FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)
CARLOS ZARDEN FEITOSA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO USO DE ANTÍGENOS RECOMBINANTES PARA O DIAGNÓSTICO HUMORAL DA TUBERCULOSE EM BOVINOS E BUBALINOS
NITERÓI 2013
AVALIAÇÃO DO USO DE ANTÍGENOS RECOMBINANTES PARA O DIAGNÓSTICO HUMORAL DA TUBERCULOSE EM BOVINOS E BUBALINOS
Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM Coorientadora: Dra. CARLA DRAY MARASSI
Niterói 2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Medicina Veterinária. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal.
humoral da tuberculose em bovinos e bubalinos / Carlos Zarden Feitosa de Oliveira; orientador Walter Lilenbaum — 2013.
117 f.
Tese (Doutorado em Clínica e Reprodução Animal) — Universidade Federal Fluminense, 2013.
Orientador: Walter Lilenbaum
1. Doenças do bovino. 2. Tuberculose bovina. 3. Búfalo. 4. Mycobacterium bovis. 5. Elisa. I. Título.
AVALIAÇÃO DO USO DE ANTÍGENOS RECOMBINANTES PARA O DIAGNÓSTICO HUMORAL DA TUBERCULOSE EM BOVINOS E BUBALINOS
Aprovado em 23 de outubro de 2013.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________ Prof. Dr. Walter Lilenbaum / UFF
_________________________________________________________ Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão / UFF
__________________________________________________________ Prof. Dr. Walter Martin Roland Oelemann / UFRJ
__________________________________________________________ Prof. Dr. Carlos Adam Conte Júnior / UFF
__________________________________________________________ Profa. Dra. Lio Moreira / UNIRIO
Niterói 2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Medicina Veterinária. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal.
dedicação, humildade, paciência, incentivo, apoio e amor.
Aos meus irmãos, Charles Feitosa e Salomão Júnior por terem me mostrado a
importância da perseverança nos objetivos e por todo apoio.
À minha amada esposa Tamara Fejolo e minha querida filha Sofia Zarden, pela
paciência, compreensão, companheirismo, cuidado, carinho, por todos os momentos de alegria e tristeza vividos juntos, por terem tornado mais leve a caminhada deste doutorado, com amor.
À Deus pelo dom da vida e por tornar nossa existência significativa.
Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, pela oportunidade de tê-lo como orientador,
pelos seus conhecimentos científicos e por me trazer uma nova visão da carreira acadêmica.
À minha coorientadora, Dra. Carla Dray Marassi pelo companheirismo,
amizade, senso de equipe, liderança, sabedoria, pelos ensinamentos e sugestões fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho, meu profundo respeito e admiração, mais “brightness” em sua vida sempre!
Agradeço a todos os meus amigos do Laboratório de Bacteriologia Veterinária, em especial à Ana Paula, Ariel Director, Bruno Penna, Dênis Otaka, Gabriel Martins e Stéphan Galvão pelo apoio nas colheitas, compartilhamento de
experiências, convivência sempre agradável e criativa.
Aos parceiros colaboradores do Projeto Avaliação de Novos Métodos de Diagnóstico no Monitoramento da Tuberculose Bovina no Brasil, Prof. Dr. Eduardo Eustáquio S. Figueiredo do Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT), Prof. Dr. Rafael Silva Duarte e Dra. Ana Carolina da Silva Carvalho do Laboratório de Micobactérias da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Prof. Dr. Walter Martin Roland Oelemann, do Laboratório de Diagnóstico Molecular e Imunológico da UFRJ e ao Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin do Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), pela contribuição e participação imprescindível na realização deste trabalho. Muito obrigado!
A todos os funcionários e ao diretor da Fazenda Escola da Universidade Federal Fluminense (UFF), Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão, pela presteza,
cultura bacteriológica deste trabalho.
AoDr. Guilherme Nunes de Souza (Embrapa Gado de Leite - CNPGL), pelo
auxílio na análise dos dados.
Aos docentes do Departamento de Morfofisiologia Veterinária e ao Conselho Departamental do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí (UFPI), na pessoa do seu Diretor, Prof. Dr. Willams Costa Neves, pelo apoio no
afastamento em tempo integral para a realização do doutorado.
A todos os docentes, colegas e secretários do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução animal) da UFF, respectivamente, pelos ensinamentos, convivência ao longo desta importante etapa de nossas vidas e por serem prestativos e atenciosos. Em especial à coordenadora Profa. Dra. Ana Maria Reis Ferreira por toda assistência ao longo do curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação de Apoio e Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo suporte financeiro para a realização deste projeto.
A CAPES pela concessão de bolsa através do Programa Prodoutoral e Demanda Social.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste sonho, os meus eternos e sinceros agradecimentos.
A tuberculose bovina (TBov) causada por Mycobacterium bovis, é uma doença infecciosa de evolução crônica que determina prejuízos à pecuária e riscos à saúde pública. Embora o teste tuberculínico intradérmico (TTI) seja o método clássico amplamente utilizado para a detecção da TBov, outros ensaios têm sido desenvolvidos para complementar o diagnóstico e facilitar o controle desta doença. O objetivo principal do presente estudo foi avaliar três diferentes proteínas recombinantes de M. bovis - MPB70, MPB83 e ESAT-6, usadas separadamente como antígenos de captura em um ELISA indireto para o diagnóstico humoral da TBov. Um total de 77 bovinos (Holandês-Gir) e 21 bubalinos (Murrah-Mediterrâneo) de um rebanho leiteiro misto com um surto de TBov, localizado em Cachoeiras de Macacu, RJ foi investigado utilizando o Teste Cervical Comparativo (TCC), ELISA, cultura e PCR de tecidos (pulmão, linfonodos mediastínico e traqueobrônquico), e de leite. Dos 77 bovinos testados, 19 (24,7%) foram positivo e 11 (14,3%) TCC-inconclusivo. Entre os bubalinos, quatro (19%) de 21 animais foram TCC-positivo e um TCC-inconclusivo. Os animais positivos e inconclusivos no TCC foram abatidos e necropsiados. Das oito amostras de leite colhidas de oito vacas TCC-negativo processadas para cultura e PCR, cinco foram positivas para M. bovis. Considerando os métodos diretos (cultura e PCR de tecidos e/ou de leite) a infecção foi confirmada em 40,3% (31/77) dos bovinos e 23,8% (cinco/21) dos bubalinos. Trinta amostras de soros de bovinos deste rebanho confirmados infectados por PCR e/ou cultura e 30 amostras de soros de bovinos provenientes de rebanhos livres de TBov foram testados pelo ELISA. Segundo a análise da curva ROC, ELISAs MPB70, MPB83 e ESAT-6 apresentaram acurácia, sensibilidade e especificidade de 65%, 40% e 96,7%; 58,3%, 23,3% e 96,7%; 53,3%, 10% e 96,7%, respectivamente. As áreas sob as curvas dos ELISAs MPB70 e MPB83 foram semelhantes (P>0,05). O mesmo resultado foi obtido pelo teste de McNemar comparando MPB83 e ESAT-6 (P=0,179). Contudo, ESAT-6 não se mostrou comparável ao ELISA-MPB70 (P=0,003). Adicionalmente, investigou-se a influência do teste intradérmico nos resultados dos ELISAs MPB70 e MPB83. Para esta análise foram obtidas amostras de soros de 51 bovinos deste rebanho em cinco momentos distintos a partir da inoculação das tuberculinas, sendo 46 animais TCC-negativo e cinco TCC-negativo infectados por M. bovis. Embora o TCC não tenha interferido nos ELISAs, ambas as proteínas apresentaram desempenhos diferentes sobre os grupos testados (P<0,001). Além disso, os valores médios de densidade óptica (DO) dos animais TCC-negativo infectados foram mais altos do que em animais TCC-negativo não infectados (MPB70 P=0,0001; MPB83 P=0,002). Ao testar os soros dos 21 búfalos, cinco (23,8%) foram sororeativos para ELISA-MPB70 incluindo um animal TCC-negativo que foi posteriormente confirmado infectado por M. bovis. Nenhuma das 21 amostras de soros de búfalos testadas foi reativa para ELISA-MPB83. Em conclusão, as proteínas recombinantes MPB70, MPB83 e ESAT-6 não foram adequadas para realizar um diagnóstico precoce da TBov em uma situação de surto.
