O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense com o N° 263/12 (Anexo 1).
4.1 LOCAIS DE DESENVOLVIMENTO DO ESTUDO
A colheita das amostras foi realizada em uma propriedade de exploração leiteira localizada no município de Cachoeiras de Macacu, RJ.
As etapas de cultivo bacteriológico, coloração de Ziehl-Neelsen e PCR para identificação dos isolados foram realizadas no Laboratório de Micobactérias do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo Góes (IMPPG), do Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
O ELISA indireto com proteínas recombinantes foi realizado no Laboratório de Diagnóstico Molecular e Imunológico (LADD) do IMPPG-CCS-UFRJ.
A PCR de tecidos e de leite foi realizada no Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Biologia Molecular, do Departamento de Alimentos e Nutrição, Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT).
4.2 ANIMAIS ESTUDADOS
Um rebanho leiteiro misto constituído de 77 bovinos mestiços (Holandês-Gir) com idade acima de seis meses a 19 anos e 21 bubalinos mestiços (Murrah- Mediterrâneo) com idade entre seis meses e quatro anos, foi investigado para
tuberculose bovina utilizando o TCC (Teste Cervical Comparativo), ELISA, cultura e PCR de tecidos (pulmão, linfonodos mediastínico e traqueobrônquico), e de leite.
No último TTI aplicado em todo o rebanho antes do início do surto nenhum animal apresentou reação positiva ao PPD bovino. No entanto, após a aquisição e introdução de 43 vacas em outubro de 2009, animais reatores positivos e inconclusivos foram detectados nos testes tuberculínicos subsequentes. A propriedade utiliza o sistema de criação semi-intensivo. Os animais são classificados nos seguintes lotes: 1 - Vacas em lactação; 2 - Vacas secas; 3 - Vacas no pré-parto; 4 - Bezerras fêmeas; 5 - Bezerros machos; 6 - Animais lactantes (com bezerreiro e pasto próprio). Os búfalos eram mantidos em pasto próprio sem contato com os bovinos. Somente usavam o mesmo curral onde era feito o manejo nas ocasiões de exames e aplicação de vacinas. A identificação dos animais era feita por ordem numérica de entrada no rebanho. Os bovinos eram marcados por brincos de cor azul e os bubalinos de cor amarela.
Quanto ao manejo nutricional empregado, os animais alimentavam-se de pasto [piquetes formados basicamente de capim Suázi (Digitaria swazilandensis) e braquiárias (Brachiaria decumbens)] e capim cultivado [duas capineiras de capim elefante (Pennisetum purpureum), sendo uma de três hectares e a outra de um hectare]. No momento da ordenha recebiam ração comercial em cochos individuais, a quantidade variava de acordo com a produção leiteira (um a dois Kg por animal em cada ordenha). O sal mineral era fornecido livremente no cocho coletivo durante a ordenha. A alimentação era suplementada com uma mistura de cevada, cana e capim elefante picado. Estes eram oferecidos aos animais em cocho coletivo na saída da sala de ordenha. O fornecimento de água é realizado por meio de bebedouros com água vinda de nascentes da própria fazenda e sem tratamento prévio.
O estado nutricional dos animais deste rebanho era considerado regular a bom. A produção leiteira era de aproximadamente 280 litros/dia (ordenha mecânica) e se destinava a cooperativa da região. Os animais recém-nascidos eram apartados das mães logo após a ingestão do colostro. Na semana subsequente, os bezerros eram mantidos no bezerreiro. O leite das mães era ordenhado manualmente no balde e fornecido aos respectivos bezerros em mamadeiras. Após o período necessário para que o leite adquirisse suas características normais (cerca de uma semana), a vaca passava a linha de ordenha mecânica e o bezerro começava a
receber na mamadeira o “pool” de leite de todas as vacas. O leite era extraído do tambor de captação no final da ordenha.
O manejo sanitário incluía o controle de verminoses, usava-se uma amostragem de 10% dos animais do rebanho. Quando o resultado apresentava um valor superior a 500 a vermifugação era indicada, raramente foi necessário o uso de anti-helmínticos. O controle de mastite era feito com frequência mensal por meio do “California Mastitis Test” (CMT), as amostras com resultado acima de duas cruzes (indicação de mastite clínica) eram submetidas à cultura e antibiograma. O esquema de vacinação dos bovinos e bubalinos incluía as doenças Febre Aftosa (duas vezes por ano durante as campanhas), Brucelose com vacina B19 em dose única de fêmeas com idade entre três a oito meses e Raiva (duas vezes por ano). Durante o período de realização deste estudo os animais foram testados regularmente para tuberculose, aplicando-se o TCC com intervalo aproximado de quatro meses. Não havia sistema de quarentena para animais recém-adquiridos. A limpeza do curral e sala de ordenha era feita diariamente com o uso de água e detergente. O acabamento de piso cimentado facilita a retirada de fezes e escoamento de urina. Não havia uma rotina de desinfecção destas instalações citadas. A assistência Médico-Veterinária é permanente.
O leite de vacas TCC-positivo era sempre descartado e os animais abatidos. O leite de vacas TCC-inconclusivo foi utilizado para alimentação de bezerros no primeiro exame do estudo (janeiro/2011), mas nos exames subsequentes as vacas foram secas e separadas do rebanho leiteiro.
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este experimento foi conduzido no período de janeiro de 2011 a junho de 2012 após a constatação do surto de tuberculose bovina em um rebanho misto abrangendo bovinos e bubalinos.
Inicialmente foi realizado o Teste Cervical Comparativo em todos os animais do rebanho. No mesmo dia da injeção dos PPDs, amostras de sangue foram colhidas para o ELISA. Paralelamente, amostras de leite foram colhidas para cultura bacteriológica e PCR.
Os animais positivos e inconclusivos ao TCC foram abatidos 30 dias após a realização do teste. Durante a necropsia foram colhidos os linfonodos mediastínico (M), traqueobrônquico (T) e fragmentos de pulmão (P). As amostras de tecidos de cada animal foram divididas em duas partes e processadas para cultura e PCR. A partir dos resultados dos testes confirmatórios (PCR e cultura) foi organizado um painel separando os soros em três grupos: