Material e métodos

A digestibilidade de quatro ingredientes ricos em amido (Tabela 1) foi analisada para o jundiá e a tilápia-do-Nilo em um delineamento em blocos casualizados (três repetições no tempo) em esquema fatorial. Tabela 1

Composição das fontes de carboidratos (base seca) e área superficial específica dos grânulos de amido.

Composição (g kg-1) Farelo de trigo Farelo de mandioca Milho moído Quirera de arroz Matéria seca 900,8 891,4 887,7 891,5 Proteína bruta 133,3 nd1 52,0 88,2 Extrato etéreo 48,4 6,5 38,9 15,6 Energia bruta2 17,7 17,2 18,7 17,5 Matéria mineral 81,3 20,7 14,3 6,4 Fibra alimentar3 469,6 453,5 112,3 19,8 Amido4 254,3 489,1 601,0 782,7 Amilose (%) 265 166 285 205 Área superficial específica de grânulos de amido (10-3 cm2 g-1)7 3,3 2,9 2,9 8,3 1

Não detectado. 2 kJ g-1. 3 Método enzimático-gravimétrico. 4 McCleary et al. (1997). 5 International Starch Institute (2012) e Sagum et al. (2000). 6 Schmitz et al. (2006). 7 Tatsumi et al. (2007).

As dietas experimentais continham 695 g kg-1 da dieta referência (Tabela 2), 300 g kg-1 do ingrediente teste e 5 g kg-1 de óxido de crômio (Cho e Slinger, 1979). A formulação da dieta referência, preparada com ingredientes semipurificados à base de albumina e dextrina, visou atender à espécie de maior exigência, o jundiá, baseando-se em suas exigências proteicas, energéticas e de lisina (Meyer e Fracalossi, 2004; Montes-Girao e Fracalossi, 2006) e naquelas do bagre do canal,

Ictalurus punctatus, para os demais nutrientes (Webster e Lim, 2002) (Tabela 2).

Tabela 2

Formulação e composição proximal da dieta referência.

Ingredientes Quantidade (g kg-1, base seca) Albumina1 455,1 Dextrina2 300,0 Celulose microfina2 99,9 Premix vitamínico-micromineral3 30,0 Premix macromineral4 55,0 Óleo de soja 30,0

Óleo de fígado de bacalhau5 30,0

Composição proximal6 Matéria seca 935,4 Proteína bruta 385,5 Extrato etéreo 60,6 Energia bruta7 19,1 Matéria mineral 96,7 Fibra alimentar 8 99,4 1

Izumi Indústria e Comércio Ltda. (Guapirama, PR, Brasil). 2 Rhoster Indústria e Comércio Ltda. (Araçoiaba da Serra, SP, Brasil). 3 Nutron Alimentos (Toledo, PR, Brasil), composição kg-1 de produto: Ácido fólico 250 mg, Ácido pantotênico 5.000 mg, Antioxidante 0,6 g, Biotina 125 mg, Cobalto 25 mg, Cobre 2.000 mg, Colina 75.000 mg, Ferro 13.820 mg, Iodo 100 mg, Manganês 3.750 mg, Niacina 5000 mg, Selênio 75 mg, Vitamina (Vit.) A 1.000.000 UI, Vit. B1 1.250 mg, Vit.B12 3.750 mg, Vit.B2 2.500 mg, Vit.B6 1.785 mg, Vit. C

42.000 mg, Vit. D3 500.000 UI, Vit. E 20.000 UI, Vit. K 35.000 mg, Zinco

17.500 mg. 4 Fosfato bicálcico 454 g, Sulfato de potássio 297 g, Cloreto de sódio 174 g, Sulfato de magnésio 75 g. 5 Delaware Ltda. (Porto Alegre, RS, Brasil). 6 Composição proximal da dieta referência do ensaio de digestibilidade (99,5% dieta referência; 0,5% óxido de crômio). 7 Expressa em kJ g-1. 8 Método enzimático-gravimétrico.

