4 Material e métodos
A amostra deste estudo experimental e longitudinal foi constituída de 29 coelhos
machos albinos, da raça Nova Zelândia, com peso variando de 1,5 kg a 2,5 kg, clinicamente
sadios, provenientes da Fazenda Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais
(Igarapé – MG). O projeto da presente pesquisa (Protocolo número 28/2006) foi aprovado
pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG), em 28/6/2006. (ANEXO
A)
A pesquisa foi conduzida obedecendo-se aos critérios recomendados pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e respeitando a Lei Federal Brasileira
número 6 638, de maio de 1979, que “estabelece normas para a prática didático-científica da
vivissecção de animais”. Os animais foram mantidos em gaiolas suspensas, com água e ração
específica para a espécie ad libitum, no biotério da Faculdade de Medicina Veterinária da
Universidade Presidente Antônio Carlos (UNIPAC), em Juiz de Fora, Minas Gerais.
Os coelhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo botox (GB) e grupo
crotoxina (GCrtx).
O GB foi formado pelos coelhos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14. O GCrtx,
pelos coelhos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29. Aplicou-se a toxina
botulínica do tipo A ou a crotoxina no músculo reto superior do olho direito de cada coelho.
Em cada músculo reto superior do olho esquerdo dos coelhos do GB e do GCrtx, foi aplicado
soro fisiológico a 0,9%, em volume igual ao das toxinas. O grupo assim formado foi chamado
de grupo controle (GC). O QUADRO 2 mostra a distribuição dos grupos.
A aplicação foi realizada após a instilação de colírio anestésico de cloridrato de
benoxinato a 0,4% (oxibuprocaína - Oxinest® - Latinofarma Indústrias Farmacêuticas Ltda.,
Allergan Pharmaceuticals Ltd. – Westport, Irlanda) e a crotoxina (cedida pela Divisão de
Imunobiológicos da Fundação Ezequiel Dias de Belo Horizonte - MG [FUNED]) foram
injetadas no músculo reto superior do olho direito de cada coelho com uma seringa de insulina
(BD Plastipak® Becton Dickinson Ind. Cirúr. Ltda., Curitiba, PR). Foi utilizada a técnica de
aplicação segundo Ribeiro (5). Após a colocação de um blefarostato no olho do animal, foi
utilizada uma pinça denteada para elevar a conjuntiva. A agulha foi introduzida
transconjuntivalmente e penetrada no músculo reto superior, a aproximadamente 4 mm da
inserção muscular. A toxina foi injetada lentamente. As FIGURAS 6 e 7 ilustram a aplicação
da toxina no olho direito de um dos coelhos.
No coelho 5, não foi aplicada a solução salina a 0,9% no olho esquerdo, pois o animal
apresentava atrofia ocular, por provável trauma perfurante.
No coelho 13, houve extravasamento de toxina botulínica durante a aplicação.
A dose de crotoxina utilizada foi baseada na comparação entre a dose letal mínima da
crotoxina e a dose letal mínima da toxina botulínica do tipo A, ambas para camundongos
(DL-50: dose que mata exatamente metade de uma população de animais, geralmente no
período de 7 a 14 dias). Uma unidade de toxina botulínica do tipo A comercializada (Botox®)
equivale a uma DL-50 para camundongos. A crotoxina utilizada possuía uma DL-50 de 1,5 μg (equivalente a 1 U). A toxicidade é determinada pela dose letal mínima que mata 50% dos animais inoculados - DL-50, (camundongos swiss-webster, com peso entre 18 g e 22 g). A
dose mínima eficaz estimada de crotoxina, comparada com a de toxina botulínica do tipo A,
em estudo de Scott, Rosenbaum e Collins (1973), seria de 0,15 μg. (3)
Os QUADROS 3 e 4 mostram as doses de toxina botulínica e crotoxina aplicadas em
QUADRO 2
Distribuição dos coelhos em grupos
Grupos Olho da aplicação Identificação dos coelhos
Grupo Botox (GB) *OD (14 olhos) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13 e 14
Grupo Crotoxina (GCrtx) OD (15 olhos) 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e
29
Grupo Controle (GC) **OE (28 olhos) 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28 e 29
* OD: olho direito
.
FIGURA 6: Aplicação de toxina no músculo reto superior do olho direito de coelho.
FIGURA 7: Fase final da aplicação de toxina no músculo reto superior do olho direito. Observa-se discreta quemose após a aplicação.
