UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO INTERFERON-ALFA E DE INIBIDORES DA INOSINA MONOFOSFATO DESIDROGENASE SOBRE

ORTHOBUNYAVIRUS BRASILEIROS

MÁRCIA CRISTINA LIVONESI

RIBEIRÃO PRETO – SP 2006

Livros Grátis

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MÁRCIA CRISTINA LIVONESI

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO INTERFERON-ALFA E DE INIBIDORES DA INOSINA MONOFOSFATO DESIDROGENASE SOBRE

ORTHOBUNYAVIRUS BRASILEIROS

Tese (Doutorado) apresentada ao curso de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor (a) em Ciências – Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.

Orientador:

Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo

Ribeirão Preto – SP 2006

FICHA CATALOGRÁFICA Livonesi, Márcia Cristina

Estudo da atividade antiviral do interferon-alfa e de inibidores da inosina monofosfato desidrogenase sobre Orthobunyavirus brasileiros.

Ribeirão Preto, 2006. 172p.: il. ; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes.

1.Bunyaviridae 2.Ribavirina 3.Ácido Micofenólico 4.Interferon-alfa 5.Ensaio de placa 6.in vivo

Trabalho realizado no Centro de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, com auxílio financeiro da CAPES e FAPESP (No

EPÍGRAFE

A Sabedoria brilha, não fenece; deixa-se ver facilmente pelos que a amam, deixa-se encontrar pelos que a procuram.

Antecipa-se aos que a desejam, sendo a primeira a se dar a conhecer. Quem parte cedo à sua procura não se fadigará, pois a encontrará sentada

à sua porta.

Apaixonar-se por ela é a perfeição do discernimento, e quem velar por sua causa estará em breve sem inquietações.

Pois ela deambula em busca dos que dela são dignos, aparece-lhes benevolamente nos caminhos e vai ao encontro deles em cada um de seus

pensamentos.

DEDICATÓRIA

À Santíssima Trindade e à Virgem Maria: “Celebrai o Senhor de todo o poder, porque Ele é bom e sua fidelidade é para sempre”. (Jeremias 33:11)

Aos meus pais, Luiz e Orminda: imensurável amor que acolhe, aquece e reconforta...

As minhas irmãs Denise e Liz: companheiras de viagem no trem da vida e cuja amizade facilita a transposição de qualquer obstáculo.

A minha sobrinha Vitória: amor puro e sincero, cujo sorriso e alegria nos cerca de felicidade.

Ao Ricardo: Sol que ilumina os meus dias, que aquece e preenche o meu coração de amor e felicidade.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais (Luiz e Orminda), as minhas irmãs (Denise e Liz) e ao meu namorado (Ricardo) pelo carinho, apoio e ajuda em todos os momentos desta jornada.

Ao Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo que me aceitou como aluna em seu laboratório, mesmo sem me conhecer; que me introduziu no mundo da virologia e que confiou a mim um trabalho nunca dantes realizado em seu laboratório e que me orgulhei muito de fazer. Obrigada pelos ensinamentos, confiança e amizade.

Aos professores Francisco de Paula Pinheiro, Aramis Augusto Pinto, Yara Maria Lucisano Valim e Karla de Melo Lima por terem aceitado participar da minha banca, pela atenção com que me atenderam e pelas sugestões e correções referentes a esta tese.

A todos os professores que passaram pela minha vida, cujos ensinamentos foram fundamentais para meu crescimento pessoal e profissional.

A Ana Cristine S. Ferreira, pessoa exemplar que muito me ajudou tanto no mestrado como no doutorado. Mãe dedicada e amorosa que recebe e trata

todos os alunos com muito carinho e atenção. Ana, agradeço de todo o coração o que você fez por mim, nunca vou esquecer... Obrigada.

Aos funcionários da Faculdade de Medicina que sempre me receberam com um sorriso no rosto e que se tornaram pessoas preciosas para mim. Assim refiro-me a Rosângela, Ronaldo, Wander, Cristiane (Mila), “Gil”, “Pity”, Marli, Isa, Maria Helena, Lúcia(s), Maria Inês, Júlio, Ednelson, Sávio, Denise, Vânia e muitos, muitos outros.

Aos funcionários da Secretaria de Pós-graduação, da Biblioteca Central, do Biotério Central e do Biotério do Anexo A pelos valiosos serviços prestados, pela atenção e paciência em nos atender.

Aos funcionários e amigos do Centro de Pesquisa em Virologia que me ajudaram muito e que tornaram meus afazeres mais fáceis. Assim refiro-me a Soraya, Sueli, Paulo, Pavanelli, Regina, Andréa e Fernanda. Agradeço também a “Guina”, ao Thiago e a Estela que não trabalham mais neste departamento, mas que foram muito importantes para mim. Muito obrigada.

Aos meus amigos e companheiros de jornada: Viviane, Marcos, Alessandra, Roberta, Veridiana, Juliana, Thalita, Mário, Neusa, Aline, Gelse, Laura, Nadiele, Aldo, Victor, Paula, Glauciane, Luzia, Raquel, Liz e Alberto. Agradeço a amizade, o carinho, as conversas descontraídas e algumas vezes sérias, a compreensão e apoio no dia-a-dia. “Eu teria muita

coisa a te escrever, mas não quero fazê-lo com tinta e pena; pois espero rever-te em breve, e conversaremos pessoalmente” (Terceira Epístola de João).

Aos colegas de cursos, de congressos e dos “corredores da vida” que me escolheram para fazer parte de suas vidas, mesmo que tenha sido por um pequeno instante.

A todos que não citei, mas que de uma forma ou de outra contribuíram para a realização deste trabalho.

A CAPES e a FAPESP pelo indispensável apoio financeiro.

ABREVIAÇÕES E SIGLAS

AIDS: síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) ATF: “activating transcription factor”

Coronavirus-SARS: Coronavirus da síndrome respiratória aguda severa EMC: vírus da encefalomiocardite

HCV: vírus da hepatite C

HIV: vírus da imunodeficiência humana IRF: “interferon regulatory factor”

ISGF3: “interferon-stimulated gene factor 3” JAK: Janus quinase

MeM: meio mínimo essencial

MHC: complexo de histocompatibilidade principal NF

κκκκ

B: fator nuclear

κ

B

PFU: unidade formadora de placa SBF: soro bovino fetal

STAT: transdutores de sinal e ativadores de transcrição Th: linfócito T auxiliar (helper)

TyK: tirosina quinase pertencente à família da JAK VSV: vírus da estomatite vesicular

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO 01

1.1. Gênero Orthobunyavirus 01

1.2. Drogas Antivirais 10

1.2.1. Inibidores de Inosina Monofosfato Desidrogenase 10

1.2.1.1. Ribavirina 12 1.2.1.2. Ácido Micofenólico 18 1.2.2. Interferon-alfa 22 2. OBJETIVOS 30 3. MATERIAL E MÉTODOS 31 3.1. Amostras virais 31

