida. Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das características morfológicas e marcação por anticorpo para Antp em vermelho, mostrando o padrão de expressão do gene. Barra de escala: 500µm. ... 47 Figura 29: A ausência de mlpt não afeta a formação dos tricomas. Não foram observadas alterações consideráveis na quantidade e organização dos tricomas em embriões que foram silenciados para mlpt. Cutícula de fêmur de um embrião do grupo controle (ctrl) e fêmur de um embrião silenciado (-mlpt). Foi escolhido o fêmur pois é a região com maior abundância de tricomas. ... 48

LISTA DE ABREVIATURAS

Ant – Antena

Antp – Antennapedia

AP – Antero-posterior

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool (Ferramenta Básica de Alinhamento Local)

C – Claw (garra)

cad – caudal

cDNA – DNA complementar Ct – Cycle Threshold

ctrl – Controle

DAPI – 6-Diamino-2-fenilindol

Dl – Delta

DNA – Ácido Desoxirribonucleico DNAse – Enzima que degrada DNA dsRNA – RNA dupla fita

DV – Dorso-Ventral

Ef – Elongation factor en – engrailed

eve – even-skipped

Evo-Devo – Evolução e Desenvolvimento G1 – Apêndice do primeiro segmento gnato G2 – Apêndice do segundo segmento gnato G3 – Apêndice do terceiro segmento gnato

G4 – Apêndice do quarto segmento gnato (segmento que sofreu transformação homeótica)

gt – giant

Gz – growth zone (Zona de crescimento) H2O - água

hb – hunchback hh – hedgehog Hox – Homeobox inv – invected Kr – Krüppel

L1 – Perna do primeiro segmento torácico L2 – Perna do segundo segmento torácico L3 – Perna do terceiro segmento torácico

L4 – Perna do quarto segmento torácico (segmento duplicado)

mlpt – mille-pattes

mRNA – RNA mensageiro

NCBI – National Center for Biotechnology Information ORF – Open Reading Frame (Região Aberta de Leitura)

pb – proboscipedia

PBST – Phosphate Buffered Saline with Tween-20 (Tampão fosfato salino com Tween-20)

PCR – Reação da Polimerase em cadeia

pri – polished-rice rn – rotund

RNA – Ácido Ribonucleico RNAi – RNA de interferência

RNAse – Enzima que degrada RNA RNAt – RNA transportador

Rp – Rhodnius prolixus

RT qPCR – Real Time quantitative PCR (PCR quantitativo em tempo real)

sim – single-minded

siRNA – small interference RNA (pequeno RNA de interferência)

smORF – small Open Reading Frame (pequena Região Aberta de Leitura)

svb – shavenbaby tal – tarsal-less

Tb – Tíbia Ts – Tarso

Ubx – Ultrabithorax Wg – wingless

LISTA DE SÍMBOLOS

RESUMO

O Rhodnius prolixus é o principal hemiptera vetor da Doença de Chagas, sendo amplamente disperso na América Central e na maioria dos países da América do Sul. A doença é causada pelo Trypanosoma cruzi, um protozoário parasita do intestino de triatomíneos hematófagos, esses insetos são popularmente conhecidos como “barbeiros” (“kissing bugs”). Atualmente os meios de controle deste vetor estão baseados no uso de pesticidas, repelentes e telas mosquiteiras. Novos meios de controle vem sendo estudados para o controle deste vetor, como vacinas contendo antígenos, substâncias que interferem em vias metabólicas do vetor interrompendo seu ciclo de vida. Uma alternativa como meio de controle é a inibição da eclosão dos ovos, evitando a dispersão do vetor. Desta forma, entender os mecanismos moleculares envolvidos na embriogênese de R. prolixus é essencial na identificação de novos alvos. Recentemente, uma nova classe de genes que codificam pequenas sequências abertas de leitura (smORF) foi descrita como essencial para diversos processos durante o desenvolvimento. smORFs podem ser policistrônicas, por exemplo: um único RNAm produzindo vários peptídeos com um pouco mais de dez aminoácidos. Uma dessas smORF policistrônicas foi identificada no besouro

Tribolium castaneum e recebeu o nome de mille-pattes (mlpt) devido ao fato do

silenciamento deste gene gerar uma larva de besouro com múltiplas pernas. Essa alteração morfológica leva à hipotese do mlpt agir como um gene gap em besouros, estando envolvido na regulação dos genes Hox. Em contraste, as moscas da fruta mutantes para tarsal-less (ortólogo de mlpt) não apresentam grandes alterações na padronização nos estágios iniciais da embriogênese, mas apresentam alterações nos fenótipos dos tricromas, pernas e traqueas em estágios mais tardios. Sendo assim, a fim de obter novos conhecimentos sobre a evolução da função de

mille-pattes/tarsal-less em insetos, foi estudado o papel do mlpt no hemiptera R. prolixus.

As análises através de hibridização in situ mostram um padrão de expressão para

Rp-mlpt semelhante ao que foi descrito para seu ortólogo em T. castaneum. O

silenciamento de Rp-mlpt também afeta os segmentos torácicos, mas em contraste com o silenciamento de Tc-mlpt onde foi observada uma alteração na expressão dos genes Hox, em R. prolixus a expressão dos genes Hox foi menos afetada. Foram também observadas cabeça e p

ernas defeituosas, sugerindo que este gene é essencial em diversos processos durante o desenvolvimento embrionário de R. prolixus. Desta forma, este é um importante ponto de partida para o estudo de smORFs em R. prolixus como possíveis alvos para o controle deste vetor.

