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CALENDÁRIO DAS AULAS/ÍNDICE
Aula Data Tema Teste Pág. Sala
1 14‐10‐2011
Construção de pedigrees para a capacidade de sentir o sabor da feniltiocarbamida (PTC) e cálculo das frequências
alélicas
2 BQII
2 21‐10‐2011 Equilíbrio de Hardy‐Weinberg e suas aplicações ‐ resolução
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3 28‐10‐2011 Resolução e discussão de exercícios sobre fundamentos de
genética com aplicação à Genética Forense
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14 C4 11‐11‐2011*
Isolamento de DNA genómico a partir de amostras biológicas de distinta natureza. Análise espetral da sua
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25 BQ I
5 25‐11‐2011
Amplificação de um locus dimórfico e de um locus polimórfico do tipo VNTR pela reação em cadeia da
polimerase (PCR)
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29
BQ I
6 02‐12‐2011 Eletroforese em gel de agarose e interpretação dos
resultados
BQ I
7 16‐12‐2011 Análise por PCR de um locus polimórfico do tipo STR na
investigação de uma cena de crime
"
37 BQ I8 06‐01‐2012 Análise de RFLP na investigação forense
39 BQ II 9 13‐01‐2012 Interpretação e discussão dos resultados da análise RFLP
"
BQ II*Nota esta aula foi antecipada uma semana (inicialmente estava no dia 18 Nov) devido à alteração da data de uma reunião onde a docente tem de estar presente.
CONTACTO DA DOCENTE [email protected]
Gabinete: Edifício I (Gabinete D), em frente à reprografia dos professores.
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 3 de 43 Aula prática nº 1
Construção de pedigrees para a capacidade de sentir o sabor da feniltiocarbamida (PTC) e cálculo das frequências alélicas
CONCEITOS CHAVE
• Alelos são formas alternativas de uma determinada posição no cromossoma (locus)
• Heredogramas ou pedigrees permitem exibir relações familiares e transmissão de traços genéticos
• Um alelo é dominante quando se manifesta em heterozigotia
• Um alelo é recessivo quando se manifesta em homozigotia
• Alelos codominantes são aqueles que são simultaneamente expressos
• A Genética de Populações estuda a frequência de alelos em grupos de organismos da mesma espécie que residem na mesma área geográfica.
• O equilíbrio de Hardy‐Weinberg ocorre quando as frequências de alelos se mantêm constantes numa população ao longo das gerações (verifica‐se quando existe acasalamento aleatório, a população é grande, não exista migração, mutação ou seleção natural)
OBJETIVOS
• Assimilar a nomenclatura utilizada na construção de heredogramas ou pedigrees
• Reconhecer que certas características são determinadas pelo genótipo (combinação de alelos) dos indivíduos
• Reconhecer a variação da expressão (fenótipo) de uma mesma característica entre indivíduos
• Identificar o padrão de transmissão de uma característica nas famílias
• Saber determinar frequências alélicas
INTRODUÇÃO Noções gerais
Apesar de pertencermos à mesma espécie, apresentamos uma gama de variações anatómicas, fisiológicas, bioquímicas e comportamentais, que faz com que cada indivíduo seja único. Esta individualidade é um aspeto garantido pela hereditariedade e reprodução sexuada, quando a fusão dos gâmetas parentais origina um novo ser com os pares dos cromossomas homólogos e respetivos pares alélicos responsáveis pela expressão dos caracteres geneticamente determinados.
Os geneticistas utilizam “árvores genealógicas” designadas heredogramas ou pedigrees para estabelecer a relação de fenótipos ou genótipos entre os familiares. Existe uma nomenclatura própria para a construção de pedigrees (Figura 1). Estes são muito úteis pois permitem determinar o modo de transmissão de traços ou doenças ao longo das gerações o que, por sua vez, permite calcular probabilidades dos descendentes de um casal herdarem um traço em particular. Existem diversos modos de hereditariedade, desde os mais simples determinados por apenas um gene – taços monogénicos (sejam autossómicos ou heterossómicos) ou por vários genes (poligénicos).
Figura 1. Nomenclatura utilizada na construção de heredogramas ou pedigrees
Símbolos
= Fêmea e macho normal
= Fêmea e macho que expressam o traço
= Fêmea e macho que possuem um alelo do traço mas não o manifestam (portador)
= Fêmea ou macho falecido
= Sexo não‐especificado
= Nado‐morto
= Aborto espontâneo
= Interrupção da gravidez (a tracejado se for um feto com anomalias)
Linhas
= Geração
= Acasalamento
= Adoção
= Irmãos
= Gémeos monozigóticos
= Gémeos dizigóticos
= Consanguinidade
= Relacionamento anterior
= Probando
Números
Numeração romana = gerações
Numeração árabe = indivíduos numa geração
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PROTOCOLO
1. Cada aluno voluntário deverá fazer o teste de sensibilidade à PTC, colocando a tira sobre a sua língua.
2. Anotar o resultado (sentiu ou não sentiu o sabor amargo) numa tabela (Tabela 1).
3. Oferecer água aos alunos para tirar o sabor amargo.
4. Propor a alguns alunos voluntários a realização de um levantamento sobre a sensibilidade à PTC aos membros da sua família (pais, avós, tios, irmãos, primos). Não há necessidade de ser a família do próprio aluno. Os dados sobre as relações de parentesco e sobre a sensibilidade devem ser anotados.
Observação: Os alunos antes de fazerem o teste a qualquer pessoa, devem avisá‐la de que pode sentir um gosto amargo, e ela deve estar de acordo em fazer o teste.
Esses alunos deverão trazer os resultados na 2ª aula para serem analisados e construídos os respetivos pedigrees das famílias que foram investigadas.