3.2. Estoque viral ou semente viral 31

3.3. Experimentos in vitro 32

3.3.1. Cultura de células 32

3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in

vitro 33

3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-α-2a

sobre as células Vero E6 34

3.3.4. Otimização da metodologia do ensaio de placa 36 3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do

IFN-α-2a sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in

vitro 38

3.4. Experimentos in vivo 40

3.4.1. Animais 40

3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in

vivo 40

3.4.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal

100 (DL100) pela via de inoculação intra-peritoneal 41

3.4.4. Determinação da concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFN-αA pelos camundongos

3.4.5. Metodologia para determinar a atividade antiviral da

RBV e do IFN-αA sobre animais infectados 43

3.5. Análise Estatística 45

4. RESULTADOS 46

4.1. Resultados referentes às padronizações 46

4.1.1. Concentração máxima não tóxica dos medicamentos

RBV, MPA e IFN-α-2a para células Vero E6 46

4.1.2. Susceptibilidade de camundongos suíços à infecção intra-peritoneal pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e

TCM 51

4.1.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal

100 (DL100) para os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM

em animais suíços através da via de inoculação

intra-peritoneal 54

4.1.4. Detecção e quantificação de vírus no sangue e no

cérebro 56

4.1.5. Concentração máxima tolerada dos medicamentos

RBV e IFN-αA pelos camundongos suíços lactentes 60

4.2. Resultados referentes à Ribavirina 64

4.2.1. Atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV,

GROV e TCMV in vitro 64

4.2.2. Atividade antiviral da RBV sobre os vírus ORO, CAR,

GUA, GRO e TCM em experimentos in vivo 70

4.3. Resultados referentes ao Ácido Micofenólico 73

4.3.1. Avaliação da capacidade antiviral do MPA sobre

OROV,CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro 73

4.3.2. Avaliação da capacidade antiviral da RBV e do MPA quando utilizados concomitantemente sobre os vírus

ORO, CAR e GRO 79

4.4. Resultados referentes ao Interferon-alfa 83

4.4.1. Atividade antiviral do IFN-α sobre os vírus ORO, CAR,

4.4.2. Atividade antiviral do IFN-α sobre OROV, CARV,

GUAV, GROV e TCMV em experimentos in vivo 87

5. DISCUSSÃO 96 6. CONCLUSÕES 112 7. RESUMO 114 8. ABSTRACT 115 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 116 10. ANEXOS 136

10.1. Artigo referente aos resultados de Ribavirina 136

10.2. Artigo referente aos resultados do Ácido Micofenólico 155 10.3. Carta de aprovação da Comissão de Ética em

1. INTRODUÇÃO

1.1. Gênero Orthobunyavirus

O gênero Orthobunyavirus pertence à família Bunyaviridae, a qual compreende outros quatro gêneros: Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus (CALISHER, 1996; ELLIOT, 2000). A grande maioria destes vírus é transmitida por mosquitos, flebótomos ou carrapatos, com exceção dos Hantavirus que infectam roedores e possuem mecanismo de transmissão relacionado à inalação de aerossóis proveniente das excretas destes animais (SCHMALJOHN & HJELLE, 1997).

Os vírus da família Bunyaviridae são esféricos, envelopados, medindo cerca de 80 a 120 nm, possuindo na sua superfície projeções glicoprotéicas (Figura 1) (ELLIOT, 1997). Seu genoma é constituído por RNA de fita simples de polaridade negativa, tri-segmentado, denominado de grande (L), médio (M) e pequeno (S), sendo que este último pode atuar ainda de forma “ambisense” em processo replicativo (ELLIOT, 1997). O segmento L origina a RNA polimerase viral (ou proteína L), enquanto o segmento M produz uma poliproteína que é clivada formando as glicoproteínas G1 e G2. O segmento M também produz uma proteína não estrutural, denominada NSm, enquanto o segmento S é responsável por originar a proteína do nucleocapsídio (proteína N) e uma pequena proteína não estrutural denominada NSs (ELLIOT, 1997).

Figura 1: Estrutura esquemática dos vírus pertencentes à família Bunyaviridae. L, M e S são os RNAs do vírus, a esfera em cor verde é a polimerase viral. (Fonte: www.stanford.edu/group/virus/bunya).

A infecção por vírus da família Bunyaviridae inicia-se pela adsorção do microrganismo à membrana celular tendo como ligantes a proteína G1 para células de vertebrados e a proteína G2 para células de artrópodes. Os vírus penetram na célula, provavelmente por endocitose e fundem seu envelope às membranas endossômicas o que permite ao nucleocapsídio viral atingir o citoplasma (Figura 2). Primeiramente, utilizando a polimerase viral, ocorre uma transcrição primária do RNA de polaridade negativa (-) do vírus para RNA mensageiro (+) e RNA complementar (+). Posteriormente, a polimerase viral inicia a transcrição do RNA complementar (+) para RNA (-) encapsidado, originando o genoma da progênie viral (SCHMALJOHN, 1996). Enquanto isso, ribossomos livres fazem a tradução dos segmentos L, M e S dos RNAs mensageiros. Por fim, a montagem viral ocorre após o acúmulo das glicoproteínas G1 e G2 junto ao aparelho de Golgi, do qual a partícula viral brota e a progênie viral é liberada por pinocitose reversa com fusão das membranas das vesículas

citoplasmáticas à membrana celular (SCHMALJOHN, 1996). A partícula viral proveniente do aparelho de Golgi pode também unir-se diretamente à membrana celular alcançando o meio exterior, como uma maneira alternativa de completar o processo replicativo (ELLIOT, 1997).

Figura 2: Esquema do processo replicativo dos vírus pertencentes à família Bunyaviridae. (Fonte: SCHMALJOHN, 1996).

Uma vez no organismo do hospedeiro, os vírus da família Bunyaviridae podem causar uma série de sinais e sintomas que variam de acordo com o agente viral, podendo muitas vezes causar desde encefalites até febres hemorrágicas, como ocorre, por exemplo, nas infecções causadas pelos vírus La Crosse, Hantaan, febre do Vale Rift, febre

hemorrágica do Crimean-Congo e hantavirus do Novo Mundo (MANGIAFICO et al., 1988; ELLIOT, 1997).

No Brasil foram isoladas dezenas de vírus do gênero Orthobunyavirus, sendo o mais importante do ponto de vista epidemiológico, o vírus Oropouche, por causar extensas epidemias na região Amazônica (VASCONCELOS et al., 1992), sendo superado apenas pelo dengue em número de casos notificados (VASCONCELOS et al., 1992; DIXON et al., 1981; PINHEIRO et al., 1982).