Palavras-chave: Tuberculose bovina, tuberculose em búfalos, Mycobacterium bovis,
Bovine tuberculosis (TBov) is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium bovis with a great impact on public health and also producing economic losses for producers. Although the intradermal tuberculin injection (ITT) is broadly used for diagnosis, other methods have been developed for improving the controlling of the disease. The main purpose of this study was evaluate an ELISA using separately three different recombinant proteins from M. bovis – MPB70, MPB83 and ESAT6 -as capture antigens. Tests were performed on a mixed herd of bovine and buffaloes naturally infected. Additionally, the study evaluated the ITT influence on MPB70/MPB83-ELISA results on this herd. A total of 77 Holstein adult bovines and 21 buffaloes (Mediterranean-Murrah) from a mixed dairy herd was evaluated after a history of a Tbov outbreak. Herd was located in Cachoeiras do Macacu, Rio de Janeiro. Animals were tested by comparative intradermal tuberculin test (CITT), ELISA, culture and PCR from milk, and culture and PCR from tissues (lungs, mediastinic and tracheobronchial lymph nodes) after necropsy of positive-CITT animals. From the 77 animals tested, nineteen (24.7%) reacted to CITT and 11(14.3%) was inconclusive to this test. Infection was confirmed by direct methods (culture and/or PCR) on 31 cows (41.3%) and five (23.8%) buffaloes. Milk was sampled from the milking cows of the herd for culture and PCR analysis. From these samples, M. bovis was detected from five animals that were CITT-negative. MPB70-ELISA tested 30 sera samples from infected cows of this herd and 30 sera from negative animals from certified herds with no tuberculosis history in the past five years, achieving 65% of accuracy; sensitivity (Se) was 40% and 96.7% of specificity (Sp). MPB83-ELISA tested the same population presenting 58.3% of accuracy, 23.3% and 96.7% of Se and Sp, respectively. The accuracy of the ESAT6-ELISA was 53.3%, Se was 10% while Sp was 96.7%. Area under curve (AUC) of both MPB70 and MPB83 ELISAs were statistically comparable (P>0.05). Same result was achieved by the McNemar’s test comparing MPB83 and ESAT-6 (P=0.179). Nevertheless, ESAT-6 and MPB70 were significant different (P=0.003). Sera were collected from 51 cows CITT-negative of the herd in five different moments to demonstrate any influence of the Purified Protein Derivative (PPD) injection on MPB70/83 ELISA results. Although PPD did not seem to interfere on ELISAs, both proteins present different performance on these animals (P<0.001). Besides of this, average ODs of infected animals CITT-negative were greater than the ODs from the CITT-negative animals (MPB70 P=0.0001; MPB83 P=0.002). When testing buffaloes, MPB70-ELISA reacted to five (23.8%) of them, including an anergic one, that was CITT-negative but confirmed as infected by bacterial culture. MPB83-ELISA did not react to any of the tested buffaloes from this herd. In conclusion, recombinants proteins MPB70, MPB83 and ESAT6 were not adequate to perform an early diagnosis of bovine tuberculosis in an outbreak situation.
Keynotes: bovine tuberculosis, buffalo tuberculosis, Mycobacterium bovis, MPB70,
1INTRODUÇÃO, p. 1 2FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p. 3 2.1 DEFINIÇÃO, p. 3 2.2 ETIOLOGIA, p. 3 2.2.1 Características gerais, p. 3 2.2.2 Classificação, p. 5
2.2.3 Proteínas antigênicas de Mycobacterium bovis, p. 6
2.3 EPIDEMIOLOGIA: OCORRÊNCIA NO MUNDO E NO BRASIL, p. 10 2.4 IMPORTÂNCIA EM VETERINÁRIA E FATORES DE RISCO, p. 12 2.5 IMPORTÂNCIA EM SAÚDE PÚBLICA, p. 13
2.5.1 Tuberculose humana, p. 13 2.5.2 Tuberculose zoonótica, p. 14
2.6 TRANSMISSÃO, p. 16
2.7 PATOGÊNESE E RESPOSTA IMUNE, p. 18
2.7.1 Interação de M. bovis com o sistema imune, p. 19
2.8 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS, p. 22 2.9 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO, p. 23
2.9.1. Métodos de Diagnóstico Direto, p. 23
2.9.1.1 Diagnóstico Anatomopatológico, p. 23 2.9.1.2 Diagnóstico Histopatológico, p. 25 2.9.1.3 Baciloscopia, p. 25
2.9.1.4 Cultura bacteriológica, p. 26 2.9.1.5 Diagnóstico molecular, p. 27
2.9.2. Métodos de Diagnóstico Indireto, p. 30
2.9.2.3 Diagnóstico sorológico, p. 35 2.10 CONTROLE E PREVENÇÃO, p. 41 2.11 TUBERCULOSE EM BUBALINOS, p. 43 3OBJETIVOS, p. 45 3.1 OBJETIVO GERAL, p. 45 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 45 4MATERIAL E MÉTODOS, p. 46
4.1 LOCAIS DE DESENVOLVIMENTO DO ESTUDO, p. 46 4.2 ANIMAIS ESTUDADOS, p. 46
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL, p. 48
4.4 TESTE TUBERCULÍNICO INTRADÉRMICO, p. 50 4.5 COLHEITA E PREPARO DAS AMOSTRAS, p. 51 4.6 CULTIVO BACTERIOLÓGICO, p. 53
4.7 PCR DE CULTURA, TECIDOS E LEITE, p. 54
4.8 ELISA INDIRETO COM PROTEÍNAS RECOMBINANTES, p. 56 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 57
5RESULTADOS, p. 58
5.1 TESTE CERVICAL COMPARATIVO E EVOLUÇÃO DO SURTO, p. 58 5.2 CULTURA BACTERIOLÓGICA E PCR DE TECIDOS BOVINOS, p. 59 5.3 CULTURA BACTERIOLÓGICA E PCR DE LEITE, p. 60
5.4 ELISAS INDIRETOS COM ANTÍGENOS RECOMBINANTES PARA O DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE EM BOVINOS, p. 63
5.5 COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DO ELISA INDIRETO COM PROTEÍNAS RECOMBINANTES E O TESTE INTRADÉRMICO EM BOVINOS, p. 68 5.6 EFEITO DO TESTE CERVICAL COMPARATIVO SOBRE A RESPOSTA HUMORAL, p. 69
5.7 CULTURA BACTERIOLÓGICA E PCR DE TECIDOS DE BUBALINOS, p. 72 5.8 ELISAS INDIRETOS COM MPB70 E MPB83 PARA O DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE EM BUBALINOS, p. 72
6DISCUSSÃO, p. 74
7CONCLUSÃO, p. 85
8REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 86
Figura 1 Mapa de distribuição da Tuberculose bovina no mundo, indicando a presença ou ausência da doença, reportados no período de julho a dezembro de 2012, p. 11.
Figura 2 Representação esquemática do espectro de resposta do sistema imune bovino após a infecção por Mycobacterium bovis, p. 22.
Figura 3 Sequência das etapas incluídas no estudo, p. 50.
Figura 4 Ilustração dos géis de eletroforese obtidos correspondentes à amplificação das sequências RvD1Rv2031c (500 pb) e IS6110 (245 pb), p. 62.
Figura 5 Curvas ROC dos ELISAs indiretos com as proteínas recombinantes MPB70, MPB83 e ESAT-6. Foram analisados soros de 30 bovinos confirmados infectados por M. bovis pela PCR e/ou cultura bacteriológica, e soros de 30 bovinos provenientes de rebanhos livres de tuberculose bovina, p. 64.
Figura 6 Curvas ROC sobrepostas dos ELISAs indiretos com as proteínas recombinantes MPB70, MPB83 e ESAT-6. Foram analisados soros de 30 bovinos confirmados infectados por M. bovis pela PCR e/ou cultura bacteriológica, e soros de 30 bovinos provenientes de rebanhos livres de tuberculose bovina, p. 65.
e MPB83 para detecção de IgG em soros de 30 soros bovinos naturalmente infectados por M. bovis (Grupo 1) (TB+) e soros de 30
bovinos negativos provenientes de rebanhos livres de tuberculose bovina (Grupo 3) (TB-), p. 66.
Figura 8 Valores médios de densidade óptica (DO) em cada momento dos ELISAs MPB70 e MPB83 de 46 bovinos TCC (-) e cinco bovinos TCC (-)/MD (+); pontos de corte: MPB70 = 0,21; MPB83 = 0,25, p. 71.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Resultados obtidos de estudos feitos no Brasil em termos de números e porcentagem de casos humanos de tuberculose devido a Mycobacterium bovis, em relação ao número total de isolados do complexo M. tuberculosis obtidos e analisados, p. 15.
Quadro 2 Sensibilidade e Especificidade do ELISA indireto com diferentes antígenos de Mycobacterium bovis no diagnóstico da tuberculose bovina, p. 37.
Quadro 3 Interpretação do Teste Cervical Comparativo (TCC) em bovinos, p. 51.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Total de bovinos e búfalos com resultado positivo e inconclusivo em três momentos de realização do Teste Cervical Comparativo (TCC) no ano de 2011, procedentes de um rebanho leiteiro misto localizado no município de Cachoeiras de Macacu, RJ, p. 59.
Tabela 2 Relação entre o Teste Cervical Comparativo (TCC) e a detecção direta post mortem de Mycobacterium bovis (PCR e cultura bacteriológica) de 29 bovinos infectados, p. 60.