Tabela 1. Teste de sensibilidade à PTC
Aluno Turma Sensível Insensível
Total de sensíveis e insensíveis à PTC Total de alunos
DISCUSSÃO
1. Qual a frequência de indivíduos sensíveis e de indivíduos insensíveis à PTC na turma?
Observação: os fenótipos dominantes nem sempre são os mais frequentes na população, pois isso depende da frequência dos alelos recessivos e dominantes na população. Achar que o fenótipo dominante é o mais comum é um erro.
2. Construir os pedigrees das famílias cujo teste foi efectuado (aula nº2).
3. Analisar os heredogramas e indicar os possíveis genótipos de cada indivíduo.
4. Determinar o padrão de hereditariedade da sensibilidade à PTC, a partir dos heredogramas.
Observação: É possível que, ao analisar os heredogramas, alguns indivíduos não apresentem o fenótipo esperado. Isso poderá dever‐se a um possível erro durante a análise ou a uma mutação recente no indivíduo. O
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 7 de 43 importante é analisar‐se o conjunto dos heredogramas e determinar o padrão de hereditariedade mais provável para a sensibilidade à PTC.
MATERIAL
Tiras para o teste de sensibilidade à feniltiocarbamida (PTC) Água potável e copos descartáveis
BIBLIOGRAFIA
• Kim UK, Breslin PA, Reed D, Drayna D. (2004); Genetics of human taste perception. J Dent Res. 2004 Jun;83(6): 448‐453
• Kim UK, Jorgenson E, Coon H, Leppert M, Risch N, Drayna D (2003). Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide. Science 299:1221–1225
Aula prática nº2
Equilíbrio de Hardy‐Weinberg e suas aplicações ‐ resolução e discussão de problemas
CONCEITOS CHAVE
• A Genética de Populações estuda a frequência de alelos em grupos de organismos da mesma espécie que residem na mesma área geográfica
• O equilíbrio de Hardy‐Weinberg ocorre quando as frequências de alelos se mantêm constantes numa população ao longo das gerações (verifica‐se quando existe acasalamento aleatório, a população é grande, não exista migração, mutação ou seleção natural)
• Os polimorfismos de VNTR e STR são utilizados na elaboração de perfis de DNA
• O equilíbrio de Hardy‐Weinberg é utilizado para determinar a probabilidade do mesmo padrão de bandas ser encontrado nessa população
• Uma limitação do método é que as bases de dados podem não ser adequadamente representantes de populações reais
OBJETIVOS
• Identificar o padrão de transmissão da sensibilidade à PTC nas famílias
• Compreender as aplicações do equilíbrio de Hardy‐Weinberg na definição de perfis de DNA
• Compreender a importância da Genética de Populações nas Ciências Forenses
INTRODUÇÃO
Equilíbrio de Hardy‐Weinberg e suas aplicações
A Genética de Populações estuda o fenótipo e genótipo de um grande número de indivíduos. Quando a frequência dos alelos não se altera significativamente, dizemos que se trata de um estado de equilíbrio de Hardy‐Weinberg. Esta situação assenta em vários pressupostos:
1. Os acasalamentos são “ao acaso” (não haja consanguinidade)
2. A população é infinita (na prática, suficientemente grande para que os efeitos aleatórios e de amostragem sejam negligenciáveis)
3. Não exista migração
4. Não exista mutações novas que convertam um alelo no outro
5. Não exista seleção natural, ou seja os diferentes genótipos do locus não afetam a sobrevivência dos indivíduos da população
Numa população de organismos diploides com dois alelos autossómicos “A” e “a” para o locus A, os organismos apresentam os genótipos: AA, Aa, ou aa. Se a frequência do alelo “A” (ou de todos os alelos dominantes) for designada por “p” e a frequência do alelo “a” (ou de todos os alelos recessivos) for designada por “q”, então a expressão “p+q=1” simplesmente significa que todos os alelos dominantes e todos os alelos recessivos contêm todos os alelos para esse locus na população (Figura 4).
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 9 de 43 No equilíbrio de Hardy‐Weinberg, a relação matemática entre as frequências alélicas e as frequências genotípicas é dada por (Figura 4): AA=p2; Aa=2pq; Aa=q2
p + q = 1
Todos os alelos dominantes
Todos os alelos
recessivos
p2 + 2pq + q2 = 1
Homozigóticos dominantes
Heterozigóticos Homozigóticos recessivos
Nº de alelos e de genótipos totais para um locus numa população Figura 4. Equação de Equilíbrio de Hardy‐Weinberg
A Figura 5 ilustra as associações dos gâmetas a nível populacional que vão contribuir para o genótipo da geração seguinte.
Espermatozoides
p=A q=a
Óvulos p=A p x p = AA (p2) p x q = Aa (pq)
q=a p x q = Aa (pq) q x q = aa (q2)
Figura 5. Tabela de Punnett de um cruzamento de gâmetas do progenitor masculino e feminino da população
A frequência dos alelos numa população pode ser determinada a partir da frequência dos indivíduos homozigóticos recessivos (q2). Os valores de q e de p podem ser deduzidos a partir da equação de Equilíbrio de Hardy‐Weinberg, para prever a frequência de indivíduos portadores.
No caso de loci do cromossoma X, a frequência dum alelo recessivo é igual à frequência do traço nos machos (são hemizigóticos, não podem mascarar o alelo com outro selvagem).
O equilíbrio de Hardy‐Weinberg também se aplica a partes do genoma que não afetam o fenótipo, e que portanto não estão sujeitos a seleção natural. Polimorfismos do tipo STR (do inglês, Short Tandem Repeats, Figura 6) encontram‐se no genoma fora de regiões codificantes. O número de repetições varia de pessoa para pessoa, pelo que são muito úteis na identificação de indivíduos. Os indivíduos homozigóticos têm o mesmo número de cópias nos dois cromossomas homólogos (indivíduo 2 da Figura 6), enquanto que indivíduos heterozigóticos apresentam dois números de repetições diferentes (indivíduos 1 e 3 da Figura 6).