O vírus Oropouche foi isolado pela primeira vez em 1955, em Trinidad, a partir do sangue de um morador da localidade de Vega de Oropouche (ANDERSON et al., 1961). No Brasil, o vírus foi isolado pela primeira vez em 1960, do sangue de uma preguiça (Bradypus tridactylus) e de um “pool” de Aedes serratus capturados nas margens da rodovia Belém-Brasília. O vírus Oropouche mantém-se na natureza utilizando 2 ciclos, um urbano e outro silvestre. O ciclo silvestre, que mantém o vírus originalmente na natureza, envolve como reservatórios 95 espécies de animais que incluem diversas aves silvestres, macacos e preguiças. Suspeita-se que o mosquito Aedes serratus possa ser o vetor silvestre do vírus Oropouche. O ciclo urbano, provavelmente, ocorreu como uma adaptação rápida do vírus às localidades ribeirinhas amazônicas, o que levou à emergência de uma nova doença humana epidêmica, a febre do Oropouche. As epidemias costumam ocorrer nas estações chuvosas, quando o vírus seria trazido do meio silvestre às comunidades urbanas, sendo transmitido aos seres humanos pelo mosquito Culicoides paraensis (maruim) (PINHEIRO et al., 1981; ROBERTS et al., 1981).

As epidemias de febre do Oropouche são extensas e explosivas acometendo cidades e vilarejos tanto da região Amazônica como do Planalto Central (GONZALEZ-SCARANO & NATHANSON, 1996; KINNEY & CALISHER, 1981). Estima-se em mais de meio milhão o número de casos ocorridos no Brasil nos últimos 30 anos e, além do Brasil, há registros de ocorrências de infecção pelo vírus Oropouche no Panamá, Peru, Suriname e Trinidad (PINHEIRO et al., 2004). Evidências sorológicas demonstraram que o vírus pode circular eventualmente em outras regiões do Brasil, como no interior do Estado de São Paulo em que 2 indivíduos apresentaram anticorpos para o Oropouche(FIGUEIREDO et al., 1986).

O vírus Oropouche apresenta grande capacidade de adaptação, existindo o risco de epidemias da febre do Oropouche em outras regiões brasileiras, uma vez que o mosquito transmissor, conhecido por maruim, é abundante nas regiões litorâneas (ANDERSON et al., 1961) e pelo fato do vírus ter sido recentemente isolado de um macaco do gênero Callithrix sp na região sudeste do Brasil (NUNES et al., 2005).

A patogenia da infecção pelo arbovírus Oropouche é pouco conhecida. Sabe-se que a infecção é sistêmica e provavelmente, viscerotrópica,indicando que no quadro clínico agudo febril deve haver a participação de substâncias mediadoras de reação de fase aguda, incluindo as citocinas: TNF-α, IFNs e IL-1, além de quimiocinas. Contudo, as células que participam da replicação viral não são conhecidas (ARAÚJO et al., 1978).

A febre do Oropouche tem período de incubação de 4 a 8 dias e se caracteriza por quadro abrupto de febre de 39 a 40o_{C, mal-estar,}

cefaléia, anorexia, mialgias e artralgias generalizadas, tonturas, fotofobia, prostração e, em 5% dos casos, exantema máculo-papular em tórax, dorso, braços e pernas. Congestão conjuntival, dor retro-orbitária, tosse, coriza, náuseas e diarréia são ocasionalmente descritas. O quadro clínico perdura por 2 a 5 dias, mas as mialgias, a astenia e, em alguns casos a cefaléia, pode prolongar-se por até um mês. Também, recidiva dos sintomas acontece em até 60% dos pacientes entre 10 a 14 dias após cessar o quadro inicial (PINHEIRO et al., 1982). Meningite linfomonocitária é um achado freqüente nos surtos de febre do Oropouche e o vírus já foi, inclusive, isolado de líquor (PINHEIRO et al., 1982). Esta meningite ocorre comumente na 2a _{semana de doença, tendo evolução}

benigna. Viremia é achado praticamente universal nos dois primeiros dias de doença, mas declina rapidamente podendo o isolamento viral ocorrer até o 5o _{ou 6}o _{dia de doença (PINHEIRO et al., 1981 e 1997). A febre do}

Oropouche na gestação, provavelmente, se associou a abortamento em 2 de 9 grávidas em que a virose ocorreu no segundo mês de gravidez (PINHEIRO et al., 1997). Embora não pareça causar mortalidade importante, a febre por Oropouche causa grande morbidade, com grande impacto econômico e social (VASCONCELOS et al., 1989 e 1992; PINHEIRO et al., 1981 e 1982), uma vez que os pacientes precisam ficar acamados e muitas vezes afluem em grande número aos hospitais, chegando a causar total congestionamento dos mesmos.

Além do vírus Oropouche, no Brasil foram isolados outros Orthobunyavirus que causam doença febril na espécie humana, dentre

eles podemos citar: vírus Caraparu, vírus Guamá, vírus Guaroa e vírus Tacaiuma.

O vírus Caraparu foi primeiramente isolado na região Amazônica (KARABATSOS, 1985) e posteriormente na Mata Atlântica do estado de São Paulo, principalmente na região do Vale do Ribeira, onde existe uma alta prevalência de pessoas soropositivas para este vírus (IVERSSON, 1994). A febre do Caraparu é uma doença de início súbito, apresentando como sintomas, febre alta, cefaléia, mialgias, dor retroocular e fotofobia, que pode ter duração de 4 a 5 dias com evolução para a cura (VASCONCELOS et al., 1998). Estudos demonstraram que o vírus Caraparu pode ter como hospedeiros, tanto roedores silvestres (Akodon, Nectomys, Oryzomys, Oxymecterus e Coendou milanurus), como marsupiais (Didelphis marsupialis) pelo fato dos mesmos terem apresentado anticorpos anti-Caraparu. Além disso, acredita-se que mosquitos Culicidae possam ser os vetores, pois o vírus foi isolado de mosquitos da espécie Culex sacchettae (VASCONCELOS et al., 1992).

O vírus Guamá, primeiramente identificado em Trinidad (JONKERS et al., 1968), tem sido isolado de seres humanos na região Amazônica, apresentando como sintomas: febre moderada, calafrios intensos, mal-estar, tonturas, cefaléia holocraniana, mialgias, artralgias, anorexia, fotofobia e dor à movimentação dos olhos. A duração dos sintomas é de aproximadamente 5 dias e evolui para a cura (VASCONCELOS et al., 1992 e 1998; PINHEIRO et al., 1985). Acredita-se que o ciclo silvático deste vírus envolva Culex portesi como vetor e vários

roedores como reservatórios (Oryzomys e Zygodontomys) (JONKERS et al., 1968).

O vírus Guaroa foi descrito pela primeira vez por GROOT e colaboradores, em 1959, sendo primeiramente isolado em habitantes da Colômbia. No Brasil, o vírus Guaroa foi isolado pela primeira vez a partir da biópsia de fígado de um paciente que apresentava hepatopatia, paralisia e queda de cabelos. Posteriormente, evidências sorológicas demonstraram a presença deste vírus tanto na região Amazônica, onde se encontrou uma alta prevalência de pessoas soropositivas (8 a 18%) (PINHEIRO, 1985; IVERSSON, 1994), quanto no interior do Estado de São Paulo (FIGUEIREDO et al., 1986). A febre do Guaroa tem início abrupto com febre elevada (39o_{C a 40}o_{C), calafrios, cefaléia e mialgias, que podem}

durar por 3 a 5 dias, apresentando evolução benigna. Este vírus tem aves silvestres como reservatórios e mosquitos Anopheles como vetores (KARABATSOS, 1985; VASCONCELOS et al., 1992 e 1998; PINHEIRO et al., 1997).

