3.1. Amostras Virais
As amostras dos vírus Oropouche (BeAn19991), Guamá (BeAn277), Guaroa (BeH22063) e Tacaiuma (BeAn73) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Pedro Vasconcelos, do Instituto Evandro Chagas - Belém, Brasil e pela Profa. Dra. Amélia Travassos da Rosa, da Universidade do Texas - Texas, EUA. A amostra do vírus Caraparu (SPAn2049) foi doada pela Profa. Dra. Terezinha Lisieux Coimbra, do Instituto Adolfo Lutz - São Paulo, Brasil.
A partir destas amostras virais foram obtidos os estoques virais ou sementes virais.
3.2. Estoque viral ou semente viral
As sementes virais foram utilizadas tanto para infectar as células quanto os camundongos e foram preparadas como descrito a seguir. Amostras do vírus Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa (GROV) e Tacaiuma (TCMV) foram diluídas 1/100 em solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,85% (salina) e foram inoculadas intracerebralmente em camundongos suíços recém-nascidos (1 dia de vida) na quantidade de 20µL/camundongo. Após o aparecimento dos sintomas de encefalite nos animais caracterizado por paralisia dos membros
posteriores, tremor, dificuldade em se alimentar, os mesmos foram sacrificados por hipotermia, para conservação dos vírus, e foram identificados e armazenados em freezer –70oC. Posteriormente, os cérebros destes animais foram retirados, macerados e misturados em salina tamponada em fosfato (PBS) pH 7,2 – 7,4, numa proporção de 1:10 p/v (1 cérebro para 0,9mL de PBS). A suspensão obtida foi centrifugada a 2000×g por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado, identificado e armazenado à temperatura de –70oC até o uso.
3.3. Experimentos in vitro
3.3.1. Cultura de células
Células de rim de macaco verde africano, também denominadas células Vero E6 (ATCC-CCL81) foram mantidas em meio mínimo essencial (MeM, Cultilab, Campinas-SP, Brasil) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), sob uma temperatura média de 36oC e na presença de 5% de CO2. Os repiques para manutenção celular foram realizados a cada 3 ou 4 dias, com a utilização de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil) para o desprendimento celular.
3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vitro
• Ribavirina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em solução de NaCl a 0,85% em água destilada e estocada a 4oC.
• Ácido micofenólico (Sigma Chemical Co. St. Louis MO): diluído em solução etanólica a 30% e estocado a 4oC.
• Interferon-alfa-2a ou Roferon-A (Hoffmann-La Roche, EUA): mantido a 4oC.
• Guanosina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em solução de etanol a 30% e estocada a 4oC.
• Solução de “trypan blue” utilizada no ensaio de citotoxicidade: Para cada 10mL da solução estoque adicionou-se 100mg de “trypan blue” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 10mL de PBS. Esta solução foi armazenada no escuro à temperatura ambiente.
• Solução de agarose 1% utilizada no ensaio de placa: Para cada 200mL de solução estoque adicionou-se 2g de agarose “low-melting-point” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 200mL de água destilada. A suspensão assim preparada foi esterilizada a 120oC e armazenada em geladeira. No momento do uso, o gel formado era liquefeito colocando-se a agarose em microondas por 2 minutos seguido de manutenção da solução em banho-maria a 37oC até o uso.
• Meio MeM 2x utilizado no ensaio de placa: Para cada litro de meio adicionou-se 200mL de MeM 10x (suplementado com glutamina e antibiótico) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 100mL de SBF (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 20mL de uma solução de aminoácidos
não-essenciais (0,2mM) (Gibco BRL, Life Technologies, Inc.), 2mL de uma solução de piruvato de sódio (2mM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 38mL de uma solução de bicarbonato de sódio a 8,4% e 500mL de água destilada ou água deionizada em MILLI-Q. Todos os compostos foram misturados, com exceção do SBF e o pH da solução foi corrigido para pH 7,2 – 7,4 com soluções de bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio. Posteriormente, foi adicionado à solução água destilada ou água deionizada em MILLI-Q em q.s.p. 900mL. O meio obtido foi esterilizado por processo de filtragem em membrana de poro de 0,22µm em um sistema fechado (Corning, NY, EUA). Após a filtração, o SBF foi adicionado ao meio e o mesmo foi aliquotado e armazenado em geladeira até o momento do uso.