ABSTRACT

The Rhodnius prolixus is the major hemipteran vector of Chagas’ disease, being widely spread in Central America and most of countries in South America. The disease is caused by Trypanosoma cruzi, a protozoan parasite of hematophagous triatomines’ gut, these bugs are popularly known as “barbeiros” (“kissing bugs”). Nowadays, control methods of this vector are based on pesticides, repellent and protective nets. New methods are being studied to control this vector, like antigen vaccines and substances that interfere in the metabolic pathways of the bug, interrupting its life cycle. One possible alternative is the control by inhibiting nymph eclosion, avoiding vector dispersion. Thus, the understanding of the molecular players involved in R. prolixus embryogenesis is essential to identify new targets. Recently, a new class of genes encoding small open reading frames (smORFs) was described as essential for several developmental processes. smORFs might be polycistronic e.g. a single mRNA encoding several peptides with a little more than ten aminoacids. In the beetle Tribolium castaneum one of these polycistronic smORF was identified and named mille-pattes (mlpt), since its knockdown leads to beetle larvae with multiple legs. This morphological change leads to the proposal that mlpt acts as a gap gene in beetles, being involved with the regulation of Hox genes. In contrast, fruit fly mutants for mlpt ortholog tarsal-less do not display large alterations in early patterning, but rather display other late phenotypes in trichomes, legs and trachea. Thus, in order to obtain new insights into the evolution of the function of

mille-pattes/tarsal-less in insects were studied the role of mlpt in the hemiptera R. prolixus. In situ hybridization analyses show a similar expression pattern of Rp-mlpt

when compared to its T. castaneum ortholog. Knockdown of Rp-mlpt also affects thoracic segments but in contrast to Tc-mlpt knockdown where Hox gene misexpression is observed, in R. prolixus Hox gene expression is less affected. In addition, head and leg defects were observed, suggesting that this gene is essential for several developmental processes during R. prolixus embryogenesis. Thus, this study is an important starting point for the study of R. prolixus smOFRs as putative targets in the control of this vector.

SUMÁRIO

1.5.1) Pequenas Fases de Leitura Aberta ... 13

1.2.2) As Diversas Funções Já Descritas Para mille-pattes... 15

2) JUSTIFICATIVA ... 19 3) OBJETIVOS ... 20

3.1) Objetivo Geral ... 20

3.2) Objetivos Específicos ... 20 4) MATERIAL E MÉTODOS ... 21

4.1) Manutenção dos Animais ... 21

4.2) Fixação dos Embriões ... 21

4.3) Extração de RNA Total e Síntese de DNA Complementar ... 22

4.4) Busca por uma Sequência Homóloga de mille-pattes e de Genes Relacionados a Ele em R. prolixus ... 23

4.5) Desenho dos Primers ... 24

4.6) PCR Para Síntese de Moldes Para dsRNA e Sondas Para Hibridização in situ .. 24

4.7) Síntese de dsRNA e Silenciamento Gènico Através de Interferência por RNA .. 26

4.8) Quantificação da Expressão de mlpt ... 28

4.9) Síntese de Sonda e Hibridização in situ... 29

4.10) Imuno-histoquímica e marcação nuclear com DAPI ... 30

4.11) Preparação da Cutícula ... 30

4.12) Aquisição de Imagem e Montagem ... 31

5) RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 31

5.1) Padrão de expressão do mlpt ... 31

5.2) Avaliação da Eficiencia do Silenciamento Gênico ... 34

5.3) mlpt Como Gene Gap ... 40

5.3.1) Atuação do mlpt Sobre a Segmentação ... 40

5.3.3) Interação do mlpt com os Genes Hox ... 44

5.4) Interação entre Rp-mlpt e Rp-svb ... 47

5.5) Discussão ... 48

6) CONCLUSÃO ... 50 REFERÊNCIAS ... 51 APÊNDICE A - Expressão de single-minded no RNAi para mlpt ... 58 APÊNDICE B - Protocolos das Soluções Utilizadas ... 59 APÊNDICE C - Protocolo para Hibridização in situ ... 61

1) INTRODUÇÃO

1.1) Rhodnius prolixus

O Rhodnius prolixus é um inseto muito conhecido devido ao fato de ser um dos principais vetores da Doença de Chagas (MESQUITA et al., 2015). Ele é um hemiptera triatomíneo de ampla distribuição na América Latina (MOUGABURE-CUETO; PICOLLO, 2015; URIBE, 1926), com diversos nomes populares em cada região, sendo conhecido no Brasil como Barbeiro (nome geral dado aos triatomíneos hematófagos vetores do Trypanosoma cruzi).

Além da importância médica, o R. prolixus é de grande importância na entomologia molecular, graças aos estudos realizados por Sir V.B. Wigglesworth, que explorou as vantagens do R. prolixus (um inseto relativamente grande, de fácil manipulação e criação em laboratório) para descrever diversos processos fisiológicos e alterações morfológicas, ressaltando a descrição do mecanismo hormonal envolvido no controle da maturação do indivíduo feita por ele (WIGGLESWORTH, 1934).

O R. prolixus é um inseto hemimetábolo, o que significa que ele não passa por um processo de metamorfose para chegar à fase adulta e que a ninfa que eclode do ovo apresenta uma morfologia muito semelhante à do adulto, como se fosse uma versão miniaturizada do adulto. Seu ciclo de vida é divido em fase embrionária, 5 estágios de ninfa e adulto (Figura 1).

