No gelo encontrarão um tubo amarelo com a Master Mix (mistura de tampão da Taq + dNTPs + primers).
1. Adicione aos seus tubos 20 μl de cada DNA a 20 μl de Master Mix e misture o líquido com a ação da pipeta. Tenha o cuidado para não contaminar as amostras com material biológico seu ou ambiental. Para isso é necessário utilizarem luvas e pontas estéreis com filtro. Mantenha os tubinhos em gelo até os poder colocar no aparelho de PCR.
2. Programe o termociclador da seguinte forma:
94 oC 2 minutos 35 ciclos de 3 passos:
94 oC 30 segundos 52 oC 30 segundos 72 oC 1 minuto
Último passo de extensão 72 oC 10 minutos
3. Carregar num gel de agarose: 20 μl de marcador (ladder) e 20 μl de cada produto de PCR (com sample buffer). Correr o gel durante 30 minutos a 80 mV (não deixar sair o corante amarelo do fundo do gel) e observar no transiluminador (fotografar para registar os resultados).
DISCUSSÃO
1. Observar os padrões de bandas e comparar o padrão da CS com o de cada um dos suspeitos.
2. Que conclusão pode retirar desta análise? Tente justificar a sua conclusão.
MATERIAL Luvas Agarose TBE 1x
Pipetas (P10, P100 e P1000) Pontas com filtros para as pipetas Canetas de acetato
Gelo
Microcentrífuga Termociclador Transiluminador Tinas de eletroforese Fonte
Erlenmeyer de 250 ml Proveta de 250 ml
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 39 de 43 Aulas práticas nº 8 e 9
Análise de RFLP na investigação forense
CONCEITOS CHAVE
• As enzimas de restrição clivam o DNA em sequências nucleotídicas palindrómicas específicas
• As enzimas de restrição provavelmente surgiram em bactérias para proteção contra infeções bacteriofágicas
• A eletroforese em gel de agarose é o processo usado na separação de fragmentos de DNA com base no seu tamanho
OBJETIVOS
• Perceber o funcionamento das enzimas de restrição e a sua aplicação na deteção de RFLPs
• Discutir a eletroforese em gel de agarose como uma técnica de separação de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos
• Discutir as diferentes bandas de fragmentos de DNA produzidas pela digestão e interpretar os resultados obtidos
INTRODUÇÃO
A enzimas de restrição ou endonucleases de restrição reconhecem sequências específicas de DNA, clivando‐
o nessas sequências. São conhecidas mais de 200 enzimas de restrição. As enzimas de restrição são homodímeros, ou seja, consistem em duas subunidades proteicas idênticas unidas entre si. Esta estrutura permite a sua ligação à sequência palindrómica específica e permite‐lhe cortar, nas duas cadeias em simultâneo, as ligações fosfodiéster apropriadas. Uma sequência palindrómica é aquela que lida nas duas cadeias na direção 5’‐3’ é exatamente igual (exemplo: o palíndroma 5’GAATTC3’; a cadeia complementar seria 3’CTTAAG5’). Na Figura 22 estão representados os locais de reconhecimento das duas enzimas de restrição utilizados neste trabalho prático.
XmnI
HincII
Código das letras B = C or G or T D = A or G or T H = A or C or T K = G or T M = A or C N = A or C or G or T R = A or G
S = C or G V = A or C or G W = A or T Y = C or T
Figura 22. Locais de reconhecimento das enzimas de restrição Xmn I e Hinc II.
Eletroforese em gel de agarose
Uma vez cortado o DNA em pequenos fragmentos, os fragmentos têm que ser separados e visualizados. Tal é efetuado por eletroforese em gel de agarose e coloração subsequente do DNA. Eletroforese significa
“transportando eletricidade”. O DNA possui carga negativa devido aos seus grupos fosfato acídicos. Assim, quando aplicada uma corrente elétrica ao DNA, este mover‐se‐á em direção ao elétrodo positivo.
Para a separação de fragmentos com base no seu peso molecular, a amostra de DNA deve ser aplicada num gel de agarose, um suporte matriz semi‐sólido. A agarose é uma forma purificada do agar, disponível em pó.