Os ingredientes testados – farelo de trigo, farelo de mandioca, milho moído e quirera de arroz – foram previamente moídos e

peneirados em malha de 850 µm. A confecção das dietas experimentais foi realizada mediante homogeneização dos ingredientes secos em misturador em “Y”, com posterior adição dos óleos e 22,5 % de água. A mistura foi peletizada em matriz de 5 mm e os grânulos obtidos, secos em estufa a 55°C por 12 h.

Grupos de 25 jundiás (93,90 ± 34,03 g, peso médio ± desvio padrão) e 31 tilápias-do-Nilo (93,67 ± 51,57 g) foram alocados em tanques cilíndrico-cônicos de 200 L em sistema fechado de circulação de água, com aeração constante e temperatura controlada (28,00 ± 0,38 °C). Durante o período experimental, a biomassa por tanque foi mantida em torno de 2300 g para o jundiá e 3000 g para a tilápia-do-Nilo, sendo reajustada a cada repetição no tempo, quando um novo sorteio era feito para a distribuição dos tratamentos nos tanques. Em cada repetição, antes da coleta de fezes, os animais eram adaptados por uma semana às dietas experimentais, as quais foram fornecidas duas vezes ao dia (às 09.00 e 16.00 h), às taxas de 30 g kg-1 e 35 g kg-1 do peso vivo para jundiá e tilápia-do-Nilo, respectivamente. Uma hora após a última alimentação diária, as paredes internas dos tanques eram limpas e cerca de 70% do volume de água renovado, a fim de evitar contaminação nas fezes. Estas foram coletadas a cada 6 h, entre 18.00 e 06.00 h, em tubos plásticos de 50 mL acoplados na parte inferior dos tanques e imersos em isopor com gelo para reduzir a atividade microbiana. Após cada coleta, os tubos eram centrifugados a 1150 x g durante 5 min, o sobrenadante era descartado e as fezes, após secas em estufa a 55 °C, eram armazenadas a -20 °C para posterior análise.

Os coeficientes de digestibilidade aparente (CDAs) da matéria seca, energia bruta e amido foram determinados pelas seguintes equações:

Para as dietas (Cho e Slinger, 1979):

Para os ingredientes testados (Bureau et al., 1999):

Onde: I = ingrediente; Dt = dieta teste; Ref = dieta referência; NRef = nutriente (%) ou energia (kcal kg

-1

) na dieta referência;

NIng = nutriente (%) ou energia (kcal kg -1

2. 2. Ensaio II – amilase e maltase

A atividade específica das enzimas amilase e maltase foram determinadas para jundiá e tilápia-do-Nilo em um delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial (duas espécies de peixe x quatro fontes de amido). Os peixes foram aclimatados durante 30 dias às condições experimentais. Grupos de 18 juvenis de jundiá (94,02 ± 24,67 g, peso médio ± desvio padrão) foram estocados em tanques retangulares com capacidade para 100 L e grupos de 18 juvenis de tilápia-do-Nilo (91,19 ± 9,98 g), em tanques circulares com capacidade para 150 L. Todos os tanques foram conectados ao mesmo sistema fechado de circulação de água do Ensaio I, com aeração constante e temperatura controlada (27,76 ± 0,17 ºC). Os peixes foram alimentados duas vezes ao dia (08.30 e 17.00 h) até a saciedade aparente com ração comercial extrusada (420 g kg-1 de proteína bruta; Supra Alisul Alimentos S/A, Itajaí, SC, Brasil). Neste período, foram estimadas as taxas de alimentação diárias, em g kg-1 do peso vivo, a serem fornecidas durante o experimento: 3,2 g kg-1 para o jundiá e 4,1 g kg-1 para a tilápia-do-Nilo.

Os peixes foram alimentados com as mesmas dietas experimentais do ensaio de digestibilidade durante 15 dias. Ao final do período experimental, foram sacrificados 10 peixes de cada tratamento com superdose do anestésico Eugenol® (Biodinâmica Química e Farmacêutica Ltda., Ibiporã, PR, Brasil). O trato digestório foi dissecado sobre superfície gelada, separando o intestino anterior, o qual foi imediatamente congelado em recipiente com nitrogênio líquido e, depois, mantido a -20 ºC para posterior determinação de atividade enzimática.