Figura 1: Ciclo de vida de R. prolixus. O ovo logo após a oviposição apresenta uma

não está com o exoesqueleto completamente formado, apresentando ainda uma coloração avermelhada. Até o final do primeiro dia após a eclosão o exoesqueleto já estará formado. O R. prolixus apresenta cinco estágios de ninfa, sendo que no quinto, que precede a fase adulta, já começa a formação dos brotos das asas. Quando a ninfa de quinto estágio passa para a fase adulta as asas completam sua formação. O intervalo entre cada muda varia de acordo com a alimentação, umidade e temperatura (Vitória Santos, SDB Core 2016).

O período de embriogênese pode ser dividido em 10 estágios reconhecidos por eventos específicos, onde no primeiro estágio o embrião se encontra no estágio de blastoderma (Figura 2 A); no segundo estágio ocorre a formação da banda germinal (Figura 2 B-C); ao início do terceiro estágio inicia-se o processo de gastrulação (Figura 2 D-F), que é seguido pela extensão da banda germinal (Figura 2 G-I). Nesse processo o embrião sofre uma inversão de sua polaridade dorso-ventral/antero-posterior em relação ao ovo. Esse processo chama-se anatrepsis (Figura 3); no estágio quatro dá-se início a segmentação do embrião (Figura 2 J-L); os apêndices começam a se formar durante o quinto estágio (Figura 2 M-O); no sexto estágio o embrião completa a segmentação e extensão da banda germinal (Figura 2 P-R); no sétimo estágio o embrião começa a contrair-se e seus apêndices já estão maiores (Figura 2 S); durante o oitavo estágio, durante a contração do embrião ele se desloca na região posterior do ovo invertendo sua polaridade (Figura 2 T-V), passando a ter novamente a mesma polaridade dorso-ventral/antero-posterior em relação ao ovo. Esse processo se chama katatrepsis (Figura 3); no nono estágio o embrião já se encontra bem desenvolvido, com os apêndices formados Nesse estágio inicia-se o fechamento dorsal e a deposição da cutícula (Figura 2 V); no décimo estágio o fechamento dorsal conclui-se, o embrião encontra-se completamente revestido pela cutícula (Figura 2 W-X); internamente encontra-seus órgãos já estão formados e o embrião está pronto para eclodir (BERNI et al., 2014).

Recentemente o R. prolixus tem se mostrado também como um ótimo modelo para estudos de biologia do desenvolvimento e evolução de insetos, de forma que boa parte dos protocolos que vêm sendo utilizados em outros insetos, principalmente no hemiptera Oncopeltus fasciatus, funcionam de forma eficiente, como por exemplo a interferência por RNA realizada de forma parental, marcações por anticorpo e hibridização in situ (BERNI et al., 2014; NUNES-DA-FONSECA et al., 2017; SOUZA-FERREIRA et al., 2014a). A primeira descrição detalhada da embriogênese de R. prolixus foi realizada entre 1935 e 1936 por Helen Mellamby,

onde através de cortes histológicos ela descreve o desenvolvimento externo e a organogênese durante essa fase. Algo interessante nos embriões de R. prolixus é que pela observação da forma do ovo e da mudança de coloração é possível estipular se o embrião está nos estágios mais iniciais ou finais do desenvolvimento e sua posição e polaridade (Figura 3), sendo de fácil visualização ao estereoscópio após a katatrepsis, quando submerso em algum líquido que reduz a refração da casca do ovo (NUNES-DA-FONSECA et al., 2017; MELLAMBY, 1935; MELLAMBY 1936).

Figura 2: Estágios do desenvolvimento embrionário em R. prolixus. (A) Estágio de

blastoderma. (B) Formação da banda germinal. (D, G, J, M, P, S, T, V, W) Visão ventral dos estágios. (B, E, H, K, N) Visão dorsal dos estágios de desenvolvimento. (Q) Visão lateral do

estágio 6. (C, F, I, L, O, R, U, X) Esquema ilustrando os principais eventos que demarcam cada estágio (BERNI et al., 2014).

Figura 3: Anatrepsis e katatrepsis. A banda germinal sofre uma rotação na região posterior

do ovo, durante o início da embriogênese, que inverte a polaridade antero-posterior e dorso-ventral do embrião em relação ao ovo (anatrepsis) e essa polaridade é posteriormente revertida, quando mais tarde durante o desenvolvimento, o embrião sofre uma nova rotação na região posterior do ovo que fará com que novamente o embrião tenha a mesma polaridade do ovo (katatrepsis) (NUNES-DA-FONSECA et al., 2017).

1.2) Evo-Devo

Este trabalho inicia-se com uma breve definição do que vem a ser Evo-Devo, que é o principal conceito que pauta este estudo. O Termo “Evo-Devo” é uma abreviação de Evolução e Desenvolvimento, mas que traz consigo o significado destas duas áreas distintas sendo abordadas de maneira integrada, de forma que uma complementa a outra e uma é necessária para a compreensão da outra. Sendo assim, para compreender como um determinado gene atua em um organismo é necessário observar seu papel durante o desenvolvimento do organismo e para entender como este processo surgiu naquele organismo, é necessário comparar com o que é conhecido em outros organismos, a fim de poder construir a história evolutiva por trás desse evento. Algumas correlações evolutivas podem não ser tão visíveis quando comparamos indivíduos já desenvolvidos, mas podem se tornar

mais claras quando observados os estágios iniciais da formação deste indivíduo (MARCELLINI et al., 2017).