• Solução de “naphtol blue-black” utilizada no ensaio de placa: Para cada litro da solução estoque adicionou-se 1,0g de “naphtol blue-black” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 13,6g de acetato de sódio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 60mL de ácido acético glacial (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e 940mL de água destilada. Esta solução foi armazenada no escuro à temperatura ambiente (MORENS et al., 1985).
3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-αααα-2a sobre células Vero E6
A avaliação da toxicidade dos medicamentos selecionados sobre as células Vero E6 foi realizada por meio da metodologia de exclusão por “trypan blue” (KINCHINGTON et al., 1995). Resumidamente, células Vero
E6 distribuídas em placas de 24 cavidades receberam somente meio ou este adicionado de diferentes concentrações de RBV, MPA ou IFN-α-2a (Tabela 2). A placa foi, então, incubada por 3 dias em estufa a 36oC e 5% de CO2. Decorrido o período de incubação, as células provenientes do sobrenadante e as células desprendidas das cavidades com auxílio de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), foram centrifugadas a 2000×g por 10 minutos a 4oC e ressuspensas em uma solução (v/v) de PBS e de “trypan blue” (500µL de cada). Em seguida, realizou-se a contagem de células mortas (azuis) e vivas (não coradas) em câmara de Neubauer e a porcentagem de células viáveis foi calculada tanto para as células incubadas com meio, como para as células incubadas com as diferentes concentrações dos medicamentos. Determinada a concentração máxima não tóxica, diluições da droga abaixo deste valor e incluindo o mesmo foram utilizadas nos experimentos in vitro na presença dos vírus.
Tabela 2: Concentração dos medicamentos adicionados à cultura de células Vero E6.
Medicamento Concentrações utilizadas
Ribavirina 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256 µg/mL
Ácido micofenólico 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128 µg/mL Interferon-alfa-2a 1; 10; 100; 1.000; 10.000; 100.000
3.3.4. Otimização da metodologia de ensaio de placa
O ensaio de placa utilizado para quantificação viral, foi padronizado por nós, baseado na metodologia preconizada por MORENS e colaboradores em 1985, com algumas modificações.
Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades e incubadas por 24 horas a 36°C e 5% CO2 tiveram o meio removido e no lugar deste foi adicionado 200µL de meio (controle negativo) ou 200µL das diferentes diluições virais (10-2 a 10-6 ou 10-3 a 10-7) provenientes da diluição de alíquotas da semente viral em meio MeM contendo 5% de SBF. As amostras foram distribuídas em quadruplicata conforme demonstrado na figura 8 e as células foram incubadas por 2 horas a 36oC e 5% de CO2, sofrendo agitação branda a cada 30 minutos. Após o período de incubação, tanto o meio como o inóculo viral foram removidos e em seguida, adicionou-se 1mL/cavidade de meio proveniente da mistura (v/v) de agarose 1% e de meio MeM 2x e as células foram incubadas em estufa por 3 dias para OROV e GUAV, 5 dias para CARV e GROV, e 9 dias para TCMV. A cada 3 dias o meio (500µL de MeM 2x/agarose) era substituído para manutenção da viabilidade celular. Decorrido o período de incubação, o meio foi removido por completo e no lugar deste adicionou-se 500µL da solução de “naphtol blue black” e as placas foram incubadas por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, a solução de “naphtol blue black” foi removida e as placas formadas pela ação citolítica dos vírus foram contadas utilizando-se microscópio invertido. O título viral
obtido foi determinado como PFU (Unidade Formadora de Placa) por mililitro (mL), cujo cálculo está exemplificado na figura 8:
Exemplo de cálculo de PFU/mL baseado na figura anterior:
• Diluição viral onde é possível a contagem individual das placas (em branco): 10-5
• Média do total da contagem das placas: 8 placas ÷ 4 (quadruplicata) = 2
• Resultado A: 2 x 105 PFU/200µL do inóculo viral
• Correção do valor obtido para 1mL: multiplica por 5 o resultado A • Resultado B (definitivo): 2 x 105 x 5 PFU/mL = 1,0 x 106 PFU/mL • Neste caso, o título viral é: 1,0 x 106 PFU/mL
Figura 8: Esquema ilustrativo de uma placa de 24 cavidades após ser submetida à metodologia de ensaio de placa, bem como um exemplo de cálculo do título viral obtido pela leitura desta placa.