Mycobacterium bovis (PCR e cultura bacteriológica) de amostras de leite e PCR de tecidos obtidos de oito vacas procedentes de um rebanho naturalmente infectado, localizado no município de Cachoeiras de Macacu, RJ, p. 61.
Tabela 4 Variações mínima e máxima, e média das leituras de densidade óptica (DO) obtidas nos ELISAs indiretos com as proteínas recombinantes MPB70, MPB83 e ESAT-6, p. 67.
Tabela 5 Resultados de sensibilidade, especificidade, acurácia, área sob a curva, “Likelihood ratio” positivo e negativo para os ELISAs MPB70, MPB83 e ESAT-6, p. 67.
Tabela 6 Associação de resultados dos ELISAs MPB70, MPB83 e ESAT-6 com o Teste Cervical Comparativo (TCC) de 65 bovinos (18 TCC-positivo e 47 TCC-negativo), p. 68.
Tabela 7 Número de amostras sororreativas (uma para cada animal) de acordo com os ELISAs MPB70/MPB83 nos cinco diferentes momentos dos testes em animais TCC-negativo e TCC-negativo infectados com M. bovis, p. 70.
Tabela 8 Resultados dos testes de quatro búfalos positivos, um inconclusivo e um negativo ao Teste Cervical Comparativo (TCC) infectados por Mycobacterium bovis, p. 72
Ag Antígeno
AUC Área sob a curva (“Area under curve”) BAAR Bacilo álcool-ácido resistente
BCG Bacilo de Calmette-Guérin
CFP Proteína do filtrado de cultura (“Culture Filtrate Protein”)
Curva ROC Curva de característica operacional do receptor (“Receiver-Operating Characteristic”)
Cut-off Ponto de corte
DC Célula dendrítica
DNA Ácido desoxirribonucléico
DO Densidade óptica
EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético
ELISA Ensaio de imunoadsorção enzimática (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”)
ESAT-6 Antígeno de secreção primária de 6 kDa (“Early Secreted Antigenic Target”) g grama ºC Grau Celsius IFN- Interferon-gama IgG Imunoglobulina G IL Interleucina
IMC Imunidade mediada por células IS Sequência de inserção
kDa Kilodalton
Kg Quilograma
LJ Löwestein-Jensen
MHC Complexo principal de histocompatibilidade (“Major Histocompatibility Complex”)
µg micrograma
µL microlitro
mg miligrama
mL mililitro
mm milímetro
mM milimolar
M. bovis Mycobacterium bovis
MPB64 Proteína de M. bovis de 24 kDa (“M. bovis 24 kDa protein”) MPB70 Proteína de M. bovis de 22 kDa (“M. bovis 22 kDa protein”) MPB83 Proteína de M. bovis de 26 kDa (“M. bovis 26 kDa protein”) MTB Mycobacterium tuberculosis
NK “Natural Killer”
OIE Organização Mundial da Saúde Animal (“World Organisation for Animal Health”)
OMS Organização Mundial da Saúde
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da polimerase (“Polymerase chain reaction”) PPD Derivado Protéico Purificado (“Purified Protein Derivative”)
® Marca registrada
TACO Molécula de proteína contendo triptofano-aspartato (“Tryptophane-Aspartate-Containing Coat Protein”)
TB Tuberculose
TBov Tuberculose bovina TBZ Tuberculose zoonótica TCC Teste Cervical Comparativo
TCD4+ Linfócito T com conjunto de diferenciação celular 4 expresso TCD8+ Linfócito T com conjunto de diferenciação celular 8 expresso TCS Teste Cervical Simples
Th Linfócito T auxiliar (“helper”)
TLR Receptor de célula T (“Tool-like receptor”)
TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa (“Tumor necrosis fator-alpha”) TPC Teste da Prega Caudal
TTI Teste Tuberculínico Intradérmico
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose bovina (TBov) causada por Mycobacterium bovis (M. bovis), é uma zoonose de caráter crônico de importância para a pecuária mundial, representando uma das principais enfermidades dos rebanhos bovinos particularmente nos países em desenvolvimento, com sérias implicações para a produção e comercialização animal (SCHILLER et al., 2010).
Embora a pasteurização do leite e a inspeção de rotina da carne em matadouros tenham determinado uma grande queda das taxas de transmissão da doença dos bovinos para o homem, em alguns países africanos, entre 17 a 26% dos casos de tuberculose humana são causados por M. bovis (MÜLLER et al., 2013). Assim, a permanência ou re-emergência da TBov representa não somente prejuízos econômicos mas também um risco potencial à saúde pública.
No Brasil, o controle da TBov está baseado em políticas de teste-e-abate, usando a mensuração da reação de hipersensibilidade tardia ao derivado protéico purificado (PPD) de M. bovis (Teste Tuberculínico Intradérmico - TTI) como primeiro método diagnóstico (BRASIL, 2006). Este teste apresentou resultados eficazes na redução da incidência de animais infectados em países que conseguiram a erradicação da TBov com sua utilização (GOOD; DUIGNAN, 2011). Apesar do seu amplo uso, o teste intradérmico apresenta baixa acurácia diagnóstica e pode afetar a condição imunológica de animais submetidos à tuberculinizações repetidas em intervalos curtos (COAD et al., 2010). Em uma recente meta-análise do desempenho de testes para TBov, o Teste Cervical Comparativo (TCC) (com ambos PPD bovino e PPD aviário) teve uma sensibilidade (S) estimada de 56,8 a 67,5% e especificidade (E) de 99,2 a 99,8% (CLEGG et al., 2011a). Consequentemente, métodos imunodiagnósticos alternativos têm sido desenvolvidos a fim de melhorar a
capacidade de identificação de animais infectados com M. bovis e contribuir para a erradicação da doença.
A resposta imune contra infecções micobacterianas é predominantemente celular nos estágios iniciais da doença, posteriormente em casos avançados é complementada por uma resposta imune humoral (POLLOCK et al., 2005; WATERS et al., 2010). Deste modo, testes baseados em respostas de anticorpos podem aumentar o grau de detecção de animais infectados com M. bovis (WHELAN et al., 2011). Testes sorológicos podem também constituir uma alternativa para a triagem de rebanhos com tuberculose (SOUZA et al., 2012). ELISA (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”) tem sido particularmente indicados para a detecção de animais anérgicos, os quais representam um reservatório potencial da bactéria no rebanho (LILENBAUM et al., 2011). Além disso, apresenta vantagens logísticas e financeiras sobre os testes intradérmicos (WHELAN et al., 2010a). ELISA é rápido, simples e pode facilmente testar um grande número de amostras (MEDEIROS et al., 2010).
Avanços na descoberta de antígenos e tecnologias de imunoensaios têm facilitado o aperfeiçoamento destes testes (SCHILLER et al., 2010; STRAIN et al., 2011). A fim de evitar reações inespecíficas, proteínas purificadas ou recombinantes são empregadas como antígenos em ELISAs, com resultados encorajadores (WHELAN et al., 2008; FARIAS et al., 2012). No entanto, é evidente que para melhorar a sensibilidade do teste é necessário incluir antígenos adicionais que individualmente não são reconhecidos por todos os animais infectados (STRAIN et al., 2011).
As proteínas micobacterianas homólogas MPB70 e MPB83 são identificadas como antígenos imunodominantes e consistentemente reconhecidas em animais infectados por M. bovis (GREEN et al., 2009; WATERS et al., 2011a). ESAT-6, uma proteína secretada durante os estágios iniciais da infecção micobacteriana, tem sido usada como antígeno no diagnóstico e avaliada como um componente de vacinas contra a TBov (GANGULY et al., 2008).
Contudo, informações do potencial destes antígenos para o diagnóstico de campo da TBov em condições brasileiras e com acompanhamento de testes diretos definidos permanecem escassas.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 DEFINIÇÃO
A tuberculose bovina é uma doença infecciosa de evolução crônica progressiva, caracterizada pela formação de lesões granulomatosas com diferentes graus de necrose, calcificação e encapsulamento. Estas lesões se localizam com maior frequência nos pulmões, linfonodos associados à cavidade torácica e também da cabeça; entretanto, vários tecidos podem ser afetados. O principal agente etiológico, Mycobacterium bovis, possui uma das mais amplas cadeias de hospedeiros dos patógenos conhecidos incluindo animais domésticos, selvagens e o homem. A doença determina prejuízos econômicos significativos para a produção animal, risco potencial à saúde pública e é endêmica em vários países (RUSSI et al., 2009; MICHEL et al., 2010; CORNER et al., 2012).