1.3) Genes Gap

Genes gap são genes que atuam no início da embriogênese em artrópodes estabelecendo uma rede hierárquica de regulação gênica que consiste na delimitação espacial dos segmentos, segmentação, polarização e identidade dos segmentos (PATEL et al., 1989; SCHÖNAUER et al., 2016). Eles fazem parte de uma série de cascatas de sinalização que é iniciada pelos componentes maternos depositados no embrião que irão delimitar a orientação do eixo antero-posterior. Em seguida os genes gap são ativados e essa expressão estabelecerá os domínios do blastoderma a região onde os genes da regra dos pares, que delimitam as regiões dos segmentos e que serão responsáveis pela expressão dos genes de polaridade dos segmentos (Figura 4: banda longa). Em Drosophila melanogaster esses eventos acontecem praticamente de forma sincronizada em todo o embrião, em pulsos. Já em O. fasciatus esse processo inicia-se na região posterior do blastoderma e ocorre nessa região até o estágio de início da expressão dos genes de polaridade dos segmentos, ainda na fase de blastoderma, e continua após a gastrulação, durante a extensão da banda germinal (Figura 4: banda curta) (LIU; KAUFMAN, 2005).

Figura 4 : Função dos genes gap durante o desenvolvimento de insetos. (A) Em D.

melanogaster, exemplificando o que ocorre em embriões banda longa, a ativação dos genes gap é realizada e determinada pelos genes maternais que definem a polaridade ântero-posterior do embrião. Em sequência, os genes gap ativam a expressão dos genes da regra do pares (pair-rule), que estabelecem os limites dos parasegmentos para a posterior ativação dos genes de polaridade dos segmentos durante a segmentação. (B) Em O. fasciatus como modelo, exemplificando como ocorre em embriões de banda curta, há a determinação maternal da região posterior, que orientará a expressão dos genes gap que ativará a expressão dos genes de polaridade dos segmentos para posterior segmentação, Adaptado de LIU; KAUFMAN (2005).

A expressão dos genes gap em suas regiões específicas serão os primeiros responsáveis pela ativação do complexo de genes Hox, a segunda onda de ativação é realizada pelos genes da regra dos pares, que também é regulada pelos genes

gap. Os genes do complexo Hox serão os responsáveis pela determinação da

identidade de cada segmento do embrião, por esta razão é importante que eles sejam expressos nas regiões corretas. A não expressão desses genes num determinado segmento, faz com que o gene Hox adjacente seja expresso, levando à uma transformação da identidade do segmento (transformação homeótica) (HEFFER; PICK, 2013). Isso é decorrente do fato de esses genes serem expressos ao longo do embrião, da região anterior para a posterior, na mesma sequência em que eles se encontram no cromossomo. Essa orientação na região de expressão é mantida em todas as fases posteriores do desenvolvimento (Figura 5).

Figura 5: Expressão dos genes Hox em D. melanogaster durante a embriogênese e no

indivíduo adulto. Da região anterior para a posterior, os genes são expressos na mesma sequência em que se encontram no cromossomo (GILBERT et al., 'Developmental Biology' 8th ed).

1.4) Segmentação

O corpo em segmentos é algo presente nos três maiores táxons (mais abundântes) de metazoários (protosomos ecdysozoa, lophotrocozoa, deuterostomos) (PEEL; CHIPMAN; AKAM, 2005) e esse processo acontece com a adição de compartimentos da região anterior para a posterior durante a embriogênese. O processo de segmentação é regulado por um mecanismo chamado relógio de segmentação (”segmentation clock”), que consiste em oscilações na expressão gênica de forma cíclica de acordo com a adição dos segmentos. Esse processo é dependente da extensão da banda germinal (EL-SHERIF; AVEROF; BROWN, 2012; SARRAZIN; PEEL; AVEROF, 2012).

Em D. melanogaster que é um embrião de banda longa, ou seja, um embrião que ocupa quase todo o espaço dentro do ovo e que todas a regiões do corpo se desenvolvem praticamente simultaneamente (Figura 6 A-D), a segmentação ocorre de forma que todos os segmentos são formados aproximadamente ao mesmo tempo, logo após completar a extensão da banda germinal. Em insetos mais basais,

que apresentam a embriogênese com banda germinal curta como em Tribolium

castaneum (também em R. prolixus), onde a banda germinal inicialmente ocupa uma

pequena porção do ovo e conforme se desenvolve vai ocupando o restante do espaço (principalmente no fim da embriogênese) e inicialmente é formada a região da cabeça, seguida pela formação do toráx e depois o abdome (KIMELMAN; MARTIN, 2012). A segmentação ocorre com a adição de segmentos conforme a banda germinal vai se extendendo (Figura 6 E-I), sendo um processo mais dependente do rearranjo celular do que da proliferação celular (Figura 7) (BENTON; AKAM; PAVLOPOULOS, 2013; NAKAMOTO et al., 2015).

Figura 6: Comparação entre o processo de segmentação dos embriões de banda longa e

de banda curta. Em D. melanogaster (embrião de banda longa) a segmentação ocorre simultaneamente ao longo de toda a banda germinal, enquanto em T. castaneum a

segmentação ocorre da região anterior para a posterior, onde são acrescidos os segmentos a partir da zona de crescimento (KIMELMAN; MARTIN, 2012).