Quando misturada com um tampão e aquecida até ebulição, origina uma solução homogénea, que endurece e semi‐solidifica à temperatura ambiente. Durante a solidificação, são formados poros no gel de agarose através dos quais os fragmentos de DNA irão ser forçados a migrar quando sujeitos a um campo elétrico.
Quanto maior o fragmento de DNA, mais difícil e lenta será a sua migração através dos poros do gel.
Fragmentos pequenos de DNA irão migrar mais fácil e rapidamente. Existe uma relação inversa entre o tamanho do fragmento de DNA e a sua distância percorrida no gel de agarose. Fragmentos de DNA de tamanhos iguais irão migrar à mesma distância no gel. Fragmentos de DNA de tamanhos diferentes irão ser separados uns dos outros.
A alteração da concentração de agarose altera a capacidade resolvente do gel. Aumentando‐se a concentração de agarose, diminui‐se o tamanho dos poros; neste caso, fragmentos maiores surgirão pouco resolvidos uma vez que atravessam o gel com dificuldade. Os fragmentos pequenos também irão migrar mais lentamente, facto que torna possível a resolução de fragmentos pequenos de DNA com tamanhos idênticos. Diminuindo‐se a concentração de agarose, aumenta‐se a porosidade do gel; fragmentos pequenos de DNA migrarão rápida e uniformemente no gel, enquanto fragmentos maiores de DNA surgirão eficientemente resolvidos.
Uma vez terminada a eletroforese, tem que se tornar o DNA visível. O brometo de etídeo é o corante mais comummente usado. A molécula intercala‐se entre os pares de bases, como se de um novo par de bases se tratasse. Quando excitada com luz UV, a molécula emite luz visível e o DNA pode assim ser visualizado.
Contudo, foi demonstrado pelo teste de Ames que o brometo de etídeo é um agente mutagénico, pelo que é necessário extremo cuidado no seu manuseamento.
% Agarose no gel Tamanho dos fragmentos resolvidos
Exemplo(s)
0.5 1 000‐30 000 pb DNA genómico não digerido
0.8 800‐12 000 pb DNA genómico digerido
1.0 500‐10 000 pb DNA plasmídico
1.2 400‐7 000 pb DNA plasmídico
1.5 200‐3 000 pb Produtos de PCR e plasmídeos
2.0 100‐1 500 pb Produtos de PCR
Existem outros corantes de DNA não tóxicos. Estes incluem o azul de metileno, o Carolina Blu (Carolina Biological Supply) e o Biorad‐Safe (Bio‐Rad, Inc.). Estes corantes são seguros e não requerem excitação.
Contudo, não são tão sensíveis como o brometo de etídeo (o brometo de etídeo consegue detetar até 10 ng de DNA).
Após a eletroforese e coloração do gel, os fragmentos de DNA irão aparecer sob a forma de bandas no gel.
Cada banda contém milhares de moléculas de DNA, todas com o mesmo tamanho. A disposição das bandas forma um padrão que é por vezes designado de fingerprint.
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 41 de 43 PROTOCOLO
1. Distribua o DNA da cena do crime (do suspeito 1 e do suspeito 2) aos alunos.
2. Marque 9 tubos para as seguintes digestões com enzimas de restrição:
Reação Nº do tubo
DNA da cena do crime, digestão com Hinc II 1 DNA da cena do crime, digestão com Xmn I 2 DNA da cena do crime, digestão com Hinc II/Xmn I 3 DNA do suspeito 1, digestão com Hinc II 4 DNA do suspeito 1, digestão com Xmn I 5 DNA do suspeito 1, digestão com Hinc II/Xmn I 6 DNA do suspeito 2, digestão com Hinc II 7 DNA do suspeito 2, digestão com Xmn I 8 DNA do suspeito 2, digestão com Hinc II/Xmn I 9
3. Prepare as master mixes para as digestões com uma enzima de acordo com a seguinte tabela. Prepare uma master mix para 8 reações para compensar erros de pipetagem.
