Preparação dos animais
Foram obtidos no biotério central do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Santa Maria, 12 cães, machos com variação de peso entre 12,5 e 23,8kg (16,50kg±1,04). Estes animais permaneceram hospedados em canis individuais, em ambiente com temperatura controlada, e acesso a uma área aberta comum, para atividades durante algumas horas por dia. A manutenção nutricional foi realizada por meio do fornecimento de água e ração balanceada ad libitum.
Os cães receberam anti-helmíntico à base de doramectina no momento de chegada, repetido após 21 dias e a cada quatro meses, até o fim do experimento, quando foram doados. Eles foram avaliados mediante exame clínico geral, avaliação hematológica (pré-cirúrgicos e programados) e estudo radiográfico da cavidade torácica, os quais verificaram a integridade física dos animais, e possibilitaram suas participações no experimento.
34 Cada um dos cães foi radiografado nas projeções latero-medial esquerda e ventro-dorsal obliquada à esquerda no pré-operatório, aos 29, 59 e 119 dias pós- implantação. A avaliação hematológica consistiu de hemogramas e testes bioquímicos avaliando creatinina, albumina e alanina-aminotransferase (ALT), aspartato- aminotransferase (AST) e fosfatase alcalina (FA), realizados 24 horas antes do procedimento cirúrgico (momento zero), aos 15, 30 e 45 dias de pós-operatório.
A preparação para a intervenção cirurgia consistiu de jejum sólido por 12 horas e líquido por quatro horas. Cada animal foi pré-medicado com de cloridrato de acepromazina (0,05mg kg-1) e cloridrato de tramadol (2,0mg kg-1), por via intramuscular.
Distribuição dos animais
Os doze cães em experimentação foram organizados em dois grupos de seis animais e receberam próteses produzidas com os dois materiais propostos, sendo o polimetilmetacrilato (PMMA)b aplicado inicialmente nos cães do grupo I, e o ácido polilático (PLA)d aplicado inicialmente nos cães do grupo II.
Elaboração das próteses
As dimensões padronizadas para as próteses segmentares de costela foram: 80mm de comprimento, 7mm de largura por 3mm de espessura.
As próteses de PMMA foram produzidas pela aplicação do método descrito no artigo 1 desta dissertação, e possuem em sua composição a presença de um fio de Kirschnera de 1,5mm de espessura e 110mm de comprimento com pontas trifacetadas e extremidades de implantação de 15mm. O grau de encurvamento de cada prótese foi definido pela avaliação radiográfica no pré-operatório.
As próteses de PLA foram produzidas com as mesmas dimensões da anterior, porém em virtude da característica de plasticidade do material, algumas modificações
35 foram necessárias para possibilitar sua produção e funcionalidade. O fio de Kirschnera de 1,5mm em associação a este material necessitou de encurvamento na sua porção central para evitar a rotação do polímero sobre o pino, o que facilitou, a diferenciação das próteses implantadas na avaliação das radiografias.
O polímero PLA por ser maleável possibilitou a moldagem das próteses no momento de implantação cirúrgica das mesmas, em comparação à curvatura da 5a e 7a costelas esquerdas, em cada unidade experimental.
Anestesia e intervenção cirúrgica
Após 20 minutos da administração da MPA, foi realizada tricotomia ampla do hemitórax esquerdo e encaminhamento ao bloco cirúrgico.
Os pacientes foram submetidos à profilaxia antimicrobiana com cefalotina sódica (30mg kg-1) imediatamente antes da indução anestésica, e após 1h30min até o término do procedimento. A indução foi obtida pela aplicação intravenosa de propofol (4,0mg kg-1) seguida por bloqueio intercostal com cloridrato de bupivacaína (1,0mg kg-
1
) e cloridrato de Lidocaína (1,0mg kg-1). A manutenção anestésica foi realizada com anestesia inalatória por meio de vaporizador calibrado, e volume de 0,5% com isofluorano em oxigênio 100% com ventilação mecânica ciclada a volume.
Os animais receberam infusão contínua à base de dipirona (25mg kg-1) no transoperatório, associada à administração de cloridrato de tramadol (5mg kg-1) como protocolo analgésico pós-operatório. O acesso cirúrgico foi realizado na parede costal esquerda seguindo a abordagem descrita em ORTON (2003).
Após a exposição da 6a costela foi mensurada com paquímetro, a distância de 3cm a partir da junção costo-condral, para a marcação do ponto ventral de secção. Removeu-se então um segmento costal de 8cm sob osteotomia com cisalha de Liston,
36 seguido pela perfuração dos cotos costais remanescentes com perfurador intercortical criando o ponto de aplicação do fio de Kirschner da prótese.