Em T. castaneum os ciclos do relógio não são constantemente uniformes. Inicialmente os segmentos são adicionados de forma mais lenta e depois passam a ser adicionados com intervalos de tempo menores. Interessantemente, essa mudança na duração dos ciclos do relógio de segmentação coincidem com o fim da adição de segmentos torácicos e início dos segmentos abdominais, o que sugere que diferentes mecanismos controlam esse processo nessas diferentes regiões da banda germinal (NAKAMOTO et al., 2015). Em O. fasciatus, o processo de segmentação é dividido em dois momentos: o primeiro, consistindo na delimitação espacial dos segmentos da cabeça e tórax, ainda durante a fase de blastoderme, e o segundo momento, que ocorre durante a extensão da banda germinal, onde os segmentos abdominais são adicionados, sequencialmente, um após o outro, a partir da zona de crescimento (AUMAN et al., 2017; STAHI; CHIPMAN, 2016).

O mecanismo de adição de segmentos é realizada por uma rede de regulação gênica que articula o rearranjo celular com formação e delimitação de novos segmentos. Na região posterior da banda germinal, ao fim do último segmento formado é observada a expressão de invected e engrailed, separando o segmento já formado do que virá a se formar. Logo após o último segmento, está presente a zona de crescimento, região marcada pelo rearranjo das células proliferadas anteriormente para a extensão da banda germinal, permitindo a adição de um novo segmento. Essa zona de crescimento é dividida em duas porções: uma anterior e uma posterior. Na região anterior da zona de crescimento a taxa e proliferação celular é baixa, porém a taxa de rearranjo celular é elevada e nessa região ocorre uma constrição da zona de crescimento e há uma expressão em faixas de

even-skipped (eve) e Delta (Dl), que delimitam os próximos segmentos a serem

adicionados. Na região posterior da zona de crescimento há uma alta expressão de

caudal (cad) que é responsável por realizar a extensão da zona de crescimento, que

por consequência estenderá toda a banda germinal (T. castaneum e O. fasciatus) (AUMAN et al., 2017; STAHI; CHIPMAN, 2016; WILLIAMS; NAGY, 2017).

Figura 7: Modelo de como a segmentação acontece a partir da zona de crescimento em

Oncopeltus fasciatus. A segmentação é dividida em três etapas e regiões diferentes: na primeira temos o segmento anteriormente formado, com uma alta taxa de proliferação celular, delimitada pela expressão de invected (inv) e engrailed (en); a segunda é marcada por por re-arranjo celular e constrição da região anterior da zona de crescimento, com expressão de genes da regra dos pares, como even-skipped (eve); a terceira ocorre na região posterior da zona de crescimento, que estende-se, levando as etapas anteriores a resultarem num novo segmento (AUMAN et al., 2017).

1.5) O Gene mille-pattes

Nos últimos anos têm entrado em foco o estudo de genes que transcrevem RNA mensageiros (RNAm) com diversas pequenas fases de leitura aberta (small Open Reading Frames - smORF) num único transcrito (KOZAK, 1983). Tradicionalmente, eram anotados regiões a partir de 100 aminoácidos, o que exclui outras sequências com menos aminoácidos que podem estar desempenhando uma função biológica (HASHIMOTO et al. 2008). Até poucos anos atrás, pouco se era estudado sobre a função dos genes que codificam pequenas regiões abertas de leitura (small open reading frames – smORF), acreditava-se que esses genes não desempenhavam nenhum papel de grande importância (TUPY et al., 2005).

Existe uma grande quantidade dessas smORFs no genoma dos diversos organismos (LADOUKAKIS et al., 2011), mas a relevância e funcionalidade dos peptídeos provenientes desses genes são muito pouco elucidadas e compreendidas devido às suas propriedades, que dificultam sua detecção e caracterização, requerendo estratégias bioquímicas e bioinformáticas mais específicas (MAGNY et al., 2013). Alguns trabalhos vêm mostrando que essas smORFs podem ser altamente funcionais, sendo fundamentais para o desenvolvimento embrionário em insetos e em estágios posteriores. Em seu trabalho, SAVARD et al. (2006) sugerem que esse RNA policistrônico, são uma nova classe de reguladores, semelhante à micro-RNAs, que até então não eram estudados devido ao seu tamanho, sendo difícil de identificá-los através de métodos bioinformáticos convencionais, devido ao pequeno tamanho dos peptídeos e não apresentam uma estrutura que caracterize um “hairpin”, comum aos micro-RNAs. Dentro desta condição, se faz necessário buscar regiões codificantes dentro de regiões teoricamente não codificantes (SAGHATELIAN; COUSO, 2015).

Geralmente os pequenos peptídeos que conhecemos por desempenhar alguma função, como os neuropeptídeos, são sintetizados a partir da clivagem de uma proteína percursora. Porém, no caso das smORFs, os peptídeos são sintetizados diretamente pelo processo de tradução do RNAm. É possível que esses peptídeos atuem através da ligação a receptores acoplados à proteína G (TOUR; MCGINNIS, 2006; MOUNTJOY et al., 1992). Com os dados até então obtidos, têm-se que estêm-ses peptídeos são capazes de deixarem as células atravessando a membrana plasmática, devido ao seu pequeno tamanho e não exocitados por vesículas (RICHARD et al., 2003). Estima-se que cerca de 5-10% do genoma seja composto por smORFs, onde poucas foram identificadas, mas demonstraram exercer funções biológicas de grande importância, levando a acreditar que ainda podem se identificadas outras smORFs de semelhante importância (SAGHATELIAN; COUSO, 2015).