2.2 ETIOLOGIA
2.2.1 Características gerais
As micobactérias são bacilos delgados, ligeiramente curvados a retos, apresentam tamanho médio de 0,3 a 0,6 micrômetros (µm) x 1,0 a 4,0 µm, aeróbias estritas, imóveis, não capsuladas, não produtoras de toxinas, sendo a maioria das espécies patogênicas intracelulares facultativas. Quanto à velocidade de crescimento em meios de cultura, as espécies são divididas em dois tipos: micobactérias de crescimento rápido (MCR), que evidenciam crescimento entre três
a cinco dias, como por exemplo, M. fortuitum e M. abscessus, e micobactérias de crescimento lento (MCL), que incluem a maioria das micobactérias patogênicas como M. bovis, estas requerem mais de sete dias para o crescimento. Micobactérias de crescimento lento tem tempo de geração longo entre 16 a 20 horas em condições favoráveis (37 °C e pH neutro) (FONSECA; SAAD, 2008; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; THOEN et al., 2009). O genoma de M. bovis foi completamente sequenciado, este possui 4.345.492 pares de bases (pb), um conteúdo de guanina mais citosina (G+C) no DNA genômico de 65,6%, 3.951 genes codificantes de proteínas, e seu polimorfismo é muito limitado comparado ao tamanho do genoma (GARNIER et al., 2003). Entretanto, algumas regiões são altamente polimórficas, devido a variações no número, posições e/ou na estrutura primária (GARCIA PELAYO et al., 2009).
São resistentes aos procedimentos convencionais de coloração e quando coradas com carbol-fucsina não podem ser descoradas por solução álcool-acidificada, e assim, classificadas como bacilos álcool-ácidos resistentes (BAAR). Essa característica reflete a grande quantidade de ácidos micólicos hidrofóbicos (ácidos graxos de cadeia longa contendo 60 a 90 atómos de carbono) presente na parede celular, correspondendo 50% do seu peso seco. A camada espessa de ácidos micólicos confere maior resistência à degradação intracelular de enzimas lisossomais (KLEINNIJENHUIS et al., 2011).
O envelope celular de micobactérias é composto pela membrana citoplasmática e uma parede complexa. A parede celular é constituída por uma camada interna de peptideoglicano (PG) e manosídeos fosfatidil-myo-inositol (PIM), estes conferem forma e integridade estrutural à bactéria. A camada de PG encontra-se covalentemente ligada a um polissacarídeo ramificado, a arabinogalactana, que é esterificada em sua porção externa com os ácidos micólicos. A camada externa é recoberta pela lipoarabinomanana-manosilada (MAN-LAM), lipomananas (LM) e glicoproteínas-manosiladas (KLEINNIJENHUIS et al., 2011).
Os glicolipídeos ou micosídeos do complexo micolilarabinogalactano, assim como as lipoarabinomananas são responsáveis pela indução da resposta inflamatória granulomatosa e resistência intracelular das micobactérias fagocitadas. Além disso, atuam na permeabilidade celular e resistência as substâncias desinfetantes. Os sulfolipídeos de trealose funcionam como evasinas da fusão fagolisossoma. Outros fatores bioquímicos atuam inibindo esta fusão no interior de macrófagos. A proteína de choque térmico α-cristalina de 16 kDa é conhecida por
ser essencial para a persistência micobacteriana durante a fase estacionária do crescimento. O fator corda ou dimicolato de trealose (TDM) é responsável pela forma agregada semelhante a cordões na qual as micobactérias se apresentam no meio de cultivo. É altamente imunogênico e favorece a inflamação crônica ocasionando formação granulomatosa nos pulmões (POLLOCK; NEILL, 2002; GOROCICA et al., 2005).
2.2.2 Classificação
Taxonomicamente, as micobactérias pertencem à classe Actinobacteria; ordem Actinomycetales, família Mycobacteriaceae e gênero Mycobacterium (SOLA et al., 2001). Segundo Euzéby (2013), até o momento, são conhecidas oficialmente 156 espécies e 13 subespécies no gênero, incluindo bactérias estritamente patogênicas, oportunistas e comensais ou saprófitas.
As espécies de Mycobacterium agentes de tuberculose foram agrupadas no Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB). Os membros desse complexo possuem extrema similaridade nucleotídica no genoma e sequências idênticas do rRNA 16S, mas diferem amplamente em termos de hospedeiros, fenótipo e virulência (ÁLVAREZ et al., 2009; DRISCOLL, 2009). Alguns membros do complexo MTB são patógenos predominantemente de humanos (M. tuberculosis, M. africanum e M. canettii), roedores (M. microti), mangusto (Mungos mungo) (M. mungi), caprinos e bovinos (M. caprae) e mamíferos marinhos (M. pinnipedii), enquanto outros têm um grande espectro de hospedeiros (M. bovis) (ALEXANDER et al., 2010; GOOD; DUIGNAN, 2011; PALMER; WATERS, 2011).
Mycobacterium tuberculosis e M. bovis são espécies fortemente relacionadas, surpreendentemente, a sequência do genoma de M. bovis é > 99,95% idêntica à de MTB. As diferenças entre elas correspondem a 11 deleções ocorridas no genoma de M. bovis (deleções de genes regulatórios, genes que codificam para proteínas secretoras e de parede celular), a polimorfismos núcleotídicos únicos (sequências de inserção móveis e/ou outros elementos repetitivos) e na expressão de genes relacionados ao metabolismo geral (GARNIER et al., 2003; HUARD et al., 2006).
O bacilo da tuberculose bovina foi isolado pela primeira vez em laboratório em 1901 por Robert Koch (INGRAM et al., 2010). Koch concluiu que existiam diferenças
entre o bacilo tuberculoso humano e bovino, comunicando esses achados no Congresso de Tuberculose em Londres (PALMER; WATERS, 2011).
Mycobacterium bovis é o principal agente causador da tuberculose em bovinos. Na Europa central, M. caprae é detectado comumente em vários países (PRODINGER et al., 2005). Mycobacterium tuberculosis tem sido isolado esporadicamente de lesões em bovinos abatidos e animais de zoológico na África (BERG et al., 2009), assim como de amostras clínicas (sangue e leite) de bovinos na Índia (SRIVASTAVA et al., 2008). Em raros casos os bovinos podem ser infectados com M. microti (SMITH et al., 2009) e M. africanum (RAHIM et al., 2007).
Entre as micobactérias não tuberculosas (MNT), as bactérias do complexo M. avium (M. intracellulare e M. avium avium, M. avium paratuberculosis e M. avium hominissuis) não são patogênicas para bovinos e bubalinos; exceto M. avium paratuberculosis que causa enterite crônica em ruminantes (Paratuberculose ou Doença de Jöhne) (WADHWA et al., 2012). Entretanto, espécies do complexo M. avium podem provocar reações inespecíficas à tuberculinização (BRASIL, 2006).
2.2.3 Proteínas antigênicas de Mycobacterium bovis
Durante o processo de infecção, tanto M. bovis quanto M. tuberculosis estão expostos a diferentes condições de estresse que incluem acidificação do pH da vesícula endocítica, exposição à formas tóxicas de oxigênio e restrição de nutrientes. Esses fatores fazem com que as micobactérias expressem proteínas que favoreçam a sua sobrevivência dentro do hospedeiro (GOLBY et al., 2007).
Várias pesquisas foram realizadas visando à caracterização de dois antígenos homólogos (>80%) citados como os principais antígenos expressos por M. bovis, que são MPB70 e MPB83 (McNAIR et al., 2001; WIKER, 2009).
MPB70 é uma proteína secretada de 22 kDa altamente solúvel e codificada pelo gene mpb70, originalmente foi isolada de M. bovis BCG, sub-tipo Tokyo (WIKER, 2009). Representa mais de 10% das proteínas secretadas de M. bovis quando cultivado em meio líquido (GARNIER et al., 2003). É um componente extremamente ativo e estável da tuberculina bovina e um dos antígenos imunodominantes de M. bovis, capaz de desencadear uma forte resposta de hipersensibilidade do tipo tardia, estimular a proliferação de linfócitos T e a produção
de anticorpos em animais infectados (KOO et al., 2005; WIKER, 2009). MPB70 induz a produção de IFN-, assim como a resposta do fator de necrose tumoral-α (TNF-α), os quais são considerados importantes citocinas mediadoras da proteção na infecção micobacteriana (AL-ATTIYAH et al., 2006). Em geral, a resposta de anticorpos contra MPB70 na infecção com M. bovis se desenvolve mais tardiamente (KOO et al., 2005; WIKER, 2009; SCHILLER et al., 2010).
MPB83 é uma glicolipoproteína de 26 kDa codificada pelo gene mpb83, associada à parede celular micobacteriana e encontrada em filtrados de cultura de M. bovis (LYASHCHENKO et al., 2004; WIKER, 2009). Assim como MPB70, estimula uma forte resposta imune protetora e está implicada na patogênese da tuberculose (CARR et al., 2003). MPB83 tem sido usado como antígeno no diagnóstico sorológico da TBov (AMADORI et al., 2002; WIKER, 2009). A resposta de anticorpos para esse antígeno foi observada precocemente com cerca de quatro semanas pós-infecção por M. bovis (McNAIR et al., 2001; WATERS et al., 2006a).
