3.1 Tipo de estudo
Este é um estudo de intervenção de caráter prospectivo e quantitativo, realizado no ambulatório de LMC do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás (HC-UFG), em parceria com o laboratório do Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas da Universidade Federal de Goiás (NEPET-UFG), situado na Faculdade de Farmácia da UFG. Projeto financiado pela Funação de Apoio `a Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) (Edital PPSUS 2013).
3.2 Aspectos éticos
O projeto deste trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do HC-UFG (CEP/HC-HC-UFG) (APÊNDICE 1) e após sua aprovação, todos os pacientes do ambulatório de LMC do HC-UFG, em uso de imatinibe, foram convidados a participar. Os que aceitaram, receberam todas as informações necessárias, deixando bem esclarecido que poderiam se retirar do estudo se desejassem, sem nenhum prejuízo ao seu tratamento. Todos os participantes assinaram duas vias do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (APÊNDICE 2), sendo a primeira via do pesquisador e a segunda, do participante. No caso de paciente não alfabetizado, foi colhida a impressão digital e assinatura de duas testemunhas. O TCLE de paciente com inimputabilidade jurídica, por idade inferior a 18 anos ou deficiência cognitiva, foi assinado pelo seu responsável legal.
3.3 População
Do total de 98 pacientes com Autorização de Procedimento de Alta Complexidade/Custo (APAC) para o uso de Mesilato de Imatinibe no ambulatório de hematologia do HC-UFG, 65 aceitaram participar do estudo. Até janeiro de 2013 todos eles foram tratados com o medicamento de referência, Glivec® (Novartis). A partir desta data, o Sistema Único de Saúde (SUS) passou a fornecer a todos os pacientes cadastrados, o medicamento genérico Mesilato de Imatinibe, produzido no Brasil. Para isto, o Ministério da Saúde contratou os laboratórios oficiais Instituto Vital Brasil do Governo do Rio de Janeiro e Farmanguinhos da Fiocruz para fornecer o MI ao SUS, em parceria com os laboratórios privados EMS, Cristália e Laborvida.
3.4 Entrevista e coleta de dados de prontuário
A entrevista foi realizada logo após a assinatura do TCLE e o questionário empregado (APÊNDICE 3) constituiu-se de duas partes, sendo a primeira relacionada aos dados sócio-demográficos, culturais e comportamentais do paciente e a segunda, `a aplicação do Teste de Morisky.
O teste de Morisky é um método indireto de avaliação da adesão terapêutica e inclui quatro questões:
1 - Às vezes tem problemas em se lembrar de tomar a medicação?
2 - Às vezes descuida-se quanto ao horário de tomar o seu medicamento? 3 - Quando se sente melhor, às vezes para de tomar o seu medicamento? 4 - Às vezes, ao se sentir pior ao tomar a medicação, para de tomar?
Foram considerados aderentes os pacientes que responderam NÃO a todas as questões e não aderentes àqueles que tenham respondido SIM a qualquer pergunta (MORISKY, 1986). Considerou-se como comportamento de não adesão intencional o paciente que deixa de tomar o medicamento quando se sente mal e/ou quando de sente bem, e como comportamento não intencional o paciente que se esquece de tomar seu remédio e/ou é descuidado com o horário (SEWITCH et al., 2003).
Para extrair os dados de prontuários, seguiu-se um roteiro (APÊNDICE 3). Foram obtidas informações sobre a doença, como fase da LMC ao diagnóstico, tempo para iniciar o tratamento, tempo de tratamento, resposta terapêutica e efeitos adversos, além de informações sobre outras doenças e medicações associadas.
3.5 Obtenção e preparo das amostras
As amostras de sangue foram coletadas por meio de punção venosa, com auxílio de scalp e seringa descartável, em seguida transferidas para cinco tubos de ensaio de 5 ml contendo EDTA e identificadas por código numérico. Foram realizadas duas coletas, intercaladas pela intervenção educativa, sempre no período das 13 `as 17 horas, com objetivo avaliar a concentração vale do fármaco (PICARD et al., 2007). A primeira coleta foi efetuada de fevereiro `a dezembro de 2012 e a segunda, de maio `a julho de 2014. Assim, no período da primeira coleta todos os pacientes faziam uso do MI de referência e da segunda, do genérico.
