4 CAPÍTULO 2: AVALIAÇÃO DE MEIOS PARA OBTENÇÃO DE
4.2 Material e Métodos
4.2.1 Amostra de referência e condições de cultivo
Foi utilizada uma estirpe liofilizada da American Type Culture Colection (ATCC)1 de C. chauvoei
(ATCC 10092), pertencente a bacterioteca do Laboratório de Anaeróbios da EV-UFMG. A amostra foi reconstituída em caldo Reinforced Clostridial Medium (RCM)2 e após 48 horas de
incubação, em jarra de anaerobiose3, contendo mistura gasosa (80% N
2; 10% CO2; e 10% H2), a
37°C, foi semeada em tubos de ensaio com tampa rosca, contendo RCM, e em duas placas com ágar sangue de carneiro a 5% (v/v). Os tubos e uma das placas foram incubados em anaerobiose a 37°C por 48 horas. A outra placa foi incubada em aerobiose para avaliação da pureza da amostra. As colônias foram avaliadas visualmente e pelo método de Gram quanto à morfologia e pureza. Para confirmação da identidade, a estirpe foi submetida à técnica de IFD (ASSIS et al., 2001) e PCR multiplex (RIBEIRO et al., 2012).
4.2.2 Preparo da suspensão bacteriana contendo predominantemente células vegetativas
de Clostridium chauvoei
Para avaliação do tempo de cultivo necessário para obtenção de uma suspensão bacteriana contendo predominantemente células vegetativas de C. chauvoei, foram feitos cinco repiques sucessivos, em caldo RCM4, da estirpe de referência. Após o último repique a amostra foi
transferida para três tubos contendo caldo RCM5 e incubada por 12, 24 e 48 horas, em jarra de
anaerobiose6, contendo mistura gasosa (80% N
2; 10% CO2; e 10% H2), a 37°C. Após esse período
de incubação, a suspensão bacteriana foi submetida a contagem bacteriana, em ágar sangue de carneiro a 5% (v/v) (MANTECA et al., 2001) para determinação da quantidade de unidade formadora de colônias viáveis. Para se obter o percentual de bactérias na forma vegetativa em relação a forma esporulada, uma alíquota da suspensão bacteriana foi submetida a contagem bacteriana na câmara de Neubauer. Foram contadas 300 bactérias agrupando-se as bactérias contadas conforme a forma bacteriana em esporuladas ou vegetativas. O número de bactérias na forma vegetativa obtido foi dividido por 300 e multiplicado por 100 para se obter o percentual final de bactérias na forma vegetativa da suspensão avaliada.
Para remoção das toxinas e restos celulares produzidos, o cultivo foi centrifugado a 3000 x g, em temperatura ambiente, durante 30 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em uma solução estéril de salina fosfatada tamponada (PBS- 137 mM de NaCl, 10 mM de Na2HPO4, 2,7 mM de KCl em pH de 7,4). O procedimento de centrifugação
foi repetido e o pellet obtido foi ressuspendido em PBS (pH 7,4) para a densidade ótica (DO) 1 à 600 nm e mantido a -80°C7 até o momento do uso (YANG et al., 2009).
1 NIBISC, Inglaterra.
2 Difco Laboratories, EUA. 3 Oxoid, Inglaterra. 4 Difco Laboratories, EUA. 5 Difco Laboratories, EUA. 6 Oxoid, Inglaterra. 7 Revco, EUA.
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4.2.3 Preparo da suspensão de esporos de Clostridium chauvoei
4.2.3.1 Meios de cultura
Para produção de esporos foram testados os meios Bifásico (CLIFFORD; ANELLIS, 1971), Brain Heart Infusion (BHI8), Dunkan (STERNE; BATTY, 1975), Ellner (ELLNER, 1956) e Kolbe (KOLBE et al., 1981). O BHI foi preparado conforme recomendações do fabricante. Os meios Bifásicos Dunkan e Ellner foram preparados conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2: Composição dos meios de cultura testados para obtenção de suspensões de esporos de Clostridium
chauvoei Meios de cultura Bifásico (CLIFFORD; ANELLIS, 1971) Dunkan (STERNE; BATTY, 1975) Ellner (ELLNER, 1956)
Componentes (p/v) % Componentes (p/v) % Componentes (p/v) %
Cooked meat medium
(CMM) Agar Glicose 0,34 0,02 0,001 Extrato de levedura Proteose peptona Amido Tioglicolato de sódio Na2HPO4 0,4 1,5 0,4 0,1 1 Polipeptona Extrato de levedura Amido MgSO4, 7 H20 KH2PO4 Na2HPO4, 7 H20 1,0 0,3 0,3 0,01 0,15 5
Para preparação do meio de Kolbe 100 g de fígado bovino foram cortados em cubos de aproximadamente 2 x 2 x 2 cm e adicionados a 200 mL de água destilada. A seguir foi acrescentado 0,2 g de papaína dissolvida em 5 mL de água destilada e o pH de 7,2 foi obtido pela adição de NaOH 1N. A mistura fígado papaína foi aquecida e mantida em Banho-Maria a 640C
por 120 minutos e após esse período centrifugada a 3000 x g, durante 10 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante obtido foi clarificado por filtração, e ajustado para o pH 7,3 com solução de NaOH a 1 N. Foi adicionado ao filtrado 4% de tripticase, 2% de ágar bacteriológico e 1% de extrato de levedura (Kolbe et al., 1984). Todos os meios foram esterilizados mediante autoclavação sobre pressão de 3 atm, 127°C durante 20 minutos e mantidos na câmara de anaerobiose (80% N2; 10% CO2; e 10% H2), ou seja, pré-reduzidos, até o momento da inoculação.