Tanto a proteína MPB70 quanto MPB83 são altamente expressos por cepas virulentas de M. bovis, mas a expressão destes antígenos em M. tuberculosis é reduzida (WIKER, 2009). Saiid-Salim e colaboradores (2006) demonstraram que mutações no gene Rv0444c que codifica o fator regulador anti-sigma K (sigK é um gene que regula positivamente a expressão de MPB70 e MPB83) seriam responsáveis pelos altos níveis de expressão dessas proteínas em M. bovis quando comparado aos diferentes membros do complexo M. tuberculosis. Já Carr e colaboradores (2003) sugeriram que MPB70 e MPB83 podem se ligar a uma ou mais proteínas da superfície de células hospedeiras via sítios identificados. Mudança no comportamento celular com vantagens para o patógeno ocorre possivelmente por modulação das vias de sinalização.
As proteínas MPB70 e MPB83 são os principais constituintes da tuberculina bovina (LYASHCHENKO et al., 2004). MPB70 foi um dos primeiros antígenos usados no diagnóstico humoral da tuberculose bovina (LIU et al., 2007). Junto com MPB83, estes antígenos estão entre os mais consistentemente reconhecidos em animais infectados com M. bovis (GREEN et al., 2009; WIKER, 2009). Lyashchenko e colaboradores (2008) demonstraram a utilidade de MPB70 para avaliar a importância epidemiológica de M. bovis em potenciais reservatórios selvagens.
Um grupo de antígenos de M. bovis afetado por deleções pertence à família ESAT-6 (“Early Secretory Antigen Target”). A proteína ESAT-6 de seis quilodaltons
(kDa) foi originalmente descrita como um potente antígeno (Ag) de células T, secretada por M. tuberculosis na primeira fase da infecção. No total, mais de 20 proteínas fazem parte desta família que contém outros antígenos de células T como a CFP-10 de 10 kDa (“Culture Filtrate Protein”) e CFP-7 (GARNIER et al., 2003).
A RD1 (Região de Diferença) é uma região do genoma micobacteriano responsável por codificar fatores intrínsecos à virulência micobacteriana e é composta por nove genes (Rv3871 a Rv3879c). Esta região é responsável pela codificação das proteínas secretórias ESAT-6 (Rv3875 também conhecido como esxA) e CFP-10 (Rv3874 também conhecido como exsB). Estas proteínas são consideradas de alta imunogenicidade, estão envolvidas na virulência e patogênese micobacteriana, induzindo a produção de interferon- (IFN-) e a resposta humoral nos estágios iniciais da infecção por M. bovis (POLLOCK; ANDERSEN, 1997; KOO et al., 2005; GANGULY et al., 2008). Alguns estudos concluíram que ESAT-6 e CFP-10 (usados individualmente ou como um coquetel de antígenos) são potentes candidatos para o diagnóstico precoce da TBov (KOO et al., 2005; PALMER; WATERS, 2006; VORDERMEIER et al., 2011).
Foi observado que RD1 estava ausente em todas as cepas estudadas da vacina BCG (bacilo de Calmette-Guérin), mas estava presente e expressa em todos os membros virulentos do complexo MTB, indicando que deleções neste locus contribuíram para a atenuação da virulência do bacilo (BRODIN et al., 2004). Por causa da perda destes genes, as proteínas codificadas nesta região receberam atenção crescente com potencial para uso no diagnóstico da tuberculose (AAGAARD et al., 2006).
Renshaw e colaboradores (2005) propuseram que ESAT-6 e CFP-10 formariam um heterodímero complexo na proporção de 1:1, induzindo a mudança de conformação de ambas as proteínas e que esta seria sua forma biológica ativa in vivo. As características de superfície do complexo, junto com a ligação observada na superfície de macrófagos e células dendríticas sugerem fortemente um papel-chave de sinalização, que conduz a uma modulação do comportamento da célula hospedeira para trazer vantagens ao patógeno (SINHA et al., 2007). Estas proteínas promovem a redução da produção de moléculas oxidativas reativas, levando ao aumento da atividade de fosfatase nos macrófagos, culminando na desfosforilação de proteases ativas (BASU et al., 2006).
A proteína ESAT-6 pode ser reconhecida na superfície de macrófagos via ligação com o receptor TLR-2 (“Toll-like receptor”) e inibe a ativação de fatores de transcrição regulados por IFN-, isto contribui para a sobrevivência da bactéria durante apoptose nos macrófagos (GANGULY et al., 2008). Entretanto, um recente trabalho mostrou que ESAT-6 tem uma participação na indução de apoptose em células monocíticas, promovendo a formação de poros na membrana da célula infectada além de induzir a ativação de sinais inflamatórios (MISHRA et al., 2010).
Foi demonstrado que ESAT-6 dissociado do sistema de secreção CFP-10/ESAT-6 em pH ácido no interior do fagossomo, interage com lipossomos e causa a sua lise. Este mecanismo é crucial para o bacilo escapar da degradação fagolisossomal (DE JONGE et al., 2007). Além disso, ESAT-6 e CFP-10 podem induzir a translocação da micobactéria do fagossoma para o citosol em células dendríticas, resultando em um mecanismo de escape da resposta microbicida (VAN DER WEL et al., 2007) e na formação de granuloma (RENSHAW et al., 2005).
MPB64 é uma proteína de 24 kDa secretada durante o crescimento de M. tuberculosis e por algumas cepas de M. bovis BCG (BUDDLE et al., 1999). MPB64 é caracterizada por ser espécie-específica e pode ser purificada a partir de filtrados de cultura (CHO et al., 2009). Estimula a proliferação de linfócitos e resposta de IFN-
em bovinos infectados com M. bovis (RHODES et al., 2000). Resposta de IgG anti-MPB64 foram identificadas em bovinos infectados experimentalmente (LIGHTBODY et al., 1998; WATERS et al., 2006a) e em animais selvagens (LYASHCHENKO et al., 2008).
O complexo antígeno 85 (Ag85) é composto por proteínas da família micolil-transferase e compreende um grupo de proteínas secretadas altamente homólogas. Possui três componentes principais 85A (31 kDa), 85B (30kDa) e 85C (32kDa). Estão presentes em M. bovis, M. bovis BCG e M. tuberculosis (ROSSEELS et al., 2006; NOL et al., 2009). O Ag85 tem capacidade de ligação a fibronectina e possui importantes papéis na adesão, fagocitose e inflamação, assim como na síntese da parede celular micobacteriana (BENTLEY-HIBBERT et al., 1999). O complexo Ag85 é fortemente imunogênico, foi testado na forma de vacina de DNA (ácido desoxirribonucleico) visando impulsionar o efeito protetor da vacina BCG em cervídeos (NOL et al., 2009), e com o propósito de aplicação no diagnóstico humoral da TBov (LILENBAUM et al. 2001).
Pesquisando genes que codificam a expressão de proteínas antigênicas de parede celular, Rehren e colaboradores (2007) encontraram baixa expressão de genes da família PE-PGRS/PPE em M. bovis (somente três genes) comparados aos 18 genes identificados no bacilo humano. Genes destas famílias como rv3018c e rv3812 codificam proteínas expostas na parede celular e estão implicados na virulência influenciando a adesão de células Th1 (“helper”), modulação imune, manutenção da micobactéria dentro de macrófagos e na regulação da necessidade de íons ferro pela célula bacteriana (LE MOIGNE et al., 2005; CHAITRA et al., 2008).
2.3 EPIDEMIOLOGIA: OCORRÊNCIA NO MUNDO E NO BRASIL
A TBov permanece endêmica em vários países apesar dos muitos esforços realizados para o seu controle (HUMBLET et al., 2009; SCHILLER et al., 2010).
De acordo com a base de dados do sistema mundial de informação zoosanitária da OIE (Organização Mundial da Saúde Animal), no segundo semestre de 2012, 97 de 166 países membros notificaram a presença da infecção ou doença clínica por M. bovis em suas populações de animais domésticos e selvagens (Figura 1) (OIE, 2013a; OIE, 2013b).
Nos EUA, a prevalência da TBov diminuiu de 5% em 1917 para <0,001% em 2009. Entretanto, a erradicação permanece ainda não alcançada devido aos casos de TBov importados do México e a presença de reservatórios selvagens (SCHILLER et al., 2010). Na Europa em 2011, a TBov não foi detectada em 10 dos 15 países declarados oficialmente livres. Três dos 12 países não oficialmente livres não relataram rebanhos infectados. O Reino Unido tem as mais altas porcentagens de rebanhos positivos para TBov na Europa, Grã Bretanha (9,9%), Irlanda do Norte (6,45%) e Irlanda (4,31%). Desde 2008, a proporção total de rebanhos infectados no Reino Unido aumentou de 2,88% em 2008, para 9,06% em 2011. Na maioria dos outros países não oficialmente livres, a prevalência de rebanhos positivos em 2011 para TBov foi de 1,12%, permanecendo em níveis comparáveis ou reduzidos em relação a 2010 (EFSA, 2013).