A primeira coleta de sangue, assim como a entrevista, foi realizada no dia da assinatura do TCLE. Nesta etapa avaliou-se a adesão medicamentosa por dois métodos indiretos, o teste de Morisky e a resposta terapêutica por quantificação do BCR-ABL e um direto, dosagem sérica de imatinibe. Esta foi considerada a avaliação da adesão pré intervenção educativa.
As amostras destinadas `a dosagem sérica, um tubo de ensaio por paciente, foram encaminhadas ao laboratório NEPET-UFG, para serem centrifugadas a 6000 rpm por cinco minutos, separando o plasma. Em seguida todas as amostras de plasma foram
armazenadas a -20°C. Os quatro tubos de ensaio reservados `a avaliação molecular foram acondicionados em um recipiente de plástico rígido, colocado em uma caixa resfriada por bolsa de gelo gel, sem nenhum contato entre os tubos de ensaio e o gelo. Todas as caixas foram enviadas ao Laboratório de Biologia Tumoral do Instituto Central do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (ICHC/USP), em São Paulo, por uma transportadora particular, encarregada de entregá-las em menos de 24 horas, para preservar a viabilidade das células. O tempo para devolução dos resultados, via email, foi de três semanas.
A segunda coleta seguiu a mesma estratégia da primeira e foi realizada após um intervalo de três a seis meses da intrevenção educativa. Da mesma forma, o teste de Morisky foi reaplicado, bem como a dosagem sérica do imatinibe e a quantificação do BCR-ABL. Assim, a adesão medicamentosa foi reavaliada pós intervenção educativa, pelos mesmos métodos da primeira etapa.
3.6 Dosagem sérica do mesilato de imatinibe
Análises farmacocinéticas prévias sugerem que atingir e manter um nível plasmático mínimo de 1.000 ng/ml associa-se à melhor resposta clínica (PICARD et al., 2007; LARSON et al., 2008; TAKAHASHI et al., 2010).
3.6.1 Quantificação do imatinibe por HPLC-PDA
A técnica analítica utilizada para a dosagem de imatinibe foi desenvolvida e validada, inicialmente, por um doutorando em Ciências da Saúde da UFG, o Wilsione José Carneiro, 2014, sob a tese intitulada “Avaliação da monitoração terapêutica de mesilato de imatinibe por HPLC-PDA e correlação com as respostas citogenéticas e moleculares completas em pacientes com leucemia mielóide crônica”. Na oportunidade, trocou-se o padrão interno, que era propranolol, para o dasatinibe, e efetuou-se uma co-validação, baseando-se na Resolução ANVISA RDC nº 27 de 2012 (BRASIL, 2012).
Ressalta-se que foi realizado o doseamento do mesilato de imatinibe no medicamento de referência (Glivec 100 mg) e no medicamento genérico Mesilato de Imatinibe (400 mg) e o teor de princípio ativo medido por HPLC-PDA corresponde ao teor descrito na bula, nos blísteres e na embalagem dos respectivos medicamentos.
3.6.2 Condições cromatográficas
Utilizou-se um cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado a um detector PDA SPDM-20 (HPLC-PDA) – Shimadzu™. Foi utilizada uma coluna Shimadzu® C-8 (5 µm, 4,6 x 250 mm) à temperatura ambiente. A fase móvel consistiu de uma mistura de metanol e solução de trietilamina 1% (60:40) com o pH ajustado para 10,5 sob fluxo de 1,0 mL/min. As análises foram monitoradas no comprimento de onda de 265 nm.
3.6.3 Ensaio de linearidade
A linearidade, para cada um dos analitos, foi avaliada pelo coeficiente de correlação linear (r) obtido da equação da reta da curva de calibração contendo de 7 pontos em duplicata. Os calibradores foram preparados através da adição de 50 µL de solução padrão de imantinibe além de 25 µL de solução padrão de dasatinibe em 450 µL de plasma. As concentrações utilizadas para a construção da curva foram respectivamente 0,2; 0,3; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 e 10 µg/mL, sendo o primeiro ponto da curva correspondente ao limite inferior de quantificação (LIQ). Obteve-se a seguinte equação da reta: y = 0,5489x - 0,0203 (R² = 0,9982).