O mille-pattes (mlpt) é um desses genes policistrônicos com várias smORFs, que atua de formas variadas em diversos processos em diferentes organismos, dentres esses processos. Por exemplo: atua como um gene gap e está envolvido na regulação de genes do complexo Hox em T. Castaneum, está envolvido com a formação do sistema respiratório e formação das pernas em D. melanogaster e T.

castaneum, faz parte da via de Ecdisona em D. melanogaster. Além desse gene,

ainda existem muitos outros que produzem RNAm policistrônicos que ainda não foram estudados. Recentemente, foi descrito um outro gene que codifica 2 peptídeos menores que 30 aminoácidos que atuam na regulação dos canais de cálcio da musculatura do coração de D. melanogaster, chamado sarcolambam, com duas smORF que codificam peptídeos de 28 e 29 aminoácidos respectivamente, que regulam o funcionamento dos canais de Ca2+ na musculatura do coração de D. melanogaster, carreando o Ca2+ do retículo sarco endoplasmático necessário para a contração muscular. Esses peptídeos são homólogos aos peptídeos sarcolipina e fosfolambam e é possível que esses três peptídeos tenham derivado de um percursor em comum (MAGNY et al., 2013; SAGHATELIAN; COUSO, 2015). Existem também outras smORFs que podem estar envolvidas com diversos processos celulares como: transporte, metabolismo intermediário e na manutenção da estabilidade genômica e muitos desses genes são bem conservados entre os eucariotos. Essas novas descobertas sobre a funcionalidade das smORFs têm se colocado como uma quebra de um paradigma na biologia molecular (ALBUQUERQUE et al., 2015)

1.5.1) Pequenas Fases de Leitura Aberta

SmORF são sequências que compreendem menos de 100 códons e são passíveis de tradução, comumente presentes em RNA não codificantes (CARNINCI et al., 2005). Segundo BASRAI; HIETER; BOEKE (1997), os peptídeos podem ser compostos dentre dois a 50 aminoácidos (estruturas maiores que 50 aminoácidos já são consideradas proteínas), sendo que a maior parte dos peptídeos que atualmente são conhecidos por desempenhar alguma atividade biológica, como os hormônios peptídicos e os neuropeptídeos, são provenientes de longos precursores proteicos, esses precursores sofrem uma clivagem proteolítica que resultará em estruturas menores, como os peptídeos Com as smORFs, os peptídeos são sintetizados diretamente pelo ribossomo durante o processo de tradução, sendo que diversas smORFs podem lidas simultaneamente, pois cada uma apresenta a sua região de início da tradução e são liberadas no citoplasma após sua síntese, não se exclui a possibilidade desses peptídeos sofrerem proteólise após sua síntese ou alguma

outra modificação pós-traducional (Figura 8) (KONDO et al., 2007; RICHARD et al., 2003).

Com o uso de novos algoritmos, foi possível identificar em mamíferos aproximadamente 3000 smORFs candidatas para estudo de função, já em moscas-do-vinagre foram identificadas 401 smORFs conservadas e estima-se que em insetos possam existir aproximadamente 4500 smORFs (CHENG et al., 2011; VANDERPERRE et al., 2013). Boa parte das sequências de smORFs não estão anotadas, sendo necessárias ferramentas como a proteômica e proteogenômica (que integra os dados da genômica com a proteômica) para identificar esses peptídeos (MACKOWIAK et al., 2015). Conhecer melhor esses genes é de grande importância uma vez que desempenham suas funções biológicas de forma não canônica (COUSO; PATRAQUIM, 2017; GALINDO et al., 2007).

Com a descoberta da funcionalidade das smORFs, diversos grupos têm buscado identificar genes que contém essas regiões e que possam sintetizar peptídeos potencialmente ativos (MA et al., 2016). Uma das primeiras descrições de smORFs desempenhando funções biológicas foi realizada em leveduras e mais posteriormente foi visto que existem pelo menos outras 100 smORFs no genoma de

Saccharomyces cerevisiae e que pelo menos algumas dessas smORFs são

traduzidas em peptídeos funcionais (KASTENMAYER et al., 2006; KESSLER et al., 2003). Outros trabalhos estão sendo realizados com plantas (ROHRIG et al., 2002) e animais, principalmente com invertebrados, como ascídias (LU; ZHUANG; LIU, 2014), hidras (BOSCH; FUJISAWA, 2001) e insetos, como Drosophila sp., Tribolium

castaneum e Bombyx mori (KONDO et al., 2007; LADOUKAKIS et al., 2011; MAGNY

et al., 2013; ROY et al., 2012; SAVARD et al., 2006). Em inseto já foi descrito smORFs que possuem ações bem variadas, como formação dos segmentos, apêndices locomotores, sistema respiratório, atividade cardíaca, metamorfose e padronização de tricomas (estruturas, “pêlos”, sensoriais, distribuídos em diversas regiões do corpo do inseto). Sendo que em alguns casos o mesmo gene está envolvido em mais de um desses eventos (SAGHATELIAN; COUSO, 2015).