Os STR também são designados de microssatélites.
Um outro tipo de polimorfismo de repetições, designado VNTR (do inglês Variable Number Tandem Repeats) ou minissatélites, tipicamente consiste em repetições contíguas que apresentam um maior número de bases (entre 10‐80 bases, Figura 7).
Figura 6. O perfil de DNA deteta diferenças no número de repetições em determinado locus.
Figura 7. Características dos polimorfismos de repetições utilizados na construção de perfis de DNA
Os perfis de DNA ilustrados na Figura 6 podem ser detetados por técnicas de Genética Molecular, como o Southern blotting ou a reação em cadeia da polimerase (PCR), sobre as quais falaremos nas próximas aulas.
A estatística da Genética de Populações e o equilíbrio de Hardy‐Weinberg são utilizados para interpretar perfis de DNA em Genética Forense. A Figura 8 mostra um exemplo onde se multiplica a frequência de diferentes alelos presentes em diferentes loci.
Lembrar a Lei do Produto: “Quando dois ou mais eventos ocorrem independentemente mas em simultâneo, a probabilidade combinada de dois resultados é igual ao produto das suas probabilidades individuais”
Figura 8. Frequência cumulativa para seis alelos analisados numa amostra retirada da parede onde se encontrava um quadro roubado.
No caso da combinação de alelos ser muito rara na população donde o suspeito criminoso provém, e se essa combinação de alelos for encontrada quer no DNA do suspeito quer no local do crime (por exemplo, no corpo de uma vítima de violação sexual), a culpa do suspeito torna‐se altamente provável. A Figura 9 sumaria o procedimento habitual.
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 11 de 43 Figura 9. Resolução de um crime. Um homem foi encontrado brutalmente assassinado, com pedaços de pele e de sangue sob uma unha. Estas amostras biológicas foram transportadas para um laboratório de Genética Forense, onde foram feitos estudos genéticos. O padrão de bandas obtidas a partir da análise do DNA das amostras biológicas coincidia com o padrão de bandas obtido com a análise efetuada a partir de DNA extraído do sangue do suspeito. Porém, esta análise visual não é suficiente. É necessário calcular a probabilidade deste DNA coincidir com o DNA extraído da amostra de sangue e pele que foi encontrada sob a unha da vítima. Para o efeito, utilizam‐se os valores das frequências alélicas do grupo étnico do suspeito para, de acordo com o equilíbrio de Hardy‐Weinberg, calcular a probabilidade de que qualquer outra pessoa dessa população ter esse mesmo padrão de bandas.
Conclusão: A probabilidade de que outra pessoa da mesma população donde provém o suspeito tenha o mesmo padrão destes alelos 3226.
É importante lembrar que se a análise dos perfis de DNA se basear em dados de grandes populações como a Caucasiana, Negra ou Hispânica, poderemos estar a cometer erros significativos. Polacos, gregos ou suecos
são todos considerados caucasianos, mas a frequência dos alelos poderá ser diferente nos três países. De modo semelhante, um negro da Jamaica ou da Somália, um hispânico de Cuba ou da Argentina têm backgrounds genéticos diferentes. Por fim, os estudos efetuados recentemente revelaram que existem mais homozigóticos recessivos para certos genes polimórficos do que era suspeitável, confirmando que as frequências alélicas não estão em equilíbrio.
EXERCÍCIOS
1. O que é uma população? Indique três exemplos de populações.
2. Explique a diferença entre frequência alélica, frequência fenotípica e frequência genotípica.
3. O que significa o equilíbrio de Hardy‐Weinberg?
4. Porque é que o equilíbrio de Hardy‐Weinberg é mais uma situação teórica do que uma situação real para genes que afetam o fenótipo?
5. Em que condições o equilíbrio de Hardy‐Weinberg não se verifica?
6. Porquê é importante ter bases de dados de populações específicas para interpretar correctamente os perfis de DNA?
7. Porquê que é que os cientistas forenses que usam perfis de DNA devem ter um cuidado especial nas suas análises quando a vítima e o suspeito são da mesma família?
8. A capacidade de sentir a feniltiocarbamida (PTC) é determinada geneticamente. As letras T e t são utilizadas para designar, de modo simplificado, os alelos “sensível à PTC” e “insensível à PTC”, respetivamente. Num grupo de 200 estudantes de genética 85 estudantes não conseguiam sentir a PTC.
Determine a frequência alélica T e t e a frequência de cada um dos genótipos possíveis, assumindo o equilíbrio de Hardy‐Weinberg.
9. Num crime que ocorreu em Israel, um homem agrediu uma senhora com um bloco de cimento até ela ter ficado inconsciente e violou‐a de seguida. Teve o cuidado de não deixar cabelos no local do crime. No entanto, deixou ficar os óculos que tinham uma moldura especial, o que permitiu à polícia encontrá‐lo, com a ajuda do optometrista. O homem também deixou, no local do crime, meio “chupa‐chupa” por comer. O DNA retirado do suspeito coincidiu com o DNA recuperado de amostras das células de revestimento da bochecha que tinham ficado no pau do “chupa‐chupa”, em quatro loci de polimorfismos de repetições de cromossomas diferentes. As frequências dos alelos do grupo étnico do suspeito estão apresentados ao lado do perfil de DNA.