3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do IFN-αααα-2a sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro
Uma vez determinadas as concentrações não tóxicas dos medicamentos para as células Vero E6 e uma vez padronizado o ensaio de placa para OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, fomos avaliar a atividade antiviral dos medicamentos sobre os vírus utilizando-se de 3 diferentes análises segundo a metodologia preconizada por DIAMOND e colaboradores (2002).
Primeiramente analisamos o efeito antiviral dos medicamentos quando adicionados à cultura celular, na concentração máxima não tóxica, em um período antecedente à infecção viral. Para este fim, células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica 24 horas antes do contato com o inóculo viral (item 3.3.4), junto do inóculo viral e posteriormente ao mesmo no momento da adição do meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero E6 receberam somente meio nestes mesmos períodos. Os medicamentos foram recolocados a cada três dias quando o meio das células Vero E6 era substituído por meio novo (item 3.3.4).
Em uma segunda análise, fomos avaliar o efeito antiviral dos medicamentos quando adicionados em cultura celular num período posterior à infecção viral. Para tanto, células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica dos medicamentos 2 horas após a adição do inóculo viral conjuntamente ao meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero
E6 receberam somente meio neste período. Além do período de 2 horas após a infecção viral, foi testado também a atividade antiviral dos compostos quando os mesmos eram adicionados 24, 48 e 72 horas após a infecção viral. Da mesma maneira, os medicamentos eram recolocados a cada três dias no momento da troca do meio de manutenção.
A terceira análise foi realizada somente após o medicamento ter apresentado capacidade antiviral significante sobre os vírus, quando da aplicação da primeira e segunda análise anteriormente descrita. Assim, a terceira análise foi realizada com a finalidade de obter uma concentração do medicamento menor que a máxima concentração não tóxica e que fosse capaz de inibir de maneira significante a replicação viral em tratamentos iniciados 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral. Portanto, tal análise poderia sugerir uma dose com eficácia antiviral, mas que por estar em menor concentração causaria menor dano celular.
A partir dos dados obtidos destas três análises, foi possível predizer a possibilidade dos medicamentos selecionados de apresentarem ou não atividade antiviral em experimentos in vivo, os quais foram realizados em seguida.
3.4. Experimentos in vivo
3.4.1. Animais
Foram utilizados em todos os experimentos camundongos suíços recém-nascidos provenientes do biotério central da Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto-SP, Brasil. Os animais foram mantidos em caixas individuais num sistema isolado no biotério do Centro de Pesquisa em Virologia (USP), onde todos os experimentos foram realizados. Todos os protocolos experimentais utilizando animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP) através do número 006/2004 (Anexo 10.3).
3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vivo
• Ribavirina (Item 3.3.2) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). • Interferon-alfaA recombinante de camundongo expresso em E. coli (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO): diluído em uma solução de NaCl a 0,85% e de albumina bovina a 0,1% conforme instruções do fabricante, aliquotado e estocado a -70oC. No momento do uso, o IFN-αA foi diluído em solução fisiológica gelada e permaneceu em gelo no decorrer dos experimentos in vivo.
3.4.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100) pela via de inoculação intra-peritoneal
Para determinar a DL50, alíquotas da semente viral foram diluídas para 10-2 a 10-9 em solução salina e grupos de 6 camundongos com 3 dias de vida foram infectados pela via intra-peritoneal com 40µL de cada diluição. Nos dias subseqüentes, os animais foram observados tendo sua mortalidade anotada. Cálculos envolvendo a quantidade de animais sobreviventes e animais mortos foram feitos pelo método de Reed & Muench (REED & MUENCH, 1938), obtendo-se, então a dose letal 50 (DL50) para cada vírus.
Após a determinação da DL50, grupos de 6 camundongos foram infectados intra-peritonealmente com 10, 100 ou 1000 vezes a DL50 a fim de se obter a dose capaz de causar a morte de 100% dos animais (DL100). A dose obtida foi utilizada na infecção dos animais em todos os experimentos in vivo.