Figura 1. Mapa de distribuição da tuberculose bovina no mundo, indicando a
presença ou ausência da doença, reportados no período de julho a dezembro de 2012.Fonte: WAHID “Interface” (OIE, 2013b).
Na Austrália, a prevalência de rebanhos com TBov entre 2005 e 2009 foi estimada em valores menores que 0,01% (AUSVET, 2010). A Nova Zelândia realizou um grande esforço ao longo de 18 anos para a erradicação da TBov. A prevalência de rebanhos foi reduzida de 2,4% em 1993 para 0,23% entre 2010 e 2011 (RYAN et al., 2006; AHB, 2011).
Existe uma considerável variação da prevalência da TBov e na cobertura de vigilância na América Latina e Caribe. Há evidências de que 70% dos sistemas de produção de bovinos estejam em áreas de alta prevalência de tuberculose. Os países que apresentam prevalência relativamente alta de TBov na América Latina são Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Equador, Peru e Guiana (América do Sul), Guatemala (América Central) e Haiti (Caribe) (DE KANTOR; RITACCO, 2006).
A caracterização epidemiológica da TBov no Brasil é muito precária (GRISI FILHO et al., 2011). Em um inquérito não muito recente, a estimativa da prevalência de rebanhos e de animais infectados foi de 7,1% e 0,83%, respectivamente. Nas regiões de produção de bovinos mais importantes (Centro-Oeste, Sudeste e Sul), as taxas de prevalência de animais reatores tiveram uma tendência menor (< 1%), quando comparadas as regiões Norte (3,62%) e Nordeste (3,31%) (ROXO, 2005).
Nenhuma informação Nunca reportado Não reportado no período Suspeito
Infecção / Infestação Doença clínica
Doença limitada a uma ou mais zonas Infecção / Infestação em uma ou mais zonas
2.4 IMPORTÂNCIA EM VETERINÁRIA E FATORES DE RISCO
A tuberculose bovina é uma doença listada (anteriormente Lista B) pela OIE, que designa as enfermidades transmissíveis consideradas importantes sob o ponto de vista socioeconômico e/ou sanitário nacional, e cujas repercussões no comércio internacional de animais e produtos de origem animal são consideráveis (OIE, 2013c).
Por suas características, quando animais tuberculosos são introduzidos em um rebanho sadio pode-se observar queda no ganho de peso, maior intervalo entre partos, produção de crias debilitadas, maior taxa de reposição no rebanho, eliminação de animais de alto valor zootécnico, desvalorização comercial por rejeição de carcaças, morte de animais, perda de credibilidade e do valor comercial da unidade de criação (ABRAHÃO et al., 2005; PACHECO et al., 2009). Estima-se que animais infectados percam de 10 a 25% de sua eficiência produtiva, excluindo as perdas de mortalidade (LILENBAUM et al., 2001).
A ocorrência da infecção no gado leiteiro tende a ser maior do que em bovinos de corte. Vacas leiteiras permanecem mais tempo em áreas fechadas ou em condições de grande aglomeração ao encontrar-se para a ordenha, o que aumenta o risco de exposição à infecção; além disso, a vida produtiva mais prolongada comparada aos bovinos de corte favorece a manutenção da doença no rebanho (AMENI et al., 2007; HUMBLET et al., 2009).
De acordo com Humblet e colaboradores (2009) os fatores de risco que influenciam a cadeia epidemiológica da tuberculose bovina mundialmente podem ser divididos em três níveis de classificação: 1. Animal: Fatores relacionados à idade,
raça, condição corporal, estado imune, resistência genética ou susceptibilidade a TBov, transmissão vertical e auto-contaminação; 2. Rebanho: Relacionados ao
histórico de surto de tuberculose, tamanho do rebanho e manejo, que inclui o sistema de criação, tratamento de dejetos, suplementação alimentar (importante na rota de transmissão oral), ausência de testes de diagnóstico, frequência dos testes intradérmicos, introdução de novos animais no rebanho, movimentação de animais dentro de ou entre propriedades e eventos, assistência veterinária e redução da manipulação humana, taxa de abate, contato com animais domésticos ou selvagens e persistência do agente no ambiente influenciado principalmente por fatores
climáticos; 3. Região/países: Prevalência da TBov e antecedentes na região ou
país, contiguidade com outros rebanhos restritos pela TBov, comércio internacional e movimentação de gado entre países vizinhos, migração internacional de pessoas e animais selvagens.
2.5 IMPORTÂNCIA EM SAÚDE PÚBLICA
2.5.1 Tuberculose humana
A tuberculose (TB) é uma das mais devastadoras doenças infecciosas de seres humanos, classificada como a segunda principal causa de morte por doença infecciosa no mundo, depois do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em 2011, estimou-se 8,8 milhões de novos casos (variação, 8,3 a 9,0 milhões), uma taxa de incidência média global de 128/100.000 habitantes/ano, e 1,4 milhões de mortes (30,7% co-infectados com o HIV) atribuídas à TB. A maioria dos casos estimados ocorreu na Ásia (59%) e África (26%), enquanto nas regiões do Mediterrâneo Oriental (7,7%), Europa (4,3%) e Américas (3%). O Brasil juntamente com outros 21 países em desenvolvimento, alberga 80% dos casos mundiais da doença. No ano de 2011, foram notificados 83.000 novos casos de tuberculose (coeficiente de incidência de 42 por 100.000 habitantes) (WHO, 2012).
A tuberculose humana é causada principalmente por M. tuberculosis (FSAI, 2008). A doença tipicamente afeta o pulmão (TB pulmonar), mas pode estar presente em outros tecidos como TB extrapulmonar. A doença é disseminada pelo ar quando pacientes com TB pulmonar eliminam a bactéria pela tosse (WHO, 2012). O quadro clínico não apresenta nenhum sinal ou sintoma característico. Observa-se, normalmente, comprometimento do estado geral, febre baixa vespertina com sudorese, inapetência e emagrecimento. Quando a doença atinge os pulmões, o indivíduo pode apresentar dor torácica e tosse produtiva, acompanhada ou não de escarros com sangue (BRASIL, 2011).
2.5.2 Tuberculose zoonótica
A tuberculose zoonótica (TBZ), como é chamada a infecção no homem determinada por M. bovis, pode ser transmitida por ingestão de alimentos oriundos de animais infectados, ou com menor frequência, pelo contato do agente com mucosas ou pele lesionada (DE LA RUA-DOMENECH, 2006b; INGRAM et al., 2010).
A TBZ assume um caráter de doença ocupacional, atingindo grupos de maior exposição à doença, como proprietários e tratadores de rebanho, veterinários e funcionários de matadouros em contato com animais ou carcaças infectadas. Contudo, sua ocorrência também é frequente em comunidades que consomem leite e produtos derivados (não pasteurizados ou fervidos), de rebanho bovino infectado (DORAN et al., 2009; MICHEL et al., 2010).
Existem evidências que apontam para a possibilidade de transmissão pessoa-a-pessoa das espécies zoonóticas de Mycobacterium, principalmente entre indivíduos imunossuprimidos (THOEN; LOBUE, 2007; EVANS et al., 2007; ETCHECHOURY et al., 2009).
A infecção humana causada por M. bovis é clínica, radiológica e patologicamente indistinguível da doença determinada por M. tuberculosis (EFSA, 2013). Entretanto, diferente da tuberculose característica em humanos, a apresentação extrapulmonar é muito frequente, principalmente devido à via de infecção oral (ANAELOM et al., 2010). As tendências globais na incidência de M. bovis em humanos diferem entre países desenvolvidos e não desenvolvidos. Dados de 61 países incluídos em um estudo recente sugerem uma incidência global baixa da doença. Em regiões fora da África as proporções médias de TB zoonótica foram menores que 1,4% (MÜLLER et al., 2013).
Em 2011, 132 casos confirmados de tuberculose humana devido a M. bovis foram relatados por 25 estados membros da União Européia. A maioria dos casos foi descrita na Alemanha, Reino Unido e Espanha (EFSA, 2013). Nos EUA, a proporção de tuberculose humana devido a M. bovis é de 1,4% (HLAVSA et al., 2008). Este quadro pode ser substancialmente diferente em outras regiões. Por exemplo, na maioria dos países da África a TBov é predominante e seu controle eficaz praticamente inexistente. A média de casos de TBZ na Etiópia, Nigéria e Tanzânia
foi de 17%, 15,4% e 26,1%, respectivamente (MÜLLER et al., 2013). Neste contexto, o impacto potencial na saúde humana e no fornecimento de alimentos levou a OMS a classificar a TBZ em 2005 como uma doença negligenciada (WHO, 2011).