4.2.3.2 Cultivo da suspensão de esporos
Para obtenção de uma suspensão de esporos de C. chauvoei, a estirpe de referência foi previamente cultivada em caldo RCM9 por 24 horas em condições de anaerobiose, a 37°C. Com
objetivo de obter um inóculo homogêneo, durante cinco dias consecutivos, a cada 24 horas, o cultivo obtido foi transferido na proporção de 10% (v/v) para um tubo contendo RCM fresco e pré-reduzido e incubado em condições de anaerobiose, a 37°C. O último cultivo foi aquecido a 82°C durante duas horas, para provocar a morte de células vegetativas, e em seguida semeado nos diferentes meios de esporulação (BHI, bifásico, Dunkan, Ellner e Kolbe). Todos os meios foram mantidos em ambiente de anaerobiose, a 37°C, durante 24 horas. No dia seguinte, os meios foram
8 Difco Laboratories, EUA.
37 retirados da estufa e mantidos em condições de anaerobiose a temperatura ambiente durante 30 dias.
Após esse período, os cultivos assim obtidos foram centrifugados a 3000 x g, em temperatura ambiente, durante 30 minutos, e ressuspendidos com 40 mL de PBS. Esse procedimento foi repetido por mais quatro vezes para remoção de toxinas e impurezas dos meios. As bactérias assim recuperadas foram avaliadas quanto ao percentual de esporos e viabilidade bacteriana. A suspensão de esporos foi submetida a contagem bacteriana, em ágar sangue de carneiro a 5% (v/v) (MANTECA et al., 2001) para determinação da quantidade de unidade formadora de colônias viáveis. Para se obter o percentual de bactérias na forma vegetativa em relação a forma esporulada, uma alíquota da suspensão bacteriana foi submetida a contagem bacteriana na câmara de Neubauer. Foram contadas 300 bactérias agrupando-se as bactérias contadas conforme a forma bacteriana em esporuladas ou vegetativas. O número de bactérias na forma vegetativa obtido foi dividido por 300 e multiplicado por 100 para se obter o percentual final de bactérias na forma vegetativa da suspensão avaliada.
4.2.3.3 Purificação dos esporos
O cultivo obtido em meios de esporulação foi submetido a um protocolo de purificação de esporos segundo Yang et al. (2009), com modificações. Brevemente: os cultivos foram centrifugados a 3.000 x g, em temperatura ambiente, durante 30 minutos. Para lise de células vegetativas remanescentes e liberação do esporo da célula mãe, o sedimento foi ressuspendido em 20 mL de uma solução de PBS contendo 500 µg/mL de lisozima10 e vigorosamente agitado em vórtex
durante 1 minuto. Após esses procedimentos, as células bacterianas foram sonicadas durante 30 minutos (amplitude 40%, cinco pulsos, 10 segundos), sendo feita avaliação visual por microscopia de contraste de fase, coloração de esporos e células vegetativas a cada 10 minutos. Em seguida, as amostras foram incubadas a 37°C, durante duas horas, para completa digestão de
células vegetativas. Para remoção dos fragmentos de células vegetativas e da lisozima, as suspensões de esporos foram lavadas por 14 vezes por meio de centrifugação a 3.000 x g, em temperatura ambiente, durante 30 minutos e sedimento ressuspendido com PBS. A pureza das suspensões de esporos foi determinada por meio da avaliação visual pela coloração de Gram e coloração de esporos Wirtz-Concklin.