Figura 8: Esquema de como são gerados pequenos peptídeos biologicamente ativos. (A)

Hormônios e peptídeos são gerados no núcleo através de longos precursores de RNAm (azul), depois são traduzidos pelos ribossomos (verde) a partir de uma única região de iniciação de transcrição e por fim processados no retículo endoplasmático e aparato de Golgi em peptídeos menores, que serão exocitados em vesículas para agir distante de sua fonte de produção. (B) smORFs policistrônicas (vermelho) podem ser traduzidas por vários ribossomos (verde) em vários pequenos peptídeos a partir de um único RNAm, liberados por excreção celular. Os peptídeos originados por smORFs também podem agir distantes da célula que os secretaram. Esquema adaptado de HASHIMOTO et al.(2008) (ALBUQUERQUE et al., 2015).

1.2.2) As Diversas Funções Já Descritas Para mille-pattes

Atualmente foi encontrado um gene que atua como um gene gap, mas que produz um RNA com uma estrutura não esperada e diferente dos demais RNAs de genes gap. Ele apresenta um padrão de expressão que varia ao longo do desenvolvimento, inicialmente expresso nos segmentos abdominais, de forma característica dos genes gap. Ele contém regiões (3 regiões para T. castaneum e 4 para D. melanogaster) que apresentam o mesmo motivo “LDPTGXY” (sintetizando peptídeos de 11 a 15 aminoácidos em T. castaneum e de 11 a 32 aminoácidos em

D. melanogaster) e um quarto motivo “ETSSCRRRR” (Figura 9 B), com uma maior

quantidade de arginina (sintetizando um peptídeo de 32 aminoácidos para T.

castaneum e 49 aminoácidos para D. melanogaster) e é conservado em insetos

gene foi denominado de mille-pattes (mlpt) em T. castaneum, que significa “múltiplas pernas”, devido ao seu fenótipo (Figura 10). Em T. castaneum, foi visto que esse gene interage de forma regulatória com os genes Krüppel (Kr) e giant (gt) (Figura 10 A), alterando a formação dos segmentos e quando silenciado , o fenótipo observado é o de multiplicação dos segmentos torácicos e perda dos segmentos abdominais, demonstrando uma possível alteração na regulação da expressão de genes do complexo Hox (SAVARD et al., 2006). Os fenótipos obtidos com o silenciamento para hunchback (hb) em T. castaneum não foram muito conclusivos, porém o silenciamento de Kr e gt apresentou fenótipos bem característicos de uma perda de função de genes gap. Quando o mlpt foi silenciado, houve uma alteração na sua expressão, influenciando diretamente na formação dos segmentos, tanto estruturalmente quanto em relação à sua identidade, assim classificando o mlpt como um gene gap. Em D. melanogaster esse efeito na segmentação e regulação de genes Hox não é observado (GALINDO et al., 2007).

Figura 9: Comparação entre mlpt RNAm em D. melanogaster e T. castaneum. (A) Em T.

castaneum a principal função de mlpt é a de um gene gap, regulando e sendo regulados pelos genes Krüppel (Kr) e giant (gt). (B) Em D. melanogaster, o RNAm de mlpt apresenta 5 smORFs, que produzem peptídeos diferentes e em T. castaneum o mlpt apresenta 4 smORFS, com uma variação menor entre o tamanho dos peptídeos produzidos, porém a sequência motivo das smORFs é conservada (TOUR; MCGINNIS, 2006).

Figura 10: Fenótipo obtido com o silenciamento de mlpt em T. castaneum. Quando o mlpt é

silenciado em T. castaneum, há uma transformação dos segmentos abdominais em segmentos torácicos, ocorre uma perda dos segmentos mais posteriores e há também uma má formação da porção distal das pernas no fenótipo mais severo. (A) larva controle, (B-E) larvas silenciadas para mlpt, as alterações são mais severas quanto maior o silenciamento (SAVARD et al., 2006).

Além de atuar como um gene gap, o mlpt ainda apresenta outras funções bem variadas. Em D. melanogaster, esse gene também é conhecido como polished-rice (pri) e less(tal) (GALINDO et al., 2007; KONDO et al., 2007).O nome

tarsal-less se deve ao fato de as Drosophilas multantes para esse gene não formarem o

tarso ou apresentarem má formações na porção distal das pernas e no tarso, e essa falha é gerada no estabelecimento dos domínios das regiões tarsais nos discos imaginais que irão originar as pernas (GALINDO et al., 2007; PUEYO; COUSO, 2008). Ele é expresso no mesmo momento em que a região tarsal inicia sua

especificação. Um dos genes ativados nesse evento é o gene rotund (rn) que é ativado por um fator de transcrição “zinc-finger” (“dedo de zinco”), e quando o tal é silenciado a expressão de rn é perdida. Em Drosophilas mutantes para rn (perda ou super expressão) a expressão de tal não é afetada, evidenciando o rn como um gene que é regulado por tal (GALINDO et al., 2007). Quando observado o papel de

tal durante a embriogênese de D. melanogaster, foi observado que o silenciamento é