De acordo com De Kantor e colaboradores (2008), o percentual de casos humanos notificados de TBZ em relação aos causados por M. tuberculosis, variou de zero a aproximadamente 2,5% em 10 países da América Latina. Recentemente, foi descrito os primeiros casos de TB pulmonar por M. bovis no Uruguai. Os três casos apresentaram diferentes exemplos de aquisição desta zoonose; o contato com animais infectados, a exposição em frigoríficos e a ingestão de leite não pasteurizado (RIVAS et al., 2012). No Brasil, a proporção de casos da TBZ em relação a TB é considerada desconhecida (OIE, 2013d). Embora a tuberculose bovina seja uma doença endêmica no Brasil, em estudos realizados nos últimos anos com o objetivo de estimar a importância do M. bovis na etiologia da tuberculose humana, raras vezes o agente foi identificado (Quadro 1).
Quadro 1. Resultados obtidos de estudos feitos no Brasil em termos de números e
porcentagem de casos humanos de tuberculose devido a Mycobacterium bovis, em relação ao número total de isolados do complexo M. tuberculosis obtidos e analisados.
Local Ano N° de casos ouisolados de TB M. bovisN° de (%) Métodos diretos Referência Adolfo Lutz, SP 2001 - 2002 5.617 casos 2 (0,04) Cultura, MB/BacT MGIT960 DE KANTOR et al., 2008
LACEN, RS 1997 - 2005 5.000 casos 0 Cultura,RFLP e
Spoligotyping
Hélio Fraga,
RJ 1996 - 2006 2.000 isolados 1 (0,05) Cultura
Hospital Universitário,
UFRJ, RJ 2005 - 2006 8.121 amostras57 isolados 0
Cultura, PCR Testes de sensibilidade SOBRAL et al. 2011 Hospital Universitário, UFRJ, RJ 2007 - 2008 1678 isolados 0 Cultura e
Em países industrializados, a infecção humana com M. bovis tem sido amplamente controlada pela pasteurização do leite, inspeção em matadouros e abate de animais reagentes (FSAI, 2008; EUROPEAN COMMISSION, 2009).
No Brasil, apesar da existência de um Plano Nacional de Erradicação, ainda é comum o abate clandestino e a comercialização de carne e derivados lácteos sem controle sanitário (ABRAÃO et al., 2005). Este fato se agrava ainda mais em regiões rurais com atividades agropecuárias de subsistência e em periferias de grandes metrópoles, o que representa uma constante ameaça à saúde pública (ROCHA et al., 2011). Não se pode negligenciar ainda que a ocorrência de M. bovis em humanos provavelmente permanece subestimada, pois a distinção de espécies de Mycobacterium, isto é, M. bovis e M. tuberculosis, não é realizada sistematicamente pelos laboratórios (HUMBLET et al., 2009).
2.6 TRANSMISSÃO
Existem várias formas pelas quais os bovinos podem se tornar infectados por M. bovis. Entretanto, aproximadamente 90% das infecções ocorrem pela via respiratória por meio da inalação de aerossóis contaminados, caracterizando esta rota como a mais importante e frequente da infecção bovina (ABRAHÃO et al., 2005; LIEBANA et al., 2008). A transmissão por aerossóis é eficiente somente em situações que permitam o contato direto próximo (< 2 metros), por isso a densidade de bovinos é um fator significativo na taxa de transmissão (SKUCE et al., 2011).
Os animais também podem se infectar pela via oral por ingestão de pasto, silagem, água contaminada com urina, material fecal ou exsudatos de animais doentes (PHILLIPS et al., 2003; MICHEL et al., 2007). A transmissão vertical (via leite) é particularmente importante em bezerros que mamam em vacas tuberculosas (GOOD; DUIGNAN, 2011). A infecção por meio de fômites ou pela via cutânea, congênita e genital ocorrem raramente (POLLOCK; NEILL, 2002; PHILLIPS et al., 2003; MENZIES et al., 2012). A importância da via congênita deve ser considerada em um rebanho onde a infecção é persistente (THOEN et al., 2009). Transmissão iatrogênica para a glândula mamária resulta do uso de infusões contaminadas no tratamento de mastites ou de equipamentos de ordenha que são deficientemente desinfetados (COUSINS, 2001; FSAI, 2008). Um estudo realizado na Índia
especulou a transmissão humano-bovino devido ao isolamento de M. tuberculosis dos animais (SRIVASTAVA et al., 2008).
Bovinos podem eliminar M. bovis por secreções nasais e de forma intermitente pelo leite (PÉREZ et al., 2002; FIGUEIREDO et al., 2010), eliminação menos frequente pode ocorrer pela urina, fezes, secreções vaginais e sêmen (RUGGIERO et al., 2007; SRIVASTAVA et al., 2008). Um grande número de micobactérias pode ser eliminado em estágios avançados da doença (CFSPH, 2009). Estima-se que entre 8 a 26% dos animais naturalmente infectados eliminam micobactérias em amostras clínicas, mas a duração precisa do período de secreção é desconhecida (PALMER et al., 2006).
Um trabalho realizado por Young e colaboradores (2005) indicou que M. bovis pode persistir em amostras ambientais. Neste estudo, PCR foi usada para detectar a presença de M. bovis em amostras ambientais de uma fazenda na Irlanda com histórico de TBov. Genes de M. bovis foram detectados no solo por até 21 meses depois da possível contaminação, na proporção de 1,0 x 103 a 3,3 x 103 cópias do gene por grama de solo.
Diferenças entre as espécies na susceptibilidade à infecção com M. bovis são conhecidas (THOEN et al., 2009). Pequenos ruminantes, equídeos, felídeos, canídeos e suídeos se infectam após exposição a M. bovis e são denominados hospedeiros disseminadores por transmitirem a doença a outras espécies. No entanto, esses animais não são capazes de manter a infecção na espécie quando não há a reinfecção por um hospedeiro mantenedor (CFSPH, 2009; THOEN et al., 2009).
Em países desenvolvidos onde a TBov encontra-se em fase final de erradicação ou já erradicada, a presença de reservatórios selvagens acarreta sérias implicações para o controle da doença (QUINN; COLLINS; 2006). No Reino Unido e Irlanda, o furão (Meles meles) fez ressurgir a TBov em áreas onde já havia sido erradicada. Um marsupial (Trichosurus vulpecula) é apontado como um dos principais responsáveis pela reinfecção de bovinos na Nova Zelândia. O javali europeu (Sus scrofa) na Península Ibérica (Espanha principalmente) e o veado de cauda branca (Odocoileus virginianus) nos EUA, representam fontes de infecção para outras espécies (THOEN et al., 2009; PALMER et al., 2012). Estes reservatórios ou hospedeiros de manutenção têm em comum a alta densidade populacional e contínua interação na interface animais selvagens e domésticos.
No Brasil, não há evidências que animais selvagens possam ser implicados como reservatórios de M. bovis na transmissão da infecção para os bovinos (LILENBAUM et al., 2007).
2.7 PATOGÊNESE E RESPOSTA IMUNE
Quando a infecção se dá pela via respiratória, M. bovis é fagocitado por macrófagos e células dendríticas (DCs) nos alvéolos pulmonares (STRAIN et al., 2011). Se não forem eliminados, os bacilos se multiplicam no interior destas células até destruí-las. Os bacilos liberados após destruição dos macrófagos são fagocitados por novos macrófagos alveolares ou por monócitos vindos da corrente circulatória. Por volta de duas a três semanas após a inalação do agente infeccioso sua multiplicação pode ser contida pelo estabelecimento da resposta imune celular. Necrose de caseificação pode ocorrer para conter o crescimento intracelular das micobactérias. Esse processo envolve a mediação por linfócitos T com migração de novas células de defesa ao local da infecção, dando origem a uma lesão granulomatosa específica (POLLOCK; NEILL, 2002; HOPE; VILLARREAL-RAMOS, 2008).
No foco inicial da lesão ocorre uma infiltração celular formada por macrófagos que assumem com frequência uma aparência alongada e são denominados células epitelióides. Células gigantes multinucleadas (células de Langerhans) também são formadas após a junção de macrófagos. Estas células epitelióides e de Langerhans formam o centro do tubérculo jovem, o qual é posteriormente cercado por uma zona de linfócitos, células plasmáticas e monócitos. O tubérculo desenvolve uma fibrose periférica e necrose de caseificação central; mineralização pode ser observada na área necrótica caseosa (NEILL et al., 2005; WANGOO et al., 2005). A formação do granuloma tem por finalidade restringir ou impedir o crescimento micobacteriano dentro dos macrófagos, e facilitar a interação entre citocinas secretadas por macrófagos e células T. A arquitetura do granuloma evita a propagação micobacteriana a partir do núcleo da lesão (JORDÃO; VIEIRA, 2011). A lesão inicial no parênquima pulmonar associada à formação de um novo granuloma no linfonodo regional é denominada complexo primário (PALMER; WATERS, 2006).