A estabilidade foi assegurada com um ponto de Sultan modificado, em cada extremidade, ancorado em perfuração prévia, em cada coto costal e dois em cada extremidade da prótese (conforme trazido no artigo1). Para tanto nas próteses de PMMA foi usado fio de Kirschner de diâmetro 0,6mm e nas de PLA mononáilon n.0c.
Para estabilização costal foram usados três pontos de sutura, um no centro e um em cada extremidade, com fio de mononáilon n.0. A sutura foi iniciada pelo fio central que contornou a 7a costela na sua face caudal no sentido latero-medial, em seguida dando uma volta completa ao redor da prótese, e circundando a 5a costela no sentido médio-lateral, para fechamento da sutura na face lateral desta. Posteriormente foram aplicados pontos sobre as extremidades das próteses, circundando a 5ª e 7ª costelas e ficando o fio posicionado sobre a face lateral da 6ª costela. Na sequencia, a musculatura costal foi aproximada com fio de mononáilon n.2-0 e o tecido subcutâneo e bordas da pele por sutura intradérmica em padrão colchoeiro, com o mesmo fio. A síntese cutânea foi completada com pontos de Wolf com fio mononáilon n.3-0.
O curativo foi realizado com tintura de benjoim aplicado sobre as bordas da ferida cirúrgica e, após secagem, aplicou-se micropore, sendo refeito a cada 3 dias, até a remoção dos pontos cutâneos no 10o dia pós-operatório.
No pós-operatório os animais receberam o protocolo de cefalotina (30mg kg-1 por oito dias); tramadol (5mg kg-1, por sete dias) e maxicam (0,1mg kg-1, por sete dias).
Após esta etapa de implantação inicial, dois animais de cada grupo foram submetidos a procedimentos de biópsia pós-implantação aos 30, outros dois aos 60 e os demais aos 120 dias, em que se removeu a prótese, em associação a segmentos de costela de 1cm, em cada extremidade, para posterior avaliação histológica das interfaces
37 prótese-costela. No local foi inserida uma nova prótese produzida com o outro material em teste e 2cm maior que a primeira prótese implantada. Dessa forma, em cada animal foi possível a observação clínica e radiológica pós-operatória da aplicação de ambos os materiais aos 30, 60, 120 após a primeira intervenção, além da avaliação clínica aos 360, 330 e 270 dias após as reintervenções respectivamente aos tempos avaliados. Toracoscopia e método de avaliação da capacidade de consolidação óssea
Cada um dos cães foi submetido à toracoscopia paraxifóide imediatamente antes da implantação costal e, aos pares, aos 30, 60 e 120 dias, antes da obtenção do material para estudo histopatológico. Sendo posicionados em decúbito dorso-lateral direito, realizando-se pneumotórax prévio com ar ambiente (10ml kg-1). Para produção do pneumotórax, utilizou-se uma seringa de 60ml acoplada à dânula e scalp 18G, com o qual foi realizada toracocentese próximo a junção costo-condral esquerda no 8o espaço intercostal.
Procedeu-se, então, incisão cutânea, de aproximadamente 5mm, 2cm caudalmente à junção condro-esternal esquerda, através da qual se realizou a introdução do portal endoscópico (5mm) pelo acesso paraxifóide. Por esse acesso, foi introduzido endoscópio de 4,7mm de diâmetro e 30º para avaliação do interior do hemitórax esquerdo.
Após inspeção da cavidade foi realizada desmontagem do portal vídeolaparoscópico com remoção de sua válvula, permitindo dessa forma a introdução de dreno torácico de 14F pelo interior do portal videolaparoscópico, para manutenção pós-operatória da pressão negativa intra-pleural.
A 9a costela também foi abordada na 1a intervenção, sendo osteotomizada em dois pontos com cisalha de Liston no 20, produzindo um segmento ósseo de 8cm em sua porção média. Este, por sua vez, foi estabilizado pela aplicação de sutura óssea com fio
38 de aço (0,6mm) em padrão isolado simples ancorado a orifícios produzidos na direção médio-lateral da 9a costela, seguindo a técnica descrita por ZHANG et al. (2011). A aplicação do osso autógeno serviu de comparação ao método envolvendo implante sintético, ao mesmo tempo, que permitiu a avaliação da capacidade de consolidação óssea individual dos animais em experimentação. A síntese tecidual para correção do acesso à 9a costela seguiu a mesma conduta utilizada para o acesso à 6a costela, como descrito anteriormente.