Componente Volume para cada reação Volume para 8 reações
Água ultra pura 16.3 μl 130.4 μl
Tampão B 10x 2.0 μl 16.0 μl
BSA acetilado 0.2 μl 1.6 μl
4. Para cada digestão com Hinc II (Tubos 1, 4 e 7), adicionar o seguinte:
Master mix para digestão com uma enzima 18.5 μl
DNA (1 μg/ml) 1.0 μl
Hinc II (12 U/μl) 0.5 μl
5. Para cada digestão com Xmn I (Tubos 2, 5 e 8), adicionar o seguinte:
Master mix para digestão com uma enzima 18.5 μl
DNA (1 μg/ml) 1.0 μl
Xmn I (10 U/μl) 0.5 μl
6. Prepare a master mix para as digestões com as duas enzimas de restrição (digestão dupla), de acordo com a tabela em baixo indicada. Prepare master mix suficiente para 5 digestões para compensar erros de pipetagem.
Componente Volume para cada reação Volume para 5 reações
Água ultra pura 15.8 μl 70.0 μl
Tampão B 10x 2.0 μl 10.0 μl
BSA acetilado 0.2 μl 1.0 μl
7. Para os três tubos com digestão dupla (Tubos 3, 6, 9), adicione o seguinte:
Master mix para digestão dupla 18.0 μl
DNA (1 μg/ml) 1.0 μl
Hinc II (12 U/μl) 0.5 μl
Xmn I (10 U/μl) 0.5 μl
8. Incube as digestões durante 2 horas a 37 oC.
9. Pare as reações (inativação das enzimas) colocando os tubos a 65 oC durante 15 minutos.
10. Prepare tampão de eletroforese TBE 1x
11. Prepare um gel de agarose 2% em TBE 1x (2 g de agarose e 100 ml de TBE 1x) com 2.5 µl de brometo de etídeo 20 µg/µl.
12. Coloque em cada poço 5 μl da reação de digestão e 1 μl de corante azul/laranja (sample buffer). Coloque no primeiro poço 5 μl do marcador de pesos moleculares (BenchTop pGEM® DNA Markers, Cat#.G7521).
13. Corra o gel durante a 80 mV (até o corante laranja atingir a frente do gel – este corante migra à mesma velocidade que um DNA de 50 pb).
14. Observe o gel no transiluminador e fotografe para registar os resultados.
DISCUSSÃO
1. Porque é que se incuba os tubos a 65 oC durante 15 minutos depois da incubação com as enzimas de restrição?
2. Qual é a base de separação dos fragmentos de DNA no gel de agarose?
3. Qual é a função do tampão de eletroforese? Poderia usar água como substituto?
4. Porque é que o brometo de etídeo é utilizado para corar o DNA?
5. Compare os resultados da sua turma com os evidenciados na figura seguinte.
5.1. Obteve os mesmos resultados? Caso não tenha obtido, o que poderá ter acontecido?
5.2. Têm ambos os suspeitos o mesmo padrão RFLP que a amostra do crime?
pGEM® DNA Markers. Load 5µl/lane
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 43 de 43 MATERIAL
Luvas
Canetas de acetato Gelo
Tinas de eletroforese e fonte Pipetas P20 e P200
Pontas com filtro Tubos de 1.5 ml Microcentrífuga Termociclador Agarose Erlenmeyer Sample buffer Transiluminador Banho a 37 oC Banho a 65 oC
Barquinhos para tubos de 15 ml Água bidestilada
Agarose TBE 1x
Brometo de etídeo Kit da Promega:
HincII restriction enzyme, 200u, 10u/ul, Cat#.R6031 XmnI restriction enzyme, 500u, 10u/ul, Cat#. R7271 Tampão B (para as enzimas de restrição)
BSA acetilado (vem com as enzimas) pGL4.11[luc2P] Vector, 20 ug, Cat#.E6661 pGL4.12[luc2CP] Vector, 20 ug, Cat#.E6671
BenchTop pGEM® DNA Markers, 250 ul, Cat#.G7521 Blue/Orange Loading Dye, 6X, 3 ml, Cat#. G1881
BIBLIOGRAFIA
• Scheppler, J. A., Cassin, P. E. and Gambier, R. M.. “Biotechnology Explorations: Applying the Fundamentals”. ASM Press, Washington D. C.