O vírus Tacaiuma foi encontrado em diversos países como Argentina, Guiana Francesa, Suriname e Brasil (Van TONGEREN, 1967; KARABATSOS, 1985; SABATTINI et al., 1965). No Brasil, anticorpos para o vírus Tacaiuma foram encontrados em seres humanos, cavalos, morcegos, roedores silvestres e pássaros, enquanto isolamento viral ocorreu a partir de amostras de sangue de pessoas febris residentes na região norte do país, de macacos Cebus apella e de mosquitos dos gêneros Haemagogos sp e Anopheles sp. (KARABATSOS, 1985; SABATTINI et al., 1965). Estes artrópodes são considerados os vetores do vírus Tacaiuma na

região Amazônica. Na década de 80, em um inquérito sorológico para arbovírus na região de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, foi demonstrada a presença de anticorpos inibidores da hemaglutinação para o vírus Tacaiuma em um morador de zona rural (FIGUEIREDO et al., 1986). Posteriormente, foram encontrados anticorpos para o vírus Tacaiuma em cavalos da região do Pantanal Mato-grossense (IVERSSON et al., 1993), dando indício de que o vírus Tacaiuma possa estar circulando em todas as regiões brasileiras. Os sintomas da febre do Tacaiuma são além de febre, cefaléia, mialgias, calafrios, astenia e artralgia, apresentando evolução benigna (VASCONCELOS et al., 1998; PINHEIRO et al., 1997).

A maioria das arboviroses descritas ocorre em pessoas que entram em contato com o meio silvestre ou rural. No entanto, existem arboviroses que afetam habitantes das áreas urbanas, como a febre do Oropouche, devido a uma adaptação do vírus tanto ao mosquito transmissor presente nestas áreas, quanto ao hospedeiro humano. Nestes casos as arboviroses são responsáveis por grandes epidemias, que geram, às cidades atingidas, grande impacto econômico e social, uma vez que estas doenças possuem uma natureza debilitante de duração razoavelmente longa, fazendo com que as pessoas atingidas afluam em grande número aos hospitais por necessitar de acompanhamento médico (VASCONCELOS et al., 1989 e 1992; PINHEIRO et al., 1981 e 1982), gerando, assim, um problema de saúde pública.

Diante disso, uma alternativa para tentar conter as epidemias, bem como amenizar os sintomas dessas infecções virais, seria o

tratamento dos indivíduos infectados com drogas antivirais eficientes. No entanto, para todas as infecções virais supracitadas, ainda não existe tratamento antiviral, sendo que, nestes casos recomenda-se o uso de antitérmicos para o controle da febre e antiinflamatórios e antieméticos quando necessário (PINHEIRO et al., 1997).

1.2. Drogas Antivirais

1.2.1. Inibidores da Inosina Monofosfato Desidrogenase

Inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH) é uma enzima que catalisa o primeiro e único passo da síntese de novo de nucleotídeos de guanina (Figura 3).

Figura 3: Esquema da síntese de novo de nucleotídeos de guanina. Enzimas estão em itálico. (Fonte: Adaptado de GRACI & CAMERON, 2006).

Inosina Monofosfato Adenilsuccinato Adenosina Monofosfato Xantosina Monofosfato IMPDH GMP sintetase Guanosina Monofosfato GDP, GTP, dGDP, dGTP Inosina Monofosfato Adenilsuccinato Adenosina Monofosfato Xantosina Monofosfato IMPDH GMP sintetase Guanosina Monofosfato GDP, GTP, dGDP, dGTP

IMPDH converte inosina monofosfato (IMP) para xantosina monofosfato (XMP), a qual recebe grupamento amina pela ação da enzima guanosina monofosfato sintetase (GMP sintetase) e origina guanosina monofosfato (GMP). GMP é então convertida em metabólitos de guanina como GTP e dGTP (Figura 3) (GRACI & CAMERON, 2006).

Até o momento foram identificadas duas isoformas de IMPDH: a forma tipo I que é expressa em baixas concentrações em todos os tipos celulares e a forma tipo II que é altamente expressa em células em estado proliferativo ou em transformação. As duas isoformas apresentam 84% de identidade na sua seqüência de aminoácidos e ambas são cataliticamente ativas quando na forma de tetrâmeros contendo subunidades de 55kDa (JI et al., 2006). O sítio ativo da IMPDH localiza-se na interface monômero-monômero, sendo que seu substrato (IMP) e seu co-fator (NAD+) ligam-se numa fenda presente na região C-terminal de cada tetrâmero (COLBY et al., 1999).

Os metabólitos de guanina como GTP e dGTP provenientes da via sintética de novo são precursores essenciais para a síntese de RNA e DNA, respectivamente. Como IMPDH é a enzima responsável por esta via, a mesma tem sido identificada como um importante regulador da proliferação celular. Além disso, GTP tem importantes funções no estoque de energia, na sinalização intracelular, na tradução realizada pelos ribossomos e na síntese de glicoproteínas (GRACI & CAMERON, 2006).

Diante da importância da IMPDH, esta enzima pode ser alvo da ação de substâncias inibidoras, que já apresentam atividade antiviral

comprovada, como é o caso da ribavirina, ou que vem demonstrando ter ações antivirais, como é o caso do ácido micofenólico.

1.2.1.1. Ribavirina

A Ribavirina (RBV) (1-

β

-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida), comercialmente conhecida como Virazole, é um nucleosídeo sintético, com estrutura semelhante à da guanosina (Figura 4).

Figura 4: Estrutura química da ribavirina. (Fonte: GRACI & CAMERON, 2006).

A RBV foi primeiramente sintetizada por SIDWELL e colaboradores em 1972, os quais também foram responsáveis por demonstrar pela primeira vez a atividade antiviral da RBV sobre muitos vírus de DNA e de RNA tanto in vitro como in vivo (WITKOWSKI et al., 1972; SIDWELL et al., 1972). Apesar disso, a RBV hoje, é somente utilizada no tratamento das infecções causadas pelo vírus da hepatite C (HCV) (em combinação com Interferon-α) (DAVIS et al., 1998; McHUTCHISON et al., 1998; MANGIA et al., 2005), pelo vírus sincicial respiratório (WYDE, 1998;

COOPER et al., 2003) e experimentalmente nas infecções causadas pelo vírus da febre de Lassa (McCORMICK et al., 1986).

Passados mais de trinta anos após a sua descoberta, o mecanismo de ação antiviral da RBV ainda gera controvérsia. Existem até o momento, 5 mecanismos descritos que podem ser os responsáveis pela atividade antiviral da RBV, sendo que os mesmos podem ou não atuar conjuntamente, dependendo do tipo celular e da estirpe viral envolvidos.