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Aula Prática nº3
Resolução e discussão de exercícios sobre fundamentos de genética com aplicação à Genética Forense
CONCEITOS CHAVE
• Existem vários tipos de polimorfismo, nomeadamente polimorfismos de repetição (VNTR, STR), RFLP (do inglês Restriction Fragment Lenght Polymorphism) ou SNP (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism)
• Existem várias técnicas moleculares que permitem determinar os alelos dos polimorfismos: técnicas baseadas na hibridação de ácidos nucleicos, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciação
• Exemplos de técnicas de hibridação são o Southern Blotting, Dot‐Blot com sondas ASO (do inglês, Allele Specific Oligonucleotyde), microarrays
• O Southern blotting é o processo de transferência e imobilização de DNA numa membrana (normalmente depois de digerir com enzimas de restrição e eletroforese). O objetivo desta mobilização na membrana é a subsequente incubação desta com uma sonda de DNA marcada e desnaturada que se ligua especificamente a uma determinada sequência complementar
• As sondas utilizadas no Southern Blotting podem, por exemplo, ser específicas para um cromossoma, ou específicas para detetar um polimorfismo de RFLP, um polimorfismo do tipo STR ou VNTR
• O Southern Blotting requer moléculas de DNA longas e relativamente intactas, assim como quantidades elevadas de DNA (aproximadamente 10 a 20 μg, para identificar uma região de cópia única do genoma humano
• A PCR é uma técnica muito sensível que permite replicar, exponencialmente, um pequeno fragmento de DNA
• A sequenciação permite determinar a sequência de nucleótidos de uma molécula de DNA
OBJETIVOS
• Compreender e descrever os principais tipos de polimorfismos existentes no genoma humano
• Compreender e descrever as principais técnicas utilizadas na deteção de polimorfismos
• Ser capaz de interpretar os resultados obtidos pelas técnicas de Genética Molecular
• Conhecer as principais aplicações das técnicas de Genética Molecular, nomeadamente em Genética Forense
INTRODUÇÃO
Tipos de polimorfismos:
Uma variação na sequência de DNA é considerada polimorfismo quando existe em pelo menos 1% da população. Pode ocorrer num gene ou em regiões intergénicas e a maioria dos polimorfismos são considerados variações normais na população. Vamos falar de três tipos vulgarmente utilizados: a) polimorfismos de repetição como por exemplo VNTR ou minissatélite e STR microssatélite (ver aula nº2);
polimorfismos do tipo SNP que surgem na sequência numa mutação pontual numa das bases do DNA (Figura 10) e RFLP (do inglês, Restriction Fragment Lenght Polymorphism, Figura 11) são polimorfismos de tamanho nos fragmentos de DNA gerados após clivagem com enzimas de restrição. Os SNP podem ser detetados por numerosas técnicas que não serão objeto de estudo nestas aulas práticas (revisto em Sobrino et al. 2005), que vão desde técnicas baseadas na hibridação de sondas, baseadas na PCR ou na sequenciação (ver em baixo).Os polimorfismos do tipo RFLP tipicamente detetados por sondas de DNA de cópia única, resultam normalmente de substituições de bases que criam ou eliminam locais de reconhecimento de enzimas de restrição. A maioria destes polimorfismos são dimórficos (presença ou ausência de um local de restrição) tornando estes polimorfismos pouco úteis em Genética Forense. Porém, é de salientar que alguns autores designam por RFLP polimorfismos minissatélite ou microssatélite, quando estes são detetados após clivagem do DNA com enzimas de restrição (Figura 12).
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 15 de 43
Figura 10. SNP [http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/snp/index.htm]
Figura 11. RFLP. A figura ilustra uma região de DNA com três locais de corte para a enzima de restrição BamHI na molécula I e apenas dois locais de corte na molécula II. Nesta, devido a uma mutação de uma A para uma G, elimina um local de reconhecimento para esta enzima. Este polimorfismo foi detetado por Southern blotting. [The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Cooper GM.]
Das técnicas moleculares que permitem determinar os polimorfismos iremos apenas abordar o Southern Blotting, seguidamente da reação em cadeia da polimerase (PCR) e finalmente da sequenciação.
A técnica de Southern blotting consiste num processo de transferência e imobilização de DNA numa membrana (normalmente depois de digerir com enzimas de restrição e eletroforese (Figura 13). O objetivo desta mobilização na membrana é a subsequente incubação desta com uma sonda de DNA marcada e desnaturada que se ligue especificamente a uma determinada sequência complementar. A Figura 13 ilustra como esta técnica pode ser utilizada para detetar polimorfismos de repetição (nomeadamente os STR) que são flanqueados por locais de corte com enzimas de restrição. Assim, após clivagem do DNA com as enzimas de restrição, são obtidos fragmentos de DNA de tamanhos diferentes (pelo que por vezes estes polimorfismos também são designados de RFLP), que são identificados utilizando sondas específicas, gerando um fingerprint de DNA.
Figura 12. Análise de polimorfismos de repetição por Southern blotting. As setas indicam locais de corte de enzimas de restrição, pelo que por vezes também são designados polimorfismos RFLP.
[http://www.mun.ca/biology/scarr/VNTR_fingerprinting_for_parentage.html]
A reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a replicação in vitro de uma sequência específica de DNA a partir de um conjunto heterogéneo de moléculas de DNA. Esta técnica requer alguma informação acerca da sequência nucleotídica do DNA‐alvo uma vez que essa informação é usada na síntese de dois primers ou oligonucleotídicos iniciadores. Os primers são complementares a sequências localizadas em cadeias opostas e flanqueiam a região que se pretende amplificar. Os principais “passos” de cada ciclo duma reação de PCR são: 1) desnaturação das cadeias molde; 2) emparelhamento dos primers; e 3) extensão das novas cadeias pela DNA polimerase (Taq DNA polimerase termorresistente). Geralmente efetuam‐se cerca de 30 ciclos. Em cada ciclo verifica‐se a duplicação das cadeias e no final, para n ciclos obtermos 2n cópias (por cada molécula de DNA molde). Após os primeiros ciclos, o produto de tamanho fixo esperado começa a predominar.