QUADRO 3
Toxina botulínica aplicada no músculo reto superior do olho direito dos coelhos 1 a 14
Identificação dos coelhos Toxina aplicada e dosagem Volume aplicado
Data da aplicação Músculo em que foi aplicada 1 Botox® 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD* 2 Botox® 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 3 Botox® 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 4 Botox® 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 5 Botox® 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 6 Botox® 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 7 Botox® 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 8 Botox® 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 9 Botox® 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 10 Botox® 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 11 Botox® 2,5 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 12 Botox® 2,5 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 13 Botox® 2,5 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 14 Botox® 2,5 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD
* Reto superior do olho direito
QUADRO 4
Crotoxina aplicada no músculo reto superior do olho direito dos coelhos 15 a 29
Identificação dos coelhos Toxina aplicada e dosagem Volume aplicado Data da aplicação Músculo em que foi aplicada 15 Crotoxina 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD* 16 Crotoxina 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 17 Crotoxina 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 18 Crotoxina 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 19 Crotoxina 10 U 0,5 ml 25/11/2006 RS OD 20 Crotoxina 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 21 Crotoxina 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 22 Crotoxina 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 23 Crotoxina 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 24 Crotoxina 5 U 0,25 ml 25/11/2006 RS OD 25 Crotoxina 2 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 26 Crotoxina 2 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 27 Crotoxina 2 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 28 Crotoxina 2 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD 29 Crotoxina 2 U 0,1 ml 25/11/2006 RS OD
4.1 Estudos anatomopatológico e imunoistoquímico
Os animais foram sacrificados por médico veterinário, nos momentos estabelecidos (12º,
18º e 25º dias após as aplicações), com tiopental sódico (Thiopentax – Cristália), na dosagem
de 20 mg/kg, seguido de injeção intracardíaca de cloreto de potássio a 10%. O QUADRO 6
esquematiza os dias das eutanásias e os coelhos sacrificados.
QUADRO 5
Relação dos dias em que foram realizadas as eutanásias dos coelhos, coelhos sacrificados e número de olhos enucleados.
Posteriormente, os olhos foram cuidadosamente enucleados, mantendo-se os músculos
retos superiores intactos. (FIGURA 8) Os músculos mediam de 10 a 15 milímetros. Os globos
oculares foram colocados em frascos numerados, com formol tamponado a 10%.
Os músculos retos superiores foram desinseridos dos globos oculares com auxílio de
uma tesoura de ponta. Cada músculo foi colocado em cassete plástico e identificado com o
mesmo número contido no frasco de origem. O material foi levado para o processador de
tecidos (Autothecnicon), no qual foi submetido a seis lavagens com álcool absoluto (uma hora
Dia da eutanásia Identificação dos coelhos sacrificados Total de olhos
07/12/2006 1, 6, 11, 15, 20, 25 12
13/12/2006 2, 3, 7, 8, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27 22
20/12/2006 4, 5, 9, 10, 13, 14, 18, 19, 23, 24, 28, 29 23
cada lavagem), a três lavagens com xilol (uma hora cada lavagem) e a duas lavagens de
parafina a 68°C (uma hora e trinta minutos cada lavagem). Posteriormente, o material foi
incluído em blocos de parafina e igualmente identificado.
FIGURA 8 - Globo ocular de coelho enucleado. Músculo reto superior preservado.
Os blocos foram cortados em micrótomo manual (Spencer 820), com navalha
descartável. Os cortes, com espessura de três micra, foram colocados em banho-maria à
temperatura de 60°C e, posteriormente, estendidos em lâminas especiais de silano
(dimetiltrietoxisilano-SIGMA - A - 3648), com a mesma identificação dos blocos. O material
foi desparafinado em estufa, a 70°C, por cinco minutos. As lâminas foram colocadas em
berços de vidro, passando por três cubas de vidro contendo xilol e três cubas de vidro
contendo álcool absoluto; finalmente, foram lavadas em água corrente.
Os cortes histológicos foram submetidos à coloração pela hematoxilina-eosina e a
Primeiro processo:
1- Bloqueio da peroxidase endógena por meio de quatro lavagens de cinco minutos em
água oxigenada 10 volumes.
2- Lavagem em água corrente por dez minutos.
3- Recuperação antigênica, feita em panela de pressão contendo solução de ácido cítrico
(0,01M, pH 6,0). Quando a panela soltou a pressão, fez-se a contagem de dois minutos e vinte
segundos; posteriormente, a panela foi esfriada em água corrente por quatro minutos.
4- Lavagem das lâminas em tampão salínico (PBS) de pH 7,40 (duas lavagens de cinco
minutos).
5- Diluição dos anticorpos em solução de PBS e soro de albumina bovina
(Sigma/B4287).
6- Para o anticorpo Myo-D1 (Novocastra Lab.), foi utilizada uma concentração de 1
microlitro de anticorpo para 50 microlitros de solução diluente. Para o anticorpo PCNA
(proliferating cell nuclear antigen – Kit EmVision TM Doublestain Syatem, DAKO Corp.,
Dinamarca), foi utilizado 1 microlitro de anticorpo para 200 microlitros de solução.