3.6.4 Ensaio de precisão e exatidão
Foram realizadas análises em sextuplicata de três níveis de concentração, sendo uma baixa, uma média e uma alta sendo denominados como Controle de Qualidade de Baixa, Média e Alta Concentração (CQB, CQM e CQA) nas concentrações de 0,5; 4,0 e 8,0 µg/mL, respectivamente, sendo que tais concentrações estavam compreendidas na faixa de concentração da curva de calibração. A precisão foi avaliada através do cálculo do coeficiente de variação (CV) ou desvio padrão relativo (DPR), obtido pela seguinte fórmula: 100 • = CMD DP DPR
Os valores obtidos para a precisão apresentaram DPR de 2,5% a 11,6%, para os valores de concentração dos controles, acima considerados.
A exatidão foi expressa em porcentagem e foi calculada através da relação entre os valores obtidos (CME) e o valor teórico (CT):
100 • = CT CME Exatidão ,
Onde CME é a concentração média experimental e CT é a concentração teórica.
Os valores obtidos para a precisão variaram de 87% (CQA) a 116% (LIQ). Destaca-se que os valores obtidos estão dentro da variação aceita pela Resolução ANVISA RDC nº 27 de 2012 (Brasil, 2012).
3.6.5 Análise das amostras
Para cada 500 µL de amostra de plasma (uma replicata), foram adicionados 25 µL de padrão interno (dasatinibe 100 µg/mL), resultando numa concentração de 5 µg/mL do padrão interno.
As amostras foram agitadas em vórtex por 30 segundos e em seguida centrifugadas a 6000 rpm por 5 minutos. Logo após, 390 µL de sobrenadante foram transferidos para um tubo de vidro limpo ao qual se adicionou 1500 µL de acetato de etila, transferiu-se 1600 µL do extrato para outro tubo. Em seguida, o solvente foi evaporado sob fluxo de oxigênio a 50°C. Após a secagem completa, 100 µL de metanol foram adicionados ao tubo, seguido de agitação em vórtex por 30 segundos e, então, 20 µL foram injetados, pelo amostrador automático, no HPLC-PDA, para a quantificação cromatográfica.
3.7 Resposta terapêutica: avaliação molecular
A respota molecular foi avaliada através da quantificação do transcrito BCR-ABL, realizada no Laboratório de Biologia Tumoral do ICHC/USP. Foram utilizadas amostras de sangue periférico, para extração, sequenciamento e amplificação (RT-PCR) do mRNA BCR-ABL leucocitário, seguindo o protocolo de Adelaide (BRANFORD et
al., 1999) e medidas validadas de padronização em escala internacional do quantitativo de BCR-ABL (BRANFORD et al., 2008; WHITE et al., 2013).
3.8 Intervenção educativa pró-adesão
A prática clínica é repleta de desafios e, no tratamento da LMC, a falta de adesão medicamentosa tem-se destacado como importante causa de falha terapêutica. Após cinco anos `a frente do ambulatório de hematologia do HC-UFG, referência no atendimento de pacientes com LMC em Goiás, a autora criou um filme educativo, em formato de desenho animado, como ferramenta de intervenção pró-adesão. No processo criativo, foi considerada a heterogeneidade dos pacientes, variando do analfabeto ao pós-graduado, do adolescente ao idoso, do paupérrimo ao muito rico e do entusiasmado e receptivo ao tratamento `aquele queixoso e deprimido. Desta forma, os princípios na construção do filme foram:
ü Compartilhar com todos os pacientes de LMC as mesmas informações sobre a doença e a importância do uso regular da medicação, conforme prescrição médica
ü Instruir a todos os doentes de maneira simples, clara e lúdica, porém incisiva, abrangendo todos os pacientes, independente da escolaridade, idade ou nível social ü Atingir a memória e a afetividade dos pacientes, melhorando a adesão e a relação com a equipe cuidadora
ü Motivar os pacientes a levarem uma vida normal, sem esquecer a importância do tratamento contínuo
ü Incitar os pacientes a discutir o tema “adesão”
Nesta etapa, fez-se necessária a participação de um designer gráfico. A primeira e bem sucedida procura por este profissional foi realizada em um site de busca da internet, quando encontou-se o talentoso Rogério Toledo de Faria, da empresa Calango Que Ri. Foram realizadas várias reniões entre o designer e a autora, inicialmente para que ele entendesse o que é LMC e, posteriormente, na criação de cada quadro do filme, bem como na escolha do nome do personagem “Mário” e da música de fundo. O filme se encontra disponível no endereço https://vimeo.com/120786469.