Algumas vantagens desta técnica são: 1) rapidez (algumas horas); 2) elevada sensibilidade (amplifica DNA de uma célula); 3) elevada robustez (podem ser usadas amostras de DNA contaminadas com outros materiais ou DNA parcialmente degradado). Das limitações ou desvantagens importa destacar: 1) a necessidade de alguma informação acerca da sequência nucleotídica do DNA‐alvo que permita desenhar os primers; 2) pequeno tamanho dos produtos amplificados (0‐5 Kb); 3) facilidade de contaminação e 4) infidelidade de replicação (a Taq DNA polimerase incorpora bases erradas). A Figura 14 ilustra os passos essenciais de uma PCR. A Figura 15 ilustra a deteção de STR por PCR.
Genéttica Aplicadaa ‐ Licenciatura em Ciênciias Forenses
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Figura 14. PCR [http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/pcr.html]
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4.1. O que pode concluir?
a) Nenhum dos descendentes é legítimo.
b) Os descendentes B e C não são produto destes progenitores, e foram, provavelmente adquiridos no mercado negro. Os dados relativos ao descendente A são plausíveis, indicando este como legítimo.
c) A descendência A e B é produto dos progenitores declarados, mas C não é, e foi provavelmente comprado no mercado negro.
d) Não existem dados suficientes para tirar conclusão alguma. Deveriam ser examinadas posições polimórficas adicionais.
e) Não é possível tirar conclusões, uma vez que se utilizaram primers “humanos”.
4.2. Descreva a técnica de PCR
5. Considere a seguinte análise de fingerprinting de DNA (as setas indicam locais de reconhecimento de enzimas de restrição).
5.1. Descreva a técnica laboratorial utilizada nesta análise.
5.2. Identifique cada banda do fingerprinting de DNA com os alelos dos loci analisados.
5.3. Os indivíduos A e C são ambos suspeitos de serem o pai do indivíduo B. Com base nesta análise qual deverá ser o pai?
4.4. Depois de identificar o pai, reconstrua parte do fingerprint da mãe.
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 23 de 43 6. Imagine que tem um casal genotipado para um determinado microssatélite, onde o genótipo do pai é 12/15 e o genótipo da mãe 11/16. Dado os genótipos dos pais quais os genótipos possíveis para um filho deste casal?
7. O mesmo casal foi genotipado para outros dois microssatélites e os genótipos do pai foram A15/A15, B13/B12 e os genótipos da mãe foram A11/A12 e B14/B14. Assumindo que estes loci segreguem independentemente qual seriam os possíveis genótipos dos filhos?
8. Numa floresta foi encontrado um grupo de corpos queimados. A polícia suspeita que eles possam incluir a família de Jones desaparecida (os pais e duas crianças). Foi extraído o DNA de ossos e examinaram por PCR dois loci polimórficos de repetições contíguas, A e B. Os resultados encontram‐se na seguinte tabela, onde o número de cópias das repetições contíguas indicam os alelos: por exemplo, o homem 1 tem um alelo com 8 repetições e outro com nove repetições no locus A.
Locus A Locus B Homem 1 8/9 5/7 Homem 2 6/8 5/5 Homem 3 7/10 7/7 Mulher 8/8 3/5 Criança 1 7/8 5/7 Criança 2 8/8 3/7
8.1. A mulher poderia ser a mãe de ambas as crianças? Justifique.
8.2. Qual homem, se algum, poderia ser o pai da criança 1?
9. A figura seguinte representa o resultado obtido numa eletroforese de sequenciação automática de ADN.
Faça a leitura da sequência sabendo que os fluorocromos verde, vermelho, preto e azul representam, respetivamente, as bases A, T, G e C.
Verde; Preto; Vermelho; Azul
BIBLIOGRAFIA
Sobrino B, Brión M, Carracedo A (2005) SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies.
Forensic Science International;154(2‐3):181‐94.
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Página 25 de 43 Aula Prática nº4
Isolamento de DNA genómico a partir de amostras biológicas de distinta natureza
CONCEITOS CHAVE
• O DNA genómico está localizado no núcleo das células eucarióticas, associado a histonas e organizado em cromossomas.
• A espectroscopia ultravioleta (UV) pode ser usada na análise da concentração e pureza do DNA
• O grau de pureza de uma amostra de DNA pode ser determinado pela razão das absorvâncias A260/A280.
• A integridade do DNA isolado e o grau de contaminação de RNA pode ser analisado num gel de agarose.
OBJETIVOS
• Compreender o processo de isolamento de DNA genómico a partir de distintas amostras biológicas
• Ser capaz de determinar a concentração e pureza e integridade do DNA isolado
INTRODUÇÃO
Isolamento de DNA genómico
Nas células eucarióticas, o DNA genómico localiza‐se no núcleo sob a forma de desoxirribonucleoproteínas e pode ser isolado por extração destas. Os métodos utilizados no isolamento de DNA genómico variam de acordo com a natureza do material biológico.
O isolamento de DNA envolve: a rutura das células na presença de SDS, a adição de proteinase K, uma protease com elevada atividade proteolítica, e a adição de um inibidor de DNases, o EDTA (o EDTA é um agente quelante que retarda a atividade de nucleases por remoção de iões divalentes necessários à sua atividade). Em seguida, a solução de DNA é desproteínada por extração com fenol e posteriormente fenol:clorofórmio, ambos agentes desnaturantes das proteínas. As proteínas desnaturadas formam uma camada na interface fase aquosa/fase orgânica, permanecendo o DNA na fase aquosa sob a forma de sal sódico. A toxicidade do fenol faz com que a extração fenólica seja em alguns casos substituída por uma extração salina que se baseia na separação das proteínas por desidratação e salting‐out com uma solução saturada de NaCl. Depois de isolado, o DNA é precipitado por etanol ou isopropanol, o que permite a sua concentração e remoção de fenol e clorofórmio residuais ou a alteração das concentrações salinas em que se encontra. Na presença de concentrações relativamente altas (0.1M a 0.5M) de catiões monovalentes, o etanol induz uma transição estrutural nas moléculas de ácidos nucleicos que faz com que elas se agreguem e precipitem sob a forma de longas fibras. Como a maior parte dos sais e pequenas moléculas são solúveis em etanol 70%, a lavagem do DNA precipitado com este etanol permite um melhor isolamento de DNA.