No interior da célula, a RBV sofre processo de fosforilação originando as formas mono-, di- e tri-fosfato (WILLIS et al., 1978; PAGE & CONNOR, 1990). A ribavirina monofosfato (RMP), por mimetizar o substrato IMP, é o inibidor competitivo da IMPDH (Figura 3), fazendo com que os níveis de GTP e outros metabólitos de guanina diminuam no meio intracelular (STREETER et al., 1973). A redução nos níveis de GPT e dGTP pode resultar em dois efeitos: um para as células, que com a diminuição da síntese de DNA, RNA e proteínas deixam de proliferar, tendo a RMP um efeito citostático sobre as mesmas (MULLER et al., 1977); e outro para os vírus, cuja redução de GTP e dGTP impede a progressão do ciclo replicativo viral, por prejudicar a tradução, a transcrição e a replicação do RNA ou DNA dos vírus (STREETER et al., 1973). Este mecanismo de ação antiviral é o principal responsável pela inibição da replicação de flavivírus e paramixovírus in vitro (LEYSSEN et al., 2005) e pode explicar a capacidade da RBV em inibir ambos vírus de RNA e de DNA. Contudo, alguns pesquisadores sugerem que a inibição da IMPDH por si só, não é suficiente para explicar a atividade antiviral da RBV. WRAY e colaboradores (1985) observaram que concentrações crescentes de RBV não são capazes de

reduzir completamente os níveis de GTP intracelular, contudo, a dose crescente do medicamento apresenta efeito antiviral sobre o vírus influenza mais e mais pronunciado. Além disso, nem todos os inibidores de IMPDH apresentam atividade antiviral (CROTTY et al., 2000; LANFORD et al., 2001), sugerindo, então, que a RBV tenha outros mecanismos de ação.

A maioria dos RNAs celulares e alguns RNAs virais possuem na sua porção final 5’ uma estrutura essencial tanto para a estabilidade como para a tradução do RNA mensageiro, denominada estrutura de “cap 7-metilguanosina” (GOSWAMI et al., 1979). A formação desta estrutura requer a ação consecutiva de três enzimas, das quais uma é responsável por catalisar a adição de guanosina monofosfato (GMP) na região 5’ do RNA, sendo denominada por isso de guanililtransferase (BISAILLON & LEMAY, 1997). A RBV, na sua forma trifosfatada (RTP), por ser um análogo da guanosina, foi vista formar com a guanililtransferase um complexo covalente enzima-RTP, inibindo a atividade enzimática da mesma e prejudicando o “capping” do RNAm do vírus vaccínia por exemplo, com conseqüente redução da síntese protéica desse vírus (GOSWAMI et al., 1979; BOUGIE & BISAILLON, 2004). Além disso, foi demonstrado através de experimentos bioquímicos que a guanililtransferase possui a capacidade de transferir RMP ao RNA, formando um “cap” contendo RBV em sua estrutura. O “cap” constituído por RBV não é reconhecido pela maquinaria do “capping” do vírus vaccínia e, portanto, não sofre adição do grupamento 7-metil, gerando um RNA com “cap” incompleto que não é reconhecido pelos ribossomos e conseqüentemente não sofre processo de tradução (BOUGIE & BISAILLON, 2004). Este mecanismo antiviral da RBV pode

funcionar para vírus que necessitam do “cap” durante sua replicação, mas é incapaz de explicar a atividade antiviral que a RBV possui sobre os vírus que não utilizam “cap” para gerar sua progênie.

A RBV trifosfato (RTP), além de agir sobre a guanililtransferase, foi vista ter ação inibitória sobre polimerases virais. Estudos in vitro realizados por ERIKSSON e colaboradores (1977) mostraram que a RTP possui a capacidade de inibir a RNA polimerase do vírus influenza e que nem a RBV, nem a RMP apresentaram tal ação. Neste caso, a RTP agiu como um inibidor competitivo da RNA polimerase, competindo com ATP e GTP pelo sítio ativo da enzima. Inibição da polimerase viral por RBV também foi visto para os vírus da estomatite vesicular (FERNANDEZ-LARSSON et al., 1989; TOLTZIS et al., 1988) e HCV (MAAG et al., 2001; VO et al., 2003).

CROTTY e colaboradores em 2000 observaram que a RNA polimerase do poliovírus poderia se ligar a RTP e não ter sua atividade inibida, pelo contrário, a polimerase conseguia adicionar moléculas de RTP ao RNA viral durante o processo replicativo numa razão baixa de incorporação, na ordem de 1 a 2 moléculas de RTP para cada 7500 nucleotídeos do RNA viral. Os pesquisadores observaram ainda que, a RTP por apresentar estrutura análoga ao do GTP e do ATP, era adicionada ao RNA viral no lugar destes nucleotídeos, causando mutações no genoma do poliovírus. Durante o processo replicativo do poliovírus ocorrem normalmente 1,5 mutações por genoma, mas na presença da RTP houve um aumento de 2 a 4 mutações por genoma, dependendo da concentração de RBV adicionada à cultura celular. Esse aumento no número de

mutações superou o limiar permitido de alterações genômicas para o poliovírus, causando no mesmo o fenômeno de mutação letal, onde excesso de mutações origina progênie não infecciosa, com conseqüente perda da viabilidade reprodutiva viral (CROTTY et al., 2000). Estes achados deram a RBV mais uma função dentre as já mencionadas: a de causar mutações de caráter letal no genoma viral. Posteriormente, essa capacidade da RBV em aumentar a freqüência de mutações com conseqüente diminuição da viabilidade viral foi também observada para: réplicons de HCV (LANFORD et al., 2003; ZHOU et al., 2003), vírus GBV-B (LANFORD et al., 2001), vírus Hantaan (SEVERSON et al., 2003) e vírus West Nile (DAY et al., 2005).

Além dos mecanismos antivirais descritos acima, estudos têm demonstrado que a RBV possui a capacidade de modular a resposta imune direcionando-a para um padrão de resposta do tipo Th1 (NING et al., 1998; TAM et al., 1999; HULTGREN et al., 1998). Resposta do tipo Th1 associa-se com imunidade celular e presença da citocina interferon-γ; enquanto resposta do tipo Th2 promove imunidade humoral com presença de interleucina (IL)-4 e IL-5 (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Resposta imune do tipo Th2 tem sido associada ao desenvolvimento de doença crônica nas infecções causadas pelo vírus HCV (TSAI et al., 1997) e estudos in vitro com células humanas têm demonstrado que baixos níveis de RBV (5-10µM) inibem a resposta Th2 das células e promovem uma resposta Th1 tanto em células CD4+ _{como CD8}+ _{(TAM et al., 1999). Contudo, até o momento,}

estudos clínicos não conseguiram comprovar essa ação imunomoduladora da RBV em pacientes infectados por HCV, permanecendo uma dúvida

sobre se este fenômeno ocorre também in vivo. No entanto, permanece o fato de que pacientes infectados por HCV e que fazem uso da terapia antiviral com RBV e interferon-α apresentam carga viral menor que os pacientes que fazem uso de interferon-α somente, reafirmando o papel de droga antiviral para a RBV, sem, no entanto, demonstrar sua função imunomoduladora (PAWLOTSKY et al., 2004).