7- Incubação das lâminas com o anticorpo.
8- Secagem com papel absorvente, somente ao redor do corte. Colocação dentro de uma
vasilha plástica, sobre uma espuma umedecida (câmara úmida). Com auxílio de uma pipeta
graduada, instilou-se o anticorpo em torno de 100 microlitros ou até que cobrisse o corte. Isso
foi feito em cada lâmina.
9- Terminado o processo, a câmara úmida foi fechada com tampa própria e colocada na
estufa, a 40°C, por trinta minutos.
Segundo processo:
1- A câmara úmida foi retirada da geladeira e deixada à temperatura ambiente por
quinze minutos.
2- O anticorpo foi aspirado e lavado com tampão PBS (duas lavagens de cinco minutos).
3- Foi feita incubação com a solução de biotina (DAKO – kit LSAB/ K-690) pronta para
uso, a 40°C, por vinte minutos.
4- A câmara úmida foi retirada da estufa e deixada à temperatura ambiente por oito
minutos.
5- O anticorpo foi aspirado e lavado com tampão PBS (duas vezes, por cinco minutos).
6- Foi feita incubação com a solução de Streptavidina (DAKO - kit LSAB/K-690)
pronta para uso, a 40°C, por vinte minutos.
7- A câmara úmida foi retirada da estufa e deixada à temperatura ambiente por oito
minutos.
8- Foi feita aspiração e lavagem com tampão PBS (duas vezes, por cinco minutos).
9- As lâminas foram colocadas na solução cromógeno por cinco minutos, a 40°C.
(Solução cromógeno: 200 ml de PBS 7,40; 0,12 g de 3,3 diaminobenzidina – DAB [Sigma/D-
5 637]; 3 ml de água oxigenada 100 volumes. DAB dissolvido em PBS, filtrado com papel-
filtro, mais 3 ml de água oxigenada). As lâminas foram colocadas em uma cuba de vidro e
levadas para a estufa.
10- Contra-coloração com hematoxilina de Harris.
11- Lavagem em água corrente por dez minutos.
12- Lavagem das lâminas em três banhos de álcool e três de xilol.
Controles positivos (biópsia de rabdomiosarcoma) e negativos (omissão do anticorpo
primário) foram utilizados para avaliar e controlar as reações imunoistoquímicas.
Ao lado da identificação de cada lâmina, situou-se o corte histológico com Myo D; à
direita, o corte histológico com PCNA. (FIGURA 9)
Núcleos celulares corados em marrom são positivos para o Myo D; núcleos celulares
corados em azul são negativos para o Myo D (FIGURA 10).
Os núcleos positivos para o PCNA foram corados em marrom. (FIGURA 11)
As lâminas foram mantidas com suas identificações recobertas durante a análise,
realizada em microscópio da marca Nikon, por dois patologistas. As lâminas coradas pela
hematoxilina-eosina foram examinadas e fotografadas com máquina fotográfica digital Sony
Cyber-shot DSC-H1, acoplada à ocular do microscópio. Nas lâminas preparadas para a
avaliação imunoistoquímica, foram examinadas cem miofibras escolhidas ao acaso, com
aumento de mil vezes (ocular de dez vezes e objetiva de cem vezes); foi feita a contagem dos
núcleos positivos para o Myo D e para o PCNA, bem como a contagem do total de CS
(núcleos positivos e negativos para os marcadores).
FIGURA 9 - Lâmina preparada para análise imunoistoquímica. À esquerda, identificação que foi recoberta durante toda a contagem no microscópio. A primeira preparação foi feita com Myo D (seta em azul); a segunda (lado esquerdo), com PCNA (seta em verde).
FIGURA 10 - Corte longitudinal do músculo reto superior de um coelho, submetido à marcação pelo anticorpo anti-Myo D. Núcleo positivo para o Myo D é corado em marrom (círculo verde). (Aumento de mil vezes).
FIGURA 11- Corte de músculo reto superior de um coelho submetido à marcação pelo anticorpo anti-PCNA. Os núcleos marcados em marrom são positivos para o PCNA (círculos verdes) (Aumento de mil vezes).
Encerrada a contagem das células em cada lâmina, os dados foram analisados,
calculando-se as médias aritméticas, o desvio-padrão e a amplitude da variação. Todas as
informações colhidas foram armazenadas em um banco de dados criado no programa Excel,
versão 7 (Microsoft Corporation, EUA); posteriormente, as informações foram analisadas
com o pacote estatístico SPSS (Statistical Package for Social Science), versão 11,0.