A precipitação de soluções pouco concentradas requer o arrefecimento da solução para permitir uma boa recuperação. A precipitação de ácidos nucleicos a altas concentrações é normalmente bastante rápida à temperatura ambiente. A formação de um precipitado visível após adição de álcool e agitação indicam a precipitação completa, não sendo necessário o arrefecimento da solução.
Caracterização espetral de DNA
O DNA isolado pode ser caracterizado pelo seu espetro de absorção no ultra‐violeta. A absorção a comprimentos de onda de 250‐290 nm é devida aos sistemas de ligações duplas conjugadas existentes nas bases púricas e pirimidínicas, observando‐se uma absorção máxima a 260 nm. A este comprimento de onda, uma unidade de densidade ótica corresponde a DNA de cadeia dupla a uma concentração de 50 μg/ml.
O grau de pureza (relativamente a contaminação proteica) de uma solução de DNA pode ser avaliado pela razão das absorvâncias a 260 e 280 nm. Para o DNA puro esta razão deverá ser superior a 1.8; razões inferiores a esta indicam contaminação com uma quantidade significativa de proteínas (e/ou fenol). A eletroforese em gel de agarose permite ver o estado de integridade do DNA e avaliar a presença de RNA na nossa amostra.
PROTOCOLOS
PARTE A. ISOLAMENTO DE DNA GENÓMICO
Protocolo 1. Isolamento de DNA genómico a partir de 1 ml de fuidos corporais (Citogene – Citomed) 1. Adicionar 1 ml de fluido corporal (sangue total, saliva, etc) a um tubo contendo 5 ml de Cell Lysis.
2. Ressuspender várias vezes com a pipeta para lisar as células.
3. Aquecer a 65 oC durante 15 minutos para completar a lise.
Em alternativa, para obter máximo rendimentos, pode adicionar 30 μl de proteinase K (20 mg/ml) e incubar o lisado a 55 oC durante 1 hora ou durante a noite.
Tratamento opcional com RNase:
(caso não se opte pelo tratamento com RNase, seguir para o passo 8) 4. Adicionar 30 μl de solução de RNase ao lisado celular.
5. Misturar a amostra, invertendo o tubo 25 vezes e incubando a 37 oC durante 15‐60 minutos.
6. Arrefecer a amostra à temperatura ambiente.
7. Adicionar 2 ml de solução de Protein Precipitation ao lisado celular.
8. Agitar no vórtex a velocidade elevada durante 20 segundos, para misturar uniformemente a solução Protein Precipitation com o lisado celular.
9. Colocar a amostra em gelo durante 5‐15 minutos.
10. Centrifugar durante 10 minutos a 2.000g, para formar um pellet castanho de proteínas.
11. Pipetar o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo de 15 ml, contendo 6 ml de isopropanol a 100%, tendo o cuidado de deixar ficar para trás o pellet castanho de proteínas.
Caso a amostra contenha um elevado teor de lípidos ou outras partículas que se acumulem no topo do líquido, transferir o sobrenadante usando uma pipeta, por forma a que as partículas não sejam transferidas. Se o rendimento de DNA esperado for baixo (<20 μg), adicionar glicogénio (10 μl de solução de glicogénio a 20 mg/ml, por cada 6 ml de isopropanol).
12. Misturar a amostra invertendo cuidadosamente 50 vezes e manter o tubo à temperatura ambiente pelo menos 15 minutos.
13. Centrifugar 10 minutos a 2.000g. Dependendo do rendimento, o DNA poderá ou não ficar visível sob a forma de um pequeno pellet branco.
14. Deitar fora o sobrenadante e escorrer com cuidado o tubo para papel absorvente. Adicionar 6 ml de etanol a 70% e inverter o tubo várias vezes para lavar o pellet de DNA.
15. Centrifugar 1 minuto a 2.000g. Deitar fora o etanol com cuidado, pois o pellet pode ficar solto.
16. Inverter e escorrer o tubo em papel absorvente e deixar secar ao ar durante 10‐15 minutos.
17. Adicionar 100 μl de DNA Hydratation e levar ao vórtex 5 segundos, para obter uma concentração aproximadamente de 200 μg/ml, para um rendimento aproximado de 20 μg de DNA.
18. Incubar as amostras a 65 oC durante uma hora ou durante a noite á temperatura ambiente.
19. Para guardar, poderá ser necessária uma breve centrifugação seguida de transferência para um tubo de 1.5 ml.
20. Guardar o DNA a 4 oC. Para guardar durante longos períodos, guardar a – 20 oC ou a ‐ 80 oC.
Protocolo 2. Isolamento de DNA de cabelo
1. Pipetar 100 μl de PCR H buffer num eppendorf (PCR H Buffer é o tampão de PCR 1x concentrado contendo 0.5% do detergente Tween‐20) – ver aula nº 5). (Nota: o detergente Tween‐20 é usado para ajudar a lisar as células e desnaturar as proteínas)
2. Adicionar 2.5 μl de proteinase K a 10 mg/ml. (Nota: a proteinase K também degrada as proteínas)
Genética Aplicada ‐ Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais – 2011/2012
Página 27 de 43 3. Remover dois ou três cabelos, pestanas ou pelos e certificar‐se de que se encontram completos, isto é, de que foi removida a raiz.