Utilizando-se de seus mecanismos de ação antiviral, a RBV apresentou atividade antiviral in vitro e/ou in vivo sobre vários vírus de RNA pertencentes a diferentes famílias, como: Paramyxoviridae (HRUSKA et al., 1980; LEYSSEN et al., 2005), Flaviviridae (NEYTS et al., 1996; JORDAN et al., 2000; LEYSSEN et al., 2005), Picornaviridae (CROTTY et al., 2000), Orthomyxoviridae (DURR & LINDH, 1975), Arenaviridae (JAHRLING et al., 1980; ANDREI & DE CLERCQ, 1990) e Bunyaviridae (HUGGINS et al., 1986; SIDWELL et al., 1988 e 1994; CASSIDY & PATTERSON, 1989; CRANCE et al., 1997). Diante do fato da RBV apresentar atividade antiviral sobre diferentes gêneros da família Bunyaviridae (HUGGINS et al., 1986; SIDWELL et al., 1988 e 1994; CASSIDY & PATTERSON, 1989; CRANCE et al., 1997), e pelo fato dos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma pertencerem à mesma, apresentando genoma de RNA e possuindo RNA polimerase, é possível que a RBV possa apresentar atividade antiviral sobre estes vírus, porém, até o momento, não há relatos na literatura sobre a ação deste medicamento sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma.

1.2.1.2. Ácido Micofenólico

O ácido micofenólico (ácido (E)-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-iso-benzofuranil)-4-metil-4- hexenóico) (Figura 5) é um produto de fermentação de várias espécies de Penicillium como: P. brevicompactum e P. stoloniferum (THE MERCK INDEX, 1996).

Figura 5: Estrutura química do ácido micofenólico. (Fonte: LIPSKY, 1996).

O ácido micofenólico (MPA) foi descrito pela primeira vez por FLOREY e colaboradores em 1946 onde os pesquisadores observaram que esta substância apresentava propriedades antifúngicas. Posteriormente, KORZYBSKI e colaboradores (1967) verificaram que essa substância também apresentava propriedades antibacterianas, mas foi em meados de 1969 que PLANTEROSE fez os primeiros relatos de atividade antiviral relacionada ao MPA. Neste estudo, o pesquisador observou que o MPA foi capaz de inibir a replicação em cultura de células, dos seguintes vírus: vaccínia, herpes simplex, Semliki Forest, vírus da encefalomiocardite, Coxsackie B1 e influenza (A-NWS). Entretanto, quando testes in vivo foram

realizados para vaccínia, Semliki Forest e vírus da encefalomiocardite, PLANTEROSE não observou qualquer ação antiviral do MPA. Posteriormente, a função antimicrobiana do MPA deixou de ser avaliada pela comunidade científica, quando este medicamento apresentou atividade antineoplásica (TRESSLER et al., 1994) e imunossupressora, podendo enfim, ser utilizado no tratamento de várias doenças, incluindo artrite reumatóide (GOLDBLUM, 1993), psoríase (EPINETTE et al., 1987) e na prevenção de rejeição de órgãos após transplante (LIPSKY, 1996).

O ácido micofenólico, de maneira similar à RBV, é um inibidor da IMPDH, porém, o MPA não apresenta estrutura análoga de nucleosídeo, como a RBV e não necessita sofrer processos de fosforilação intracelular para ter ação inibitória sobre a IMPDH (ALLISON & EUGUI, 1996). O MPA possui a capacidade de interagir com a IMPDH de maneira a alterar sua estrutura conformacional, levando a formação de agregados anulares de proteína impedindo a atividade enzimática da IMPDH (Figura 6). Estes agregados não se associam a nenhuma organela intracelular e podem ser convertidos aos tetrâmeros em arranjos lineares e funcionais pela ação da GTP (Figura 6). Desta forma, observa-se que GTP age como um antagonista do MPA, por se ligar à enzima e reverter a alteração conformacional ocasionada pelo MPA (JI et al., 2006).

Figura 6: Esquema estrutural das alterações conformacionais ocorridas na IMPDH pela ação de MPA e nucleotídeos. (Fonte: JI et al., 2006).

Com o advento da AIDS e com a descoberta de que o MPA poderia agir sobre a IMPDH diminuindo os níveis intracelulares de GTP e dGTP, ocasionando entre outros efeitos uma ação citostática sobre células proliferativas, diversos grupos de pesquisa começaram a investigar a possibilidade do MPA apresentar alguma ação anti-HIV. Foi assim que em 1995, ICHIMURA & LEVY demonstraram que o MPA, em concentrações clinicamente aceitáveis de 1 a 10µM conseguia suprimir in vitro a replicação do HIV. Posteriormente, MARGOLIS e colaboradores (1999) demonstraram que o MPA apresentava sinergismo com abacavir, um inibidor da transcriptase reversa, aumentando os efeitos anti-HIV. Neste mesmo ano, MARGOLIS e colaboradores propuseram o uso da combinação de micofenolato mofetil (MMF) (agente terapêutico proveniente

do MPA) com abacavir em pacientes portadores de linhagens de HIV resistentes às terapias antiretrovirais convencionais.

A partir destes estudos ou concomitantemente a eles, outros grupos de pesquisa começaram a cogitar a possibilidade do MPA ser utilizado no tratamento de outras doenças virais. Assim, pesquisas demonstraram que o MPA ou seu derivado MMF apresentaram atividade antiviral in vitro e/ou in vivo sobre o vírus da febre amarela (NEYTS et al., 1996), herpes simplex (potencializando a ação do aciclovir, ganciclovir e penciclovir) (NEYTS & DE CLERCQ, 1998), vírus da hepatite B (HBV) (GONG et al., 1999), vírus do dengue (DIAMOND et al., 2002) e reovirus aviário (ROBERTSON et al., 2004). Além disso, o MMF foi capaz de inibir o processo de miocardite ocasionado pelo vírus Coxsackie B3 em um modelo experimental utilizando camundongos, sem, no entanto, inibir a replicação do vírus (PADALKO et al., 2003).

Com relação aos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, não há relatos na literatura descrevendo a ação do ácido micofenólico sobre a replicação destes vírus, sendo que o mesmo poderá apresentar ação antiviral sobre estes vírus, uma vez que a droga inibe a IMPDH e com isso reduz os níveis de GTP intracelular que são necessários para o processo de replicação dos vírus de RNA.

1.2.2. Interferon-alfa

Interferon (IFN)-α é parte integrante de um conjunto de proteínas pertencentes ao grupo dos Interferons (IFNs) que foram primeiramente descritos como substâncias resistentes a pH ácido, produzidas por células incubadas com vírus influenza inativado pelo calor e que poderiam inibir (interferir com) a replicação do mesmo vírus ou vírus heterólogo quando adicionado à outra cultura celular (ISAACS & LINDENMANN, 1957).