Embora a resposta imune mediada por células (IMC) tenha o potencial de controlar a infecção, alguns cenários podem sucedê-la. Desta forma, a infecção poderá evoluir de diferentes maneiras: o agente poderá ser morto e eliminado do hospedeiro, transformando o granuloma em uma cicatriz; a infecção poderá se tornar estacionária ou latente e ser reativada em algum momento no futuro quando houver uma imunossupressão; o agente pode promover uma doença ativa e progressiva com disseminação hematogênica para vários órgãos (WELSH et al., 2005; POLLOCK et al., 2006; KLEINNIJENHUIS et al., 2011).
O conceito de infecção latente é bem estabelecido no contexto da TB humana e ocorre quando a resposta imune do hospedeiro força o patógeno intracelular para um estado persistente de não replicação (FLYNN; CHAN, 2001). Não está bem esclarecido em que extensão a latência e a reativação se aplicam aos bovinos e outros animais (VAN RHIJN et al., 2008). Pollock e Neill (2002) sugerem a ocorrência destes processos em bovinos. A existência de animais com foco de lesão latente representa um desafio para os programas de controle e erradicação da TBov (CASSIDY, 2006).
2.7.1 Interação de M. bovis com o sistema imune
A internalização de micobactérias envolve processos de interações específicas receptor-ligante (PIETERS, 2008). Os principais receptores descritos na interação de macrófagos e micobactérias incluem os receptores de complemento (CR1, CR3 e CR4), receptores de manose (MR) (“Mannose Receptor”), receptores Fc, receptores “scavenger”, CD14, receptores TLR-2 e TLR-4, receptores de lectina tipo-C, molécula de adesão intracelular de DC (DC-SIGN) (“Dendritic Cell-Specific Intracellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Non-integrin”), NOD2 (“Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor”) e Dectina-1 (GEIJTENBEEK et al., 2003; LASUNSKAIA et al., 2006; NEYROLLES et al., 2006; KORBEL et al., 2008).
Como consequência da ativação dos macrófagos após o reconhecimento do bacilo, é observada a secreção de mediadores inflamatórios como as interleucinas IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α e GM-CSF (“Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor”), bem como as quimiocinas IL-8 e RANTES (“Regulated Upon Activaction, Normal T-cell Expressed and Secreted”), que facilitam o recrutamento de linfócitos e
monócitos para os pulmões. Os macrófagos também promovem a secreção de fatores microbicidas intermediários reativos de oxigênios (ROI) (“Reactive Oxygen Intermediate”) e os fatores intermediários reativos de nitrogênio (RNI) (“Reactive Nitrogen Intermediate”) (KAUFMANN , 2001; KORBEL et al., 2008).
Por outro lado, para sua sobrevivência dentro dos macrófagos, M. bovis é capaz de inibir a maturação do fagossomo impedindo sua fusão com os lisossomos (HOPE; VILLARREAL-RAMOS, 2008). Esse evento inibe ou retarda a apresentação de antígenos suprimindo os eventos posteriores da resposta imune (RAJA, 2004). Além disso, permite que células micobacterianas sobrevivam e se multipliquem dentro dos fagócitos (POLLOCK; NEILL, 2002). Alguns mecanismos, tais como o recrutamento ativo da molécula TACO (“Tryptophane-Aspartate-Containing Coat Protein”) (HOPE; VILLARREAL-RAMOS, 2008), a inibição da acidificação fagossomal e a competição bacilo-hospedeiro por íons ferro, são apontados como possíveis responsáveis pelo retardo na interação fagolisossomo (KAUFMANN, 2001).
As DCs reconhecem as micobactérias via receptores de lectina tipo-C e DC-SIGN, internalizam, processam e apresentam os antígenos protéicos via molécula de classe II do MHC (“Major Histocompatibility Complex”) ou antígenos não protéicos via molécula CD1, para células T (GUENIN-MACE et al., 2009). As DCs, assim como os macrófagos, servem como uma ponte entre a imunidade inata e a imunidade adquirida (SMITH, 2003).
Outras células podem estar envolvidas na resposta inicial frente ao desafio anti-micobacteriano. Por exemplo, células “Natural Killer” (NK) são citolíticas para as células-alvo infectadas, representam inclusive a primeira fonte de IFN-, 17 e IL-22 que irão desempenhar um papel importante na resposta inflamatória (POLLOCK; NEILL, 2002; WATERS et al., 2011c). Estudos histopatológicos da tuberculose bovina identificaram os neutrófilos entre as primeiras células associadas com o desenvolvimento de lesões (CASSIDY, 2006).
Apesar dos mecanismos de escape das micobactérias frente ao sistema imunológico do hospedeiro, alguns fagócitos conseguem processar e apresentar antígenos do bacilo aos linfócitos T auxiliares CD4+ (Th) (“helper”) conjugados a moléculas de MHC II presente em macrófagos, DCs e linfócitos B, dando início a resposta imune adquirida (TEIXEIRA et al., 2007).
Infecções experimentais têm demonstrado que os principais subtipos de linfócitos T (células T δ, céls. T CD4 e CD8) estão envolvidos na resposta imune anti-micobacteriana em bovinos. Os estudos da dinâmica de linfócitos na circulação sanguínea de bovinos infectados experimentalmente por M. bovis revelaram envolvimento sequencial de células T δ, seguida por CD4, e posteriormente um envolvimento predominante de CD8 (POLLOCK et al., 2005). Em bezerros os linfócitos T gama-delta (Tδ) são proporcionalmente os mais numerosos dentre as células mononucleares do sangue periférico (SMYTH et al., 2001). Desempenham função citotóxica, produzem IFN-, atuam no recrutamento celular e no desenvolvimento do granuloma tuberculoso (POLLOCK et al., 2001; POLLOCK et al., 2006). Os linfócitos T CD4 apresentam a maior contribuição para produção de IFN- na imunidade adquirida, a qual determina a ativação da capacidade anti-micobacteriana dos macrófagos. Linfócitos T CD8 foram também identificados como importantes produtores de IFN- e contribuem para a lise dos macrófagos infectados por M. bovis (POLLOCK et al., 2006).
No estágio inicial da infecção por M. bovis em bovinos, a resposta IMC é dominada por linfócitos T auxiliares do tipo 1 (Th1) que produzem as citocinas IFN-
e IL-2. Em seguida, com a progressão da doença há um predomínio de células Th2 com maior produção de IL-4 e IL-10. A mudança de dominância de linfócitos Th1 para Th2 está associada com a supressão da imunidade mediada por células e ao desenvolvimento de uma resposta humoral em fases posteriores da infecção. Isto pode explicar a anergia de alguns bovinos infectados ao teste tuberculínico intradérmico e ao ensaio com IFN-, que estão baseados na resposta IMC. A falha destes bovinos em desenvolver uma resposta IMC pode ser em parte devido à liberação de células T “reguladoras supressivas”, de citocinas imunossupressoras como IL-10 e do fator de crescimento transformante β (TGFβ) (“transforming growth factor β”). Estes bloqueiam a liberação de citocinas envolvidas na IMC tais como IFN-.
IL-10 e TGFβ são exemplos típicos de citocinas com atividade anti-inflamatória. Esta resposta imune é particularmente ativada para limitar os danos teciduais. A resposta de Th2 está associada também com o aumento da multiplicação e da carga antigênica bacteriana, assim como a piora do quadro clínico do animal em função da doença ativa disseminada. O desenvolvimento e
manutenção da resposta Th1 com IFN- foram relacionados a uma maior capacidade de controlar a infecção por M. bovis (Figura 2) (WELSH et al., 2005;
POLLOCK et al., 2005; WILSMORE; TAYLOR, 2008).
Waters e colaboradores (2006a) demonstraram que bovinos infectados experimentalmente podem ter uma resposta de anticorpos prematura, com a detecção de IgM e IgG específicas utilizando antígenos já reconhecidos.
Figura 2. Representação esquemática do espectro de resposta do sistema
imune bovino após a infecção por Mycobacterium bovis.Fonte: Adaptado de Pollock
e Neill (2002). Uso autorizado.
2.8 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A tuberculose bovina é geralmente uma doença crônica debilitante, mas pode ocasionalmente, ser aguda e rapidamente progressiva (CFSPH, 2009).
Por ser uma doença de evolução lenta, os sinais clínicos são pouco frequentes, tendem a surgir somente em casos avançados da enfermidade e podem ser confundidos com outras doenças (BRASIL, 2006; RUGGIERO et al., 2007). Quando presentes podem incluir fraqueza, inapetência, emagrecimento, dispnéia,
R esp ost a Im un e Tempo de Infecção
Aumento da carga bacilar
Resposta mediada
por células por anticorposResposta mediada
A
ne
rg