4. Colocar os cabelos ou pelos no eppendorf que contém o tampão de PCR com proteinase K.
5. Inverter o eppendorf várias vezes.
6. Incubar o eppendorf a 56 oC durante 1 hora. (Nota: a proteinase K funciona melhor a 56 oC)
7. Ferver o tubo durante 10 minutos a 95 oC (fazer um furo na tampa do eppendorf). (Nota: A incubação a 95 oC inativa a proteinase K, que poderia desnaturar a Taq DNA polimerase presente na mistura de PCR)
8. Deixar arrefecer até à temperatura ambiente.
9. Usar diretamente 25 μl do extrato de DNA para análise de PCR ou guardar o DNA a 4 oC. Para guardar durante longos períodos, guardar a – 20 oC ou a ‐ 80 oC.
PARTE B. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E DO GRAU DE PUREZA DE UMA AMOSTRA DE DNA
1. Medir a absorvância a 260 e 280 nm no Nanodrop. Determinar a concentração da solução de DNA obtida e a razão das absorvâncias a 260 e 280 nm. (DNA puro deverá ter uma razão A260/A280 de aproximadamente 1.8‐2.0)
2. Avaliar a integridade do DNA num gel: preparar um gel de agarose 1% agarose (em TAE 1x, preparado com água desionizada: 0.5 g agarose + 50 ml TAE 1x + 1.25 µl Brometo de etídeo 20 µg/µl); aplicar 200 ng em sample buffer/poço. Correr a 100 V (incluir MWM) durante 15 minutos.
3. Fotografar no transiluminador.
DISCUSSÃO
1. Refira duas formas possíveis de desproteinação das soluções de DNA. Qual a vantagem de uma em relação à outra?
2. Explique como é feita a precipitação do DNA e em que se baseia o princípio do método.
3. Discuta acerca da pureza e integridade da amostra de DNA genómico obtida.
MATERIAL
Kit de purificação de DNA genómico (Citogene, Citomed) 100% Isopropanol (2‐propanol)
70% Etanol
PCR H Buffer (Tampão PCR 1x contendo 0.5% do detergente Tween‐20) Proteinase K 10 mg/ml
Canetas de acetato
Tubos de 1.5 ml e de 15 ml Micropipetas e pontas Vórtex
Centrífuga para tubos de 15 ml Microcentrífuga para tubos de 1.5 ml Banho termostatizado a 37 oC Banho termostatizado a 65 oC Barquinhos para tubos de 15 ml Papel absorvente
Luvas Cronómetro Gelo
BIBLIOGRAFIA
• Scheppler, J. A., Cassin, P. E. and Gambier, R. M.. “Biotechnology Explorations: Applying the Fundamentals”. ASM Press, Washington D. C.
• Sobrino et al. 2005. SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies. Forensic Science International; 154(2‐3):181‐194.
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Página 29 de 43 Aulas práticas nº 5 e 6
AMPLIFICAÇÃO DE UM LOCUS DIMÓRFICO E DE UM LOCUS POLIMÓRFICO PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
CONCEITOS CHAVE
• A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica muito poderosa que permite a obtenção de biliões de cópias de pequenos segmentos de DNA
• A PCR pode ser efetuada com sucesso a partir de quantidades mínimas de DNA
• A tecnologia de PCR pode ser usada no diagnóstico de doenças, deteção de mutações génicas, e identificação de indivíduos
OBJETIVOS
• Identificar os principais passos e componentes da PCR
• Compreender os polimorfismos do DNA (dimórficos e VNTR ou minissatélites)
• Discutir os loci TPA‐25 e D1S80 e a sua utilidade nos estudos de DNA humano
• Discutir o uso de primers na PCR
• Compreender as aplicações da PCR na Biologia, Medicina e Ciências Forenses
INTRODUÇÃO
Em meados dos anos 80, Kary Mullis desenvolveu uma técnica elegante e poderosa para gerar milhões de cópias de uma sequência específica de DNA. O termo “amplificação” é usado porque os cientistas podem partir de uma quantidade de DNA que é indetetável pelos métodos convencionais. O processo de PCR produz DNA‐alvo em quantidades suficientes que podem ser detetadas por eletroforese em gel de agarose.
Atualmente, a PCR permite a amplificação eficiente de fragmentos de DNA de 2‐3 kb ou menos, mas a tecnologia está a ser melhorada de forma a permitir a amplificação eficiente de fragmentos maiores.
A PCR é semelhante a uma fotocopiadora: parte‐se de um original (a sequência de DNA desejada), usa‐se o aparelho apropriado (o termociclador) e os reagentes apropriados (a polimerase de DNA, nucleótidos trifosfatados e primers ou oligonucleótidos), e obtêm‐se milhares de sequências idênticas, tal como uma fotocopiadora reproduz um documento original.
Os primers são componentes críticos de uma PCR, determinando a especificidade para a região desejada.
São selecionados dois oligonucleotídeos flanqueadores da sequência de DNA de interesse. Um primer é uma pequena sequência de cadeia simples de DNA (oligonucleotídeo) capaz de se ligar a uma região de DNA adjacente à sequência alvo desejada. São usados dois primers diferentes: um liga‐se a uma das cadeias na extremidade 5’ do DNA‐alvo e outro liga‐se à cadeia complementar na região 3’ do DNA‐ alvo (Figuras 14 e 17). Os primers isolam a região específica do DNA que se pretende amplificar. Cada primer funciona ligando‐
se especificamente ao segmento que lhe é complementar no DNA‐alvo. Uma vez ligados às extremidades respetivas do DNA‐alvo, a enzima DNA polimerase copia o molde de DNA‐alvo usando os primers emparelhados como iniciadores. Deste modo, ambas as cadeias do DNA‐alvo são replicadas.