Processamento do material coletado
Do material colhido, foram separados, em cada extremidade, segmentos medindo 1cm da prótese e 1cm da costela receptora que foram fixadas em formol 10% por 24-48 horas. Após a clivagem, foram submetidas a processo de descalcificação com
ácido fórmico a 5% por dois a três dias. Após término do processamento de rotina,
foram embebidas em parafina, com preparação de lâminas histopatológicas de 4µm, as
quais foram coradas pela técnica de hematoxilina e eosina e avaliadas por microscopia
de luz em aumento de 100X.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O protocolo analgésico foi eficiente. Todos os animais retornaram às atividades em até 48 horas pós-cirúrgicas, realizando as suas necessidades fisiológicas e movimentando-se sem desconforto. Pela avaliação clínica pós-implantação, constatou- se que a prótese causou mínima alteração na movimentação do segmento lateral da parede torácica, pois junto ao implante foram preservados e fixados, os músculos elevadores e retratores costais que, segundo KÖNIG & LIEBICH (2012), são responsáveis pela sua movimentação.
39 Os músculos grande dorsal e serráto dorsal cranial e serráto dorsal caudal, após cicatrização com formação de tecido fibroso, também foram responsáveis pela movimentação passiva da prótese em associação aos segmentos de costela e ao movimento das costelas adjacentes, como citado por RAPPETI (2006).
O exame clínico dos animais, por meio de inspeção, auscultação, percussão e palpação definiram ausência de dor, adequada movimentação da parede torácica, sem alterações macroscópicas e manutenção da capacidade respiratória. Ressalta-se que os pacientes mantiveram-se clinicamente saudáveis por até 360 dias após a reintervenção.
A avaliação radiográfica aos 120 dias de pós-operatório possibilitou definir a ocorrência de consolidação das linhas de osteotomia, na 9a costela, de todos os segmentos reimplantados pelo método de ZHANG (2011), porém houve presença de desalinhamento aposicional dos fragmentos que ocorreu em 25% dos casos, em decorrência da possibilidade de deslocamento lateral na aplicação do citado método.
A inspeção pelas radiografias permitiu definir o posicionamento e estabilidade das próteses aos 29, 59 e 119 dias pós-implantação em ambos os grupos, além da verificação da capacidade de cicatrização óssea de cada indivíduo baseada na reparação das osteotomias produzidas na 9a costela esquerda em todas as unidades experimentais.
Nesta avaliação foi observada presença de deslocamento do ponto de ancoragem na extremidade distal da costela em um animal (8,33%) do grupo I (PMMA) avaliado aos 29 dias pós-implantação. Esta ocorrência foi relacionada à tensão excessiva na aplicação das suturas com fio de aço inox ocasionando ruptura do tecido ósseo e deslocamento da prótese do eixo de aposição.
O exame radiográfico não permitiu detectar alterações no parênquima pulmonar, embora tenham ocorrido aderências pulmonares em dois pacientes, condição constatada por toracoscopia. Apesar das aderências pulmonares os lobos permaneceram funcionais,
40 e os animais não apresentavam alterações do padrão respiratório, concordando com o BJORLING (1998), o qual cita que essas lesões pulmonares podem se apresentar de maneira assintomática.
A técnica de toracoscopia adotada foi adequada e a utilização de endoscópio rígido de 4,7mm e 30° favoreceu a visualização das estruturas alvo no interior da cavidade torácica, pelo maior ângulo de visão possibilitado pela angulação da lente. O exame toracoscópico paraxifóide transdiafragmático permitiu acesso minimamente invasivo, conforme trazido por PIGATTO (2008). A instituição do pneumotórax visou à criação de espaço intratorácico e redução do risco de iatrogenias durante o acesso paraxifóide “às cegas”. Acesso que causou mínima lesão tecidual e possibilitou a inspeção do interior da cavidade torácica, em particular da face medial das próteses implantadas.
Pelos 24 exames realizados, embora a prótese estivesse exposta (Figura 1b), identificou-se aderências pulmonares em apenas dois animais, sendo um do grupo PMMA avaliado aos 60 dias pós-implantação e o outro do grupo PLA avaliado aos 30 dias pós-implantação (Figura 1c). Essa aderência provavelmente foi ocasionada pelo contato dos lobos pulmonares com superfície irregular das próteses, as quais não possuíam recobrimento mesotelial. A baixa incidência dessa complicação provavelmente se deva aos movimentos respiratórios que por serem constantes minimizam a possibilidade de aderência.