O IFN-α, também conhecido por IFN leucocitário pelo fato de ser secretado em abundância por fagócitos mononucleares, pertence ao grupo dos IFNs do tipo I que incluem ainda o IFN-β (interferon fibroblástico) e o IFN-ω (proveniente de células hematopoiéticas) (JOHNSON et al., 1994). Os seres humanos podem expressar mais de 10 subtipos de IFN-α (a partir do gene IFNA), mas expressam somente um tipo de IFN-β (IFNB) e um tipo de IFN-ω (IFNW), sendo que todos os genes estão presentes no cromossomo 9 (SAMUEL, 1991) (Tabela 1). De maneira semelhante, camundongos também expressam vários subtipos de IFN-α (>10), e somente um IFN-β, sendo que os genes estão contidos no cromossomo 4 destes animais (KELLEY et al., 1983 e 1985; DANDOY et al., 1985).

Coletivamente, estes IFNs podem apresentar diversas funções biológicas, como atividade antiviral (ISAACS & LINDENMANN, 1957; GRESSER, 1990), atividade antiproliferativa (FLEISCHMANN & FLEISCHMANN, 1988) e atividade imunomoduladora (MOORE, 1983;

BELARDELLI, 1995 e 1996), dependendo das vias de transdução de sinal ativadas por eles nas células (DARNELL et al., 1994).

Tabela 1: Os tipos e subtipos de IFN tipo I (Fonte: FOSTER & FINTER, 1998).

Lócus gênico Símbolo da proteína Variantes alélicas Interferon-αααα

IFNA1 IFN-α1 _IFN-α1b IFN-α1a

IFNA2 IFN-α2 IFN-α2b IFN-α2a

IFN-α2c

IFNA4 IFN-α4 _IFN-α4b IFN-α4a

IFNA5 IFN-α5 IFN-α5

IFNA6 IFN-α6 IFN-α6

IFNA7 IFN-α7 IFN-α7b IFN-α7a

IFN-α7c

IFNA8 IFN-α8 IFN-α8b IFN-α8a

IFN-α8c

IFNA10 IFN-α10 IFN-α10a _IFN-α10b

IFNA13 IFN-α13 IFN-α13

IFNA14 IFN-α14 IFN-α14a IFN-α14b

IFN-α14c

IFNA16 IFN-α16 IFN-α16

IFNA17 IFN-α17

IFN-α17a IFN-α17b IFN-α17c IFN-α17d

IFNA21 IFN-α21 IFN-α21a IFN-α21b

IFN-α24 Interferon-ββββ

IFNB IFN-β

Interferon-ωωωω

Embora o IFN-α e o IFN-β sejam estruturalmente diferentes, eles reconhecem o mesmo receptor, denominado IFNAR, presente na superfície de todas as células eucarióticas. A ligação desses IFNs ao seu receptor resulta na ativação de duas proteínas, a JAK1 e a Tyk2, que fosforilam os fatores de transcrição STAT1 e STAT2, os quais formam um heterodímero que desloca-se para o núcleo da célula onde se associa com p48/IRF-9 para formar o complexo ISGF3. O complexo ISGF3 liga-se a regiões específicas do DNA e estimula a transcrição de vários genes. Atualmente sabe-se que 100 genes podem ser estimulados à transcrição pela ligação de IFN-α ao receptor, enquanto 300 genes podem ser transcritos pela ligação do IFN-β (DER et al., 1998). Dentre os produtos gênicos transcritos, destacam-se aqueles responsáveis pela atividade antiviral do IFN tipo I como: proteína quinase ativada por RNA de dupla fita (PKR), 2’,5’-oligoadenilato sintetase (2-5AS) e proteínas Mx (KHABAR et al., 2000).

A PKR é uma enzima presente em células eucarióticas em quantidades muito pequenas, que aumenta consideravelmente na presença de IFN tipo I. Contudo, PKR, no interior das células, apresenta-se sob uma forma inativa, não exercendo sua função até que ocorra interação da mesma com RNA de dupla fita proveniente do processo replicativo dos vírus. Interação entre PKR e RNA de dupla fita causa na enzima uma mudança conformacional que resulta em autofosforilação e dimerização tornando-a enzimaticamente ativa. PKR na forma ativa fosforila e inibe um fator celular importante no processo de tradução de

proteínas, denominado eIF-2α prejudicando assim, a síntese protéica (Figura 7) (citado por GARCIA-SASTRE, 2001).

De modo semelhante à PKR, no interior das células eucarióticas existe baixa quantidade da enzima 2’,5’-oligoadenilato sintetase (2-5AS), que aumenta após estímulo celular com IFN tipo I. A 2-5AS também apresenta-se na forma inativa no interior das células, sendo que sua ativação ocorre após interação com RNA de dupla fita. Assim, a 2-5AS enzimaticamente ativa pode exercer sua função na ativação de uma RNase latente (RNase L). A RNase ativada provoca a degradação dos RNAs presentes na célula incluindo os RNAs mensageiros e os RNAs ribossômicos, prejudicando desta forma a síntese protéica (Figura 7) (STARK et al., 1998).

Dentre os produtos gênicos induzidos pelo IFN tipo I, as proteínas Mx são as que mais apresentam evidências experimentais de sua atividade antiviral. Em modelos experimentais utilizando-se animais foi demonstrado que as proteínas Mx, mesmo na ausência de qualquer outra proteína induzida pelos IFN-α/β, foram capazes de bloquear a replicação de diversos vírus (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998). As proteínas Mx são GTPases que fazem parte de uma grande família de GTPases semelhantes à dinamina, as quais estão envolvidas em processos de endocitose e transporte de vesículas (STAEHELI et al., 1986; Van der BLIEK, 1999). Para sua ação antiviral, as proteínas Mx formam oligômeros, sendo que sua atividade GTPase é fundamental nesta ação antiviral, assim como é importante também sua localização no meio intracelular (PTOSSI et al., 1993). O genoma humano produz dois tipos de

proteínas Mx, a MxA e a MxB, ambas induzidas por interferon, mas que divergem na sua capacidade antiviral (AEBI et al., 1989; HALLER et al., 1998; STAEHELI et al., 1993). A proteína MxA normalmente acumula-se no citoplasma da célula e apresenta atividade antiviral sobre membros da família Orthomyxoviridae (vírus influenza A e C e vírus Thogoto) (ARNHEITER et al., 1996; FRESE et al., 1995; HALLER et al., 1998; MARSCHALL et al., 2000; PAVLOVIC et al., 1992), Paramyxoviridae (vírus do sarampo e parainfluenza 3), Rhabdoviridae (VSV), Togaviridae (vírus Semliki Forest) e Bunyaviridae (Vírus La Crosse, Hantaan, vírus da febre do Vale Rift e vírus da febre de sandfly) (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998; PAVLOVIC et al., 1995; FRESE et al., 1996; citado por SAMUEL, 2001). Contudo, as proteínas MxA não apresentam qualquer atividade antiviral sobre os vírus Mengo e EMC, pertencentes à família Picornaviridae (citado por SAMUEL, 2001). Contrariamente ao observado para as proteínas MxA, as proteínas MxB não apresentam propriedades antivirais (Figura 7) (HALLER et al., 1998).