3.4.4. Determinação da concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFN-ααααA pelos camundongos suíços lactentes
Antes de verificar a ação dos medicamentos sobre os animais infectados, foi determinada a concentração máxima de cada um dos compostos que poderia ser utilizada e que não causaria reações adversas ou morte nos mesmos (HUGGINS et al., 1986). Para tanto, diferentes
concentrações dos medicamentos (Tabela 3) foram inoculados pela via intra-peritoneal (30µL/camundongo) iniciando o tratamento no 2o dia de vida e prolongando-se por 10 dias (KOFF et al., 1983; KENDE et al., 1985; KENYON et al., 1986; SASAKI et al., 1986; FUCHIZAKI et al., 2003). No decorrer deste período, os animais foram observados e seus pesos foram anotados, bem como a ocorrência de morte. Como controle do experimento, grupos de animais receberam somente salina via intra-peritoneal e o peso destes camundongos foi anotado e comparado com os dos animais tratados com os medicamentos.
Através da comparação estatística entre os pesos dos animais tratados ou não com os medicamentos foi determinada a concentração máxima tolerada dos compostos, a qual foi utilizada em todos os experimentos in vivo.
Tabela 3: Concentração dos medicamentos RBV e IFN-αA testadas em camundongos lactentes.
Medicamentos Concentrações
Ribavirina 35; 45 mg/Kg/dia
Interferon-alfaA 10
3 UI/mL (30 UI); 104 UI/mL (300 UI); 105 UI/mL (3000 UI)
3.4.5. Metodologia para determinar a atividade antiviral da RBV e do IFN-ααααA sobre os animais infectados
A determinação da atividade antiviral da RBV e do IFN-αA sobre os animais infectados foi realizada segundo a metodologia preconizada por HUGGINS e colaboradores (1986) e por SASAKI e colaboradores (1986). Para tanto, dois tipos de análise foram utilizadas: uma profilática e outra terapêutica.
Na análise profilática, os medicamentos e o placebo (salina) foram administrados pela via intra-peritoneal (30µL), na concentração máxima tolerada, 24 horas antes da infecção viral, no momento da infecção e diariamente por mais 5 dias, totalizando 7 dias de tratamento. As drogas foram administradas 1 vez ao dia.
Na análise terapêutica, os medicamentos começaram a ser administrados 3 horas ou 24 horas após a infecção viral, seguido de uma dose de manutenção a cada 24 horas totalizando também 7 dias de tratamento. As drogas foram administradas 1 vez ao dia, num volume de 30µL/camundongo.
Durante o período de tratamento e posteriormente a ele, a eficácia do medicamento foi avaliada a partir de 4 parâmetros: curva de sobrevivência, tempo médio de vida, viremia e quantidade de vírus no cérebro.
A curva de sobrevivência revelou graficamente a quantidade de animais que sobreviveram à infecção por um determinado período de
tempo, comparando o grupo tratado com o medicamento com o grupo tratado com salina. Os resultados provenientes da curva de sobrevivência foram demonstrados em tabelas onde colocou-se o número total de animais sobreviventes ao final do experimento sobre o número total de animais inicialmente infectados (tratados ou não com medicamento).
O tempo médio de vida (TMV) correspondeu ao valor médio obtido entre o 1o dia e o último dia em que houve o aparecimento de animais mortos no decorrer do experimento.
A viremia e a quantificação de vírus no cérebro foram realizadas segundo XIAO e colaboradores (2001). Para tanto, grupos de 18 animais com 3 dias de vida foram infectados com a DL100 e foram tratados em dias pré-determinados com os medicamentos ou com o placebo. Nos dias 1, 2, 3, 5, 7 e 9 após a infecção viral, foram retirados de 2 animais de cada grupo 100µL de sangue e cérebro. Para determinação da viremia, o sangue foi diluído 1/10 em meio MeM 1x contendo 5% de SBF, foi centrifugado a 2000×g por 10 minutos a 4oC e o sobrenadante obtido foi aliquotado e armazenado a –70oC. Concomitantemente, os cérebros foram macerados e misturados com meio MeM, numa proporção de 1:10 (1 cérebro para 0,9mL de meio MeM), a suspensão cerebral foi centrifugada a 2000×g por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado e armazenado à temperatura de –70oC. Posteriormente, o sobrenadante proveniente do sangue e do cérebro foram diluídos de 10-2 a 10-6 ou 10-3 a 10-7 em meio MeM (5% de SBF) e foram distribuídos em quadruplicata, em placas de 24 cavidades (200µL/cavidade) contendo monocamada de células Vero E6 e o
ensaio seguiu conforme item 3.3.4. Os valores obtidos foram demonstrados graficamente.