O filme foi exibido uma única vez para cada paciente, na presença do médico assistente, imediatamente após a consulta de rotina, entre agosto de 2013 `a fevereiro de 2014.
3.9 Análise estatística
3.9.1 Análise univariada
Os dados colhidos na entrevista e no prontuário e os resultados dos testes laboratoriais foram armazenados e analisados no programa estatístico “Epi Info” versão 3.5.4 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA), de domínio público (www.cdc.gov/epiinfo).
Estimativas de adesão foram calculadas por análise univariada, com intervalo de confiança de 95%, para características sociodemográficas e clínicas dos pacientes. Para isso, foram utilizados os testes de x2 ou exato de Fisher, conforme a necessidade. A dicotomização em categorias de algumas variáveis com múltiplas respostas foi obtida pelo calculo da mediana. Assim, foram avaliadas possíveis associações entre não adesão ao medicamento e idade (≤ 53 versus > 53), estado marital (com companheiro versus sem companheiro), escolaridade (≤ ensino médio versus > ensino médio), renda familiar (≤ 2 salários mínimos versus > 2 salários mínimos), intervalo entre o diagnóstico e o início do imatinibe (≤ 3 meses versus > 3 meses), tempo de uso de imatinibe (≤ 65 meses versus > 65 meses), tempo para atingir resposta molecular (≤ 22 meses versus > 22 meses) e número de medicação(ões) associada(s) (≤ 2 medicamentos versus > 2 medicamentos).
3.9.2 Análise multivariada
Para a análise multivariada de dados, inicialmente empregou-se o programa estatístico “Epi Info” versão 3.5.4 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) e, posteriormente, foram realizadas a Análise de Correspondência Múltipla (MCA) e a Análise Hierárquica de Cluster (HCA), também chamada de Análise de Agrupamentos (EVERITT & DUNN, 2001), utilizando foi o pacote Système Portable d`Analyse - SPAD, versão 7.4 (LEBART et al., 1994).
a) Análise de Correspondência Múltipla (MCA)
A concepção geral da MCA, entre outros aspectos, é a inclusão de variáveis categóricas, apropriadas para dados nominais, pois é capaz de transformar dados
qualitativos em frequências de dados, ou seja, em dados quantitativos, podendo ser calculados pela HCA. Recebe o nome de MCA pelo fato de estudar a correspondência entre as variáveis e indivíduos (linhas e colunas). Este método permite a visualização gráfica das relações importantes de um grande conjunto de variáveis entre si (categóricas e contínuas categorizadas ou contínuas ilustrativas) (CARVALHO & STRUCHINER, 1992).
A MCA parte de uma matriz de dados e converge para um gráfico que exibe as linhas e as colunas da matriz como pontos de um espaço vetorial de dimensão menor que a original, de maneira a estabelecer relações entre linhas, colunas e, entre linhas e colunas, que possam ser interpretáveis (GREENACRE & HASTIE, 1987; ABDI & VALENTIN, 2007; GREENACRE, 2007), também calcula os autovalores e determina o quantitativo de informações presentes em cada eixo do gráfico (ABDI & VALENTIN, 2007). Este quantitativo de informação representado por porcentagem de informação deve ser reavaliado para descontar a superestimação de codificação presentes em cada variável (GREENACRE, 2007).
b) Análise Hierárquica de Cluster (HCA)
A HCA foi utilizada para estudar as similaridades das amostras com base na distribuição das variáveis. A técnica do vizinho mais próximo pelo Algoritmo de Benzécri (BENZÉCRI, 1979) foi aplicada para verificar esta similaridade e os agrupamentos hierárquicos formados de acordo com o Método de Variância Mínima de Ward (WARD JR, 1963). Os valores de p ≤ 0,05 foram considerados significantes (GREENACRE, 2007).
A HCA busca agrupar as amostras em classes, baseando-se na similaridade dos indivíduos (“casos”). A representação gráfica obtida é chamada de dendograma, um gráfico bidimensional que representa o agrupamento dos indivíduos em clusters (GOWER, 1966; SHARAF et al., 1986; BEEBE et al., 1998; BECKSTEAD, 2002; CORREIA & FERREIRA, 2007; KINGGENDORF et al., 2011).