2. 2. 1. Preparação dos homogeneizados celulares

Uma alíquota de 100 mg do tecido do intestino anterior foi homogeneizada com tampão fosfato de sódio (glicerol v/v em tampão fosfato de sódio 20 mM e Tris 10 mM - pH 7,0) em homogeneizador tipo Potter-Elvehjem. Posteriormente, esta amostra foi centrifugada a 4

°C e 13.400 x g por 3 min. O sobrenadante foi utilizado para a determinação da amilase e maltase.

2. 2. 2. Determinação da atividade enzimática

A atividade da amilase foi medida diretamente com um método fotométrico utilizando o kit comercial de investigação clínica Amylase CNPG Liquiform (LABTEST, Lagoa Santa, MG). A amilase converteu

α-(2-cloro-4-nitrofenil)-β-1,4-galactopiranosil maltoside (Gal–G2–α–

CNP) em 1,4-galactopiranosil maltose e 2-cloro-4-nitrofenol, sendo medida a 405 žm. A atividade específica foi expressa em µmoles de glicose hidrolisada por minuto e por miligrama de proteína (U mg-1 de proteína).

A atividade da maltase foi determinada em meio contendo 0,5 ml de tampão citrato-fosfato 0,2 M (pH 7,0) e volume adequado de extrato enzimático. A incubação foi realizada após a adição de 0,5 mL de solução de maltose 5%. As amostras foram ensaiadas em duplicata com dois brancos: um sem extrato enzimático e outro sem substrato. Após a incubação por 60 min à temperatura de 25 oC, a reação foi interrompida com 0,1 mL de ácido perclórico 0,6 N e, em seguida, 0,1 mL de KHCO3

0,6 N foi adicionado para neutralização. O sobrenadante, resultante da centrifugação a 14.400 x g por 5 min, foi utilizado para determinação da glicose. As determinações foram realizadas utilizando 10 µL de cada amostra, colocadas em duplicata nos poços de uma microplaca, mais 200 µL do reagente utilizado no método enzimático da glicose oxidase (glicose GOD-ANA da LABTEST). As placas foram lidas em 405 žm, utilizando um leitor de microplacas (Termomax®, Molecular Devices). A atividade específica foi expressa como µmoles de glicose por minuto e por miligrama de proteína (U mg-1 de proteína).

Para estabelecer a atividade enzimática específica, a concentração de proteínas dos extratos enzimáticos foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951), utilizando-se albumina bovina como padrão.

2. 3. Análises de composição proximal

As dietas e ingredientes experimentais e as fezes foram analisadas segundo os procedimentos da AOAC (1999). A energia bruta foi obtida mediante combustão em bomba calorimétrica. O teor de óxido de crômio nas dietas e fezes foi determinado pelo método espectrofotométrico da difenilcarbazida (Bremer Neto et al., 2003). A concentração de amido foi analisada nas dietas e nas fezes pelo método enzimático descrito por McCleary e colaboradores (1997).

2.4. Análise estatística

Os CDAs foram submetidos à análise de variância multivariada (MANOVA) em esquema bifatorial, pelo procedimento GLM (general linear model), para avaliar a significância do λ de Wilks. Sendo o λ de Wilks significativo (P<0,05), procedeu-se com a avaliação das análises de variância para cada variável em separado (ANOVA) e, na sequência, aplicado o teste de Tukey para a comparação de médias. Os dados de atividade específica de amilase e maltase foram submetidos ao mesmo procedimento estatístico descrito para os CDAs. As suposições de homocedasticidade e normalidade nos resíduos dos modelos estatísticos foram verificadas, os resíduos foram normais e homocedásticos (P>0,05). As análises estatísticas foram executadas utilizando o aplicativo STATISTICA versão 7.0 (StatSoft, Inc., 2004) e o nível de significância de 5%.