A eficácia antiviral dos medicamentos foi então analisada pela sua capacidade de impedir a mortalidade, de aumentar o tempo de vida dos animais, de inibir ou diminuir o processo virêmico e inibir ou diminuir a replicação viral no cérebro.
3.5. Análise estatística
Para analisar os experimentos in vitro foram utilizados a análise de variância (ANOVA) e o método de Tukey-Kramer. Para os experimentos in vivo foi utilizado o Teste de t (Student’s t-test). Um valor de P menor que 0,05 (P<0,05) foi considerado estatisticamente significante. A análise de variância, o método de Tukey-Kramer e o Teste de t (Student’s t-test) foram realizados através do programa estatístico INSTAT, Graph Pad, Califórnia, EUA.
4. RESULTADOS
4.1. Resultados referentes às padronizações
4.1.1. Concentração máxima não tóxica dos medicamentos RBV, MPA e IFN-αααα-2a para células Vero E6
Utilizando-se das concentrações discriminadas na tabela 2 (item 3.3.3) podemos observar que a RBV apresenta elevado grau de toxicidade sobre as células Vero E6 em concentrações ≥ 128µg/mL, com declínio da viabilidade celular superior a 30% em relação às células cultivadas na presença de meio somente (Figura 9). Porém, concentrações ≤ 64µg/mL apresentaram uma viabilidade em torno de 80 a 90%, podendo, portanto, serem utilizadas em culturas de células Vero E6 (Figura 9). No entanto, DIAMOND e colaboradores (2002) observaram que o uso da RBV na concentração de 50µg/mL é capaz de inibir em 50% o crescimento das células Vero E6, mostrando um efeito citostático sobre as mesmas. Diante deste fato, concentrações ≤ 50µg/mL foram utilizadas para avaliar a atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV em cultura de células Vero E6.
Com relação ao MPA podemos observar pela figura 10 que a concentração de 32µg/mL foi muito tóxica para as células, causando uma diminuição da viabilidade celular em torno de 30% em relação às células cultivadas com meio somente. Entretanto, doses ≤ 16µg/mL apresentaram uma porcentagem de viabilidade em torno de 80 a 90%, não
apresentando, portanto toxicidade significante sobre as células Vero E6. Contudo, DIAMOND e colaboradores (2002) observaram que uma concentração de MPA ≥ 10µg/mL causa um efeito citostático sobre as células Vero E6, diminuindo em 50% seu processo replicativo. Assim sendo, nos experimentos in vitro utilizamos concentrações de MPA ≤ 10µg/mL.
Segundo dados da literatura, concentração de 100.000 UI/mL de IFN-α-2a não apresenta qualquer efeito tóxico sobre células Vero E6 em cultura (TAN et al., 2004) e corroborando com este dado, a figura 11 mostra-nos que a concentração de 100.000 UI/mL apresenta uma porcentagem média de viabilidade de 95%. Dessa forma, doses ≤ 100.000 UI/mL foram utilizadas por nós nos experimentos in vitro.
Figura 9: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na presença de diferentes concentrações de RBV. A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer após mantê-las incubadas em solução de “trypan blue”. O valor proveniente da contagem das células cultivadas com meio somente (M) representa o controle negativo. As barras representam a média ± desvio-padrão (SD) de valores obtidos de uma duplicata. M 2 4 8 16 32 64 128 256 0 20 40 60 80 100 Concentração de RBV (µµµµg/mL) P or ce nt ag em d e cé lu la s Ve ro E 6 vi áv ei s (% )
Figura 10: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na presença de diferentes concentrações de MPA. A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer após incubá-las em solução de “trypan blue”. Os dados provenientes da contagem das células cultivadas com meio somente (M) representam o controle negativo. As barras representam a média ± SD de valores obtidos de uma duplicata.