letal, pois o embrião (pré-larva) não apresenta o sistema respiratório formado adequadamente: as traquéias não são completamente formadas (formação interrompida), ocorre uma perda da estrutura cefalofaríngea e espiráculos se apresentam defeituosos (GALINDO et al., 2007). Outra alteração fenotípica que foi observada em embriões de D. melanogaster foi a ausência das faixas de tricomas (cinturões de dentículos) ao longo dos segmentos e na região dorsal, deixando o embrião com uma cutícula lisa, o que deu a esse gene o nome de polished-rice (“arroz polido”). Esse fenótipo ocorre por uma alteração nas estruturas da actina epitelial, alterando a formação desses tricomas (KONDO et al., 2007). Mais adiante foi visto que esse fenótipo ocorre pois o pri é um ativador do gene shavenbaby (svb), que é responsável pela formação desses tricomas e algumas estruturas da cutícula (ARIF; KITTELMANN; MCGREGOR, 2015; KONDO et al., 2010). Svb normalmente um repressor, sofre uma clivagem na região N-terminal mediada pelo pri (Figura 11), passando a ser um ativador (ZANET et al., 2016). Outros estudos mostraram que uma super-expressão de pri em D. melanogaster induz a formação ectópica de estruturas sensoriais e expansão da venação e quebra do limite dorso-ventral das asas através da regulação de Notch pelo pri (PI et al., 2011). Outro importante evento, foi a descoberta de que é necessário que a transcrição de pri seja ativada pela 20-Hidroxiecdisona (20E), mostrando que o pri pode estar também relacionado com o processo de metamorfose (CHANUT-DELALANDE et al., 2014). Em Drosophilas mutantes para phantom (phm - enzima essencial para síntese de ecdisona) apresenta, uma cutícula fina e falta de tricomas, semelhante efeito é visto quando os receptores para 20E foram inativados e em ambos experimentos a expressão de pri foi reduzida. Porém, quando pri foi re-expresso nos mutantes para

phm, a maturação da cutícula foi recuperada e também a formação de tricomas

Figura 11: pri transforma Svb de repressor a ativador. A transcrição de pri é ativada pela

ecdisona (20E) e os peptídeos de pri gerados se ligam à Ubr3 (ligase E3), permitindo que Ubr3 reconheça a região N-terminal de Svb (quadrado azul). Ubr3 se conjugará com a enzima Ubc6, que irá realizar a ubiquitinação (Ub) da regiçao N-terminal e conseguinte, levará à degradação da região que contém o domínio repressor (R), liberando a porção ativadora (A) de Svb que contém o “zinc-finger” (ZF)(ZANET et al., 2016).

2) JUSTIFICATIVA

Como anteriormente comentado, foram descritas diversas funções para o mlpt em D. melanogaster e em T. castaneum. Porém algumas dessas funções são diferentes entre essas duas espécies, além do que ainda precisa ser descrito e o que está sendo observado em outras espécies, como a interação com a via da ecdisona descrita em B. mori. Estudar o papel do mlpt em R. prolixus não traz somente informações sobre o desenvolvimento desta espécie, mas traz também uma peça a mais, de grande importância, para a compreensão da origem do mlpt e de suas funções, uma informação sobre a evolução deste gene, auxiliando na identificação da sua função nos insetos mais basais. Além disso não é certo quais funções são derivadas e quais não são (Figura 12).

Figura 12: Evolução do mlpt. É conhecido o papel do mlpt em D. melanogaster e em T.

castaneum, mas não é conhecida a função original de mlpt, se fazendo necessário o estudo de sua função em organismos mais basais (ALBUQUERQUE et al., 2015).

3) OBJETIVOS

3.1) Objetivo Geral

Analisar e caracterizar papel do gene mille-pattes no desenvolvimento embrionário em R. prolixus, focando na hipótese dele como um gene gap, identificando as suas funções e suas interações com outros genes envolvidos em importantes processos durante a embriogênese, principalmente na segmentação e determinação da identidade dos segmentos.

3.2) Objetivos Específicos

- Realizar o silenciamento gênico (RNAi) para mlpt e analisar as alterações morfológicas decorrentes do RNAi para buscar compreender em que processos este gene está envolvido;

- Realizar hibridizações in situ para visualizar o padrão de expressão do mlpt e correlacionar sua expressão com sua função;

- Quantificar e comparar a expressão do mlpt no tipo selvagem e no silenciado para verificar a relação entre a eficiência do silenciamento e os fenótipos obtidos;

- Comparar os resultados obtidos para entender como o mlpt atua, em que processos está envolvido e descrever o seu papel;

- Identificar se o mlpt atua como gene gap durante a embriogênese de R.

prolixus.

4) MATERIAL E MÉTODOS

4.1) Manutenção dos Animais

Foram utilizados R. prolixus mantidos no insetário do Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda (NUPEM – UFRJ Campus Professor Aloísio Teixeira). A criação e manutenção dos organismos consiste em um sistema onde os insetos são separados em diferentes potes de acordo com os estágios de desenvolvimento: ovos pré-eclosão, cincos estágios ninfais e adultos de acordo com a quantidade de alimentações (o que permite estimar a idade e duração do ciclo de vida). Os potes são mantidos em uma estufa com temperatura constante de 28ºC e umidade relativa entre 70-80%. A alimentação dos insetos é realizada através da exposição controlada dos insetos a coelhos, para que os insetos possam realizar a ingestão de sangue através de picadas nas orelhas do coelho, onde é uma região de pouco pêlo e alta vascularização (SOUZA-FERREIRA et al., 2014b; BUXTON, 1930). Este projeto se encontra dentro das exigências da Comissão de Ética e Uso de Animais de Experimentação (CEUA - Mac032) do Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

4.2) Fixação dos Embriões

Após as fêmeas serem alimentadas, elas são monitoradas para observar o início do período de oviposição. A partir do início da oviposição, os ovos foram