O DNA molde pode ser obtido a partir de muitas fontes tais como células da mucosa bocal, cabelos ou pelos, unhas ou sangue. Algumas células ou pequenas amostras de tecido são suficientes para fornecer o DNA necessário para a reação. O DNA pode até estar parcialmente degradado, como é o caso do DNA recolhido numa cena de crime ou num registo arqueológico.
Numa reação de PCR é necessário incluir‐se os quatro nucleótidos trifosfatos: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). Estes são a matéria‐prima para a síntese de DNA.
É necessário também um tampão para fornecer o meio apropriado para o funcionamento da DNA polimerase. O tampão mantém o pH e fornece a concentração correta de magnésio sem o qual a enzima não funciona. A variação das concentrações do magnésio afeta a eficiência do PCR.
A PCR requer a DNA polimerase. Esta enzima replica o DNA‐alvo ao catalisar a reação entre o grupo 5’
fosfato de um nucleótido e o grupo 3’ hidroxilo do último nucleótido da cadeia nascente. A Taq DNA polimerase isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus que habita em fontes vulcânicas, não é tão sensível à desnaturação a altas temperaturas como as DNA polimerases de outros organismos. A estabilidade térmica da Taq DNA polimerase permitiu a automatização do PCR, uma vez que resiste às sucessivas oscilações de temperaturas de uma PCR.
A oscilação de temperatura é essencial na PCR. Após o DNA molde e todos os reagentes terem sido misturados, tem início o processo cíclico da PCR. Existem 3 passos em cada ciclo de PCR: desnaturação, emparelhamento e extensão (Figura 17), cada um dos quais requerendo uma temperatura específica.
A desnaturação é o primeiro passo e consiste no aquecimento da mistura de reação a 94 oC. Este passo rompe as ligações de hidrogénio que mantêm as duas cadeias de DNA unidas. Deste modo, após desnaturação, o DNA molde passa a consistir em duas cadeias simples de DNA.
O emparelhamento (annealing) é o segundo passo de um ciclo de PCR. A temperatura baixa para que os primers possam estabelecer pontes de hidrogénio com as bases complementares da cadeia do DNA molde.
São geralmente usadas temperaturas entre 45 oC e 72 oC. A temperatura de emparelhamento é crítica. É determinada pelo tamanho e composição dos primers, e portanto, pelo número de ligações de hidrogénio que podem estabelecer. Se for usada uma temperatura de emparelhamento mais elevada do que a calculada como ideal para os primers usados, obtém‐se uma restringência muito elevada. A diminuição de restringência, ou seja, a diminuição de temperatura, permite o emparelhamento menos específico dos primers (com alguns erros) de tal modo que pode ser isolado um gene homólogo e não idêntico.
A extensão completa o ciclo de PCR. A temperatura é aumentada até 72 oC, temperatura que é insuficiente para desnaturar os emparelhamentos específicos dos primers às sequências complementares, mas suficiente para desnaturar moléculas de primer emparelhadas incorretamente. A Taq DNA polimerase catalisa então a adição de nucleótidos às extremidades 3’‐OH dos primers, fazendo a síntese de duas novas cadeias complementares às cadeias molde.
Fica assim completado um ciclo de PCR que originou duas cópias do DNA desejado. Uma vez sintetizada no primeiro ciclo de PCR, uma nova cadeia de DNA serve de molde nos ciclos seguintes. Após cada ciclo de desnaturação, emparelhamento e extensão, o nº de moléculas do DNA desejado duplica. Por exemplo, após dois ciclos resultam 4 moléculas de DNA; após 4 ciclos, 16 moléculas de DNA; e após um PCR típico de 30 ciclos, 1 bilião de cópias do DNA desejado.
A PCR revolucionou todas as áreas científicas. As aplicações incluem análise forense, diagnóstico, sequenciação, mutagénese, clonagem e isolamento de genes.
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Página 31 de 43 Figura 17. A PCR
A PCR é particularmente útil quando existe muito pouco DNA disponível. O DNA de uma pequena gota de sangue pode ser amplificado e usado para incriminar ou exonerar um suspeito numa investigação. O DNA de fósseis pode ser amplificado, e comparado com o DNA de organismos vivos para determinação de relações evolutivas. A PCR pode ser usada para identificar o vírus da sida e outros vírus, e para detetar doenças genéticas como a anemia falciforme.
A PCR é comummente usada em genética forense devido a duas importantes características. Primeiro, é necessária apenas uma cópia de uma região de DNA para se iniciar a amplificação. O processo de PCR amplifica o DNA logaritmicamente. Uma cópia de DNA, amplificada ao longo de 30 ciclos de PCR, origina cerca de 1 bilião de cópias dessa região. Deste modo, podem ser analisadas pequenas amostras de sangue, sémen, cabelo ou DNA proveniente de outras fontes. A segunda característica vantajosa do PCR é a de que não exige a integridade do DNA. Não interessa que o DNA se encontre parcialmente degradado ou contaminado com outros bioquímicos. A PCR ignora tudo exceto a sequência de DNA desejada. O DNA de uma cena de crime, parcialmente degradado por exposição a elementos, ou o DNA de cadáveres, podem ainda ser amplificados.
A PCR é muito útil no diagnóstico de doenças infeciosas, especialmente aquelas provocadas por vírus. As infeções víricas são, regra geral, difíceis de diagnosticar devido à complexidade do crescimento e da cultura de vírus em laboratório. O teste para anticorpos é limitado: são necessárias duas amostras de soro, uma amostra recolhida no pico da doença e uma amostra recolhida no estado convalescente do paciente; o diagnóstico conclusivo para anticorpos requer que haja uma alteração do título de anticorpos nas duas