O padrão de sutura foi adequado para estabilização das próteses produzidas com PMMA, porém na implantação da primeira prótese de PLA, no1o animal do 2o grupo, ocorreu ruptura da extremidade da prótese durante a aplicação da sutura. Dessa forma, neste grupo foi padronizada a utilização do fio de mononáilon n.0 para as suturas de fixação que demonstrou resistência suficiente para manter a estabilidade, nesse
41 momento, prevenindo a dilaceração. Porém, nas avaliações radiográficas de controle pós-implantação foi detectada rotação das próteses em três animais do grupo II (PLA), que podem ser relacionadas ao fio de mononáilon, o qual possui características de elasticidade que possibilitam movimentação da prótese, associada à baixa resistência do PLA podem ser causas da falha de estabilidade neste caso.
A avaliação do método de implantação descrito por ZHANG (2011), aplicado na osteossíntese do segmento médio da 9a costela esquerda das unidades experimentais, apresentou falhas de estabilidade, ocorrendo o desalinhamento do segmento de costela reimplantado, pela ruptura do ponto de fixação das suturas envolvendo a extremidade costal em dois animais do grupo I (PMMA) e em um animal do grupo II (PLA). Esta condição correspondeu a 25% dos casos. Portanto, a técnica de sutura com Sultan modificado oferece maior estabilidade.
As análises histológicas apresentaram semelhança de padrão de acordo com o grupo avaliado. As próteses de PMMA produziram reação inflamatória em menor intensidade que as de PLA, como já esperado pelas características de biocompatibilidade de cada material.
As amostras obtidas dos cães do grupo I (PMMA) demonstraram acentuada fibrose, caracterizada por mantos de fibroblastos com acentuada deposição de colágeno denso intracelular, com múltiplos fragmentos de ossos neoformados. Neste grupo houve presença de infiltrado linfoplasmocítico multifocal de grau leve a moderado com discreta presença de macrófagos (Figura 2). Já nas amostras dos animais do grupo II (PLA) verificou-se múltiplos granulomas, caracterizados por macrófagos epitelióides e células gigantes multinucleadas normalmente presentes em reações do tipo corpo estranho. A intensa presença de infiltrado linfoplasmocítico, circundando fragmentos de
42 material cristalóide representa o processo de reabsorção do ácido polilático, o qual foi circundado pela formação de fibrose acentuada e deposição de colágeno (Figura 3).
Os resultados obtidos com as próteses de PMMA concordam com MORAIS (2007) quanto à observação de que esse material apresenta características biotoleráveis e que produz pouca reação celular. Por se tratar de um material inabsorvível permanecerá sempre como uma prótese, mesmo que isolada por tecido fibroso. Porém no presente estudo, verificou-se neoformação óssea em três animais deste grupo avaliados em cada um dos períodos de biópsia: 30 dias (Figura 2a), 60 dias (Figura 2b) e 120 dias (Figura 2c). Desta forma, verificou-se a ocorrência de melhor associação desta prótese ao organismo receptor.
As próteses de PLA apresentaram menor resistência à implantação, verificando- se os mesmos achados de MESSIAS (2009). Essa implantação caracteriza-se por intensa reação celular devido à mobilização ocasionada pelo processo de absorção do material. Esse material não produziu os resultados descritos na literatura (MESSIAS, 2009), relacionados à capacidade de osteo-integração, porém induziu a formação de intensa fibrose com deposição acentuada de colágeno, condição que indica processo de encapsulamento.
A utilização de próteses constituídas por materiais diferentes está relacionada diretamente à característica de biocompatibilidade de cada material. No presente estudo, o primeiro material proposto para utilização no grupo I (PMMA) possui características de inabsorção e biotolerância. Este, teoricamente promoveria baixa reação tecidual, sendo encapsulado e permanecendo como uma prótese por tempo indeterminado.
O material proposto para utilização no grupo II (PLA) possui características de bioabsorção e osteointegração ao tecido do receptor, condição que, teoricamente promoveria formação de novo tecido ósseo sobre o material da prótese a ser aplicada em
43 substituição a um segmento de costela, porém não foi observada esta substituição nos tempos propostos neste estudo.
CONCLUSÕES
Em vista dos resultados obtidos no período de 390 dias de avaliação, conclui-se que:
A aplicação experimental do modelo de prótese segmentar, intercortical de costela, em substituição à porção média da 6a costela esquerda de cães produz resultado clínico, funcional e estético adequado na implantação;
Tanto as próteses de polimetilmetacrilato (PMMA) como a de ácido polilático (PLA) são envolvidas por tecido fibroso com tendência a encapsulamento do primeiro e reabsorção do segundo, com proliferação fibrosa;
A toracoscopia paraxifóide transdiafragmática é adequada para avaliações intratorácicas em cães após implantação experimental de prótese única de costela, permitindo a visualização e avaliação de órgãos e parede costal no hemitórax abordado.