Camundongos também codificam duas proteínas Mx, a Mx1 e a Mx2 (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998). A Mx1 acumula-se no núcleo (DREIDING et al., 1985) e é induzida pela ação de IFN tipo I, sendo capaz de inibir a replicação dos vírus influenza e Thogoto (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998; STAEHELI et al., 1993). Contrariamente a Mx1, o gene que pode originar a proteína Mx2 não é funcional nas linhagens de camundongos de laboratório (STAEHELI & SUTCLIFFE, 1988), sendo, portanto, inviável a utilização destes animais para demonstrar se a Mx2 apresenta ou não atividade antiviral. Contudo,

existem duas linhagens de camundongos, NJL e SPR, que apresentam o gene que codifica a Mx2 funcional. Nestes animais, a proteína Mx2 acumulou-se no citoplasma após estímulo com IFN tipo I e foi capaz de conferir resistência aos animais após inoculação de vírus da estomatite vesicular (VSV) (JIN et al., 1999), apresentando, portanto, ação antiviral.

Figura 7: Mecanismos antivirais induzidos pela ação do IFN tipo I (Fonte: STARK et al., 1998).

O IFN secretado por uma célula infectada pode agir tanto de modo autócrino como parácrino nas células. De maneira autócrina, o IFN tipo I estimula na célula infectada, os mecanismos antivirais anteriormente citados, tendo como conseqüência a inibição do processo replicativo viral. De modo parácrino, o IFN secretado age sobre as células vizinhas que ainda não foram infectadas ativando nas mesmas um estado

antiviral, ou seja, torna as células resistentes à infecção viral (ABBAS & LICHTMAN, 2005).

Além dos mecanismos antivirais já mencionados, o IFN tipo I pode auxiliar o sistema imune no reconhecimento de células infectadas, causando a destruição das mesmas. Neste caso, o IFN tipo I estimula o aumento da expressão de moléculas MHC de classe I na superfície das células infectadas que, carreando peptídeos virais, são facilmente reconhecidas pelos linfócitos TCD8+ _{citotóxicos. Os linfócitos ao}

reconhecerem os antígenos virais via MHC de classe I provocam nas células infectadas a sua morte, estimulando a apoptose nas mesmas ou causando sua lise (ABBAS & LICHTMAN, 2005). O IFN tipo I pode agir sobre células NK (“natural killer”) e aumentar sua atividade citolítica podendo assim, eliminar com mais facilidade células infectadas que deixaram de expressar em sua superfície o MHC de classe I por uma intervenção viral (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Assim, as principais atividades do IFN tipo I funcionam de comum acordo na tentativa de erradicar infecções virais. Por isso mesmo, muitas pesquisas foram e estão sendo realizadas com o intuito de utilizar o IFN tipo I como medicamento antiviral. Para tanto, preparações farmacêuticas contendo IFN-α ou IFN-β começaram a ser produzidas em diversos laboratórios e foram testadas in vitro ou in vivo sobre diversos grupos virais. Destas pesquisas, as preparações de IFN-α demonstraram ter efeito antiviral in vitro e/ou in vivo sobre o vírus da febre sandfly Siciliana (CRANCE et al., 1997), vírus da dengue (DIAMOND et al., 2000), Coronavirus SARS (TAN et al., 2004; STRÖHER et al., 2004), vírus da hepatite murina (FUCHIZAKI et al.,

2003), vírus vaccínia (LIU et al., 2004), vírus Ebola (MAHANTY et al., 2003), rotavírus (PETERSEN et al., 1997) e vírus da febre do Vale Rift (MORRIL et al., 1989). Apesar de resultados promissores, as formulações de IFN-α são utilizadas somente no tratamento das infecções crônicas causadas pelos vírus da Hepatite B e C (DAVIS et al., 1998; McHUTCHISON et al., 1998) e no tratamento das infecções genitais causadas pelo papiloma vírus humano (citado por SEN, 2001).

Como pudemos observar anteriormente, o IFN-α apresenta atividade antiviral sobre dois membros da família Bunyaviridae, o vírus da febre sandfly Siciliana e o vírus da febre do Vale Rift. Adicionalmente, há na literatura uma descrição referente à ação do IFN-α, IFN-β e IFN-γ sobre o vírus Caraparu (BRINTON et al., 1993). Neste estudo, fêmeas de camundongos B6C3F1, de 4 a 6 semanas de idade, foram inoculadas intra-peritonealmente com o vírus Caraparu e após o desenvolvimento de necrose hepática coagulativa sucumbiram à doença e morreram entre 4 a 6 dias após a infecção. Tratamento destes animais com preparações de IFN-α ou IFN-β não evitou a morte dos animais, não apresentando, portanto, atividade antiviral sobre o vírus Caraparu. Contudo, tratamento com IFN-γ aumentou de maneira significante o tempo de vida dos animais infectados/tratados em relação aos animais infectados/não tratados com IFN-γ (BRINTON et al., 1993). Apesar de haver este estudo, não há na literatura qualquer relato da ação antiviral do IFN-α sobre os vírus Oropouche, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, o qual deve, portanto, ser avaliado.

2. OBJETIVOS

Baseado no exposto e na tentativa de estabelecer um tratamento eficaz para as arboviroses causadas pelos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, os objetivos deste trabalho foram:

2.1. Avaliar a ação antiviral in vitro dos medicamentos Ribavirina, Ácido Micofenólico e Interferon-α-2a sobre os Orthobunyavirus: Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, utilizando para tanto, a metodologia de ensaio de placa com células Vero E6.

2.2. Avaliar a ação antiviral in vivo do medicamento Ribavirina e da citocina recombinante Interferon-αA de camundongo sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, utilizando camundongos suíços recém-nascidos como modelo experimental.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Amostras Virais

As amostras dos vírus Oropouche (BeAn19991), Guamá (BeAn277), Guaroa (BeH22063) e Tacaiuma (BeAn73) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Pedro Vasconcelos, do Instituto Evandro Chagas - Belém, Brasil e pela Profa. Dra. Amélia Travassos da Rosa, da Universidade do Texas - Texas, EUA. A amostra do vírus Caraparu (SPAn2049) foi doada pela Profa. Dra. Terezinha Lisieux Coimbra, do Instituto Adolfo Lutz - São Paulo, Brasil.

A partir destas amostras virais foram obtidos os estoques virais ou sementes virais.

3.2. Estoque viral ou semente viral

As sementes virais foram utilizadas tanto para infectar as células quanto os camundongos e foram preparadas como descrito a seguir. Amostras do vírus Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa (GROV) e Tacaiuma (TCMV) foram diluídas 1/100 em solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,85% (salina) e foram inoculadas intracerebralmente em camundongos suíços recém-nascidos (1 dia de vida) na quantidade de 20µL/camundongo. Após o aparecimento dos sintomas de encefalite nos animais caracterizado por paralisia dos membros

posteriores, tremor, dificuldade em se alimentar, os mesmos foram sacrificados por hipotermia, para conservação dos vírus, e foram identificados e armazenados em freezer –70o_{C. Posteriormente, os cérebros}

destes animais foram retirados, macerados e misturados em salina tamponada em fosfato (PBS) pH 7,2 – 7,4, numa proporção de 1:10 p/v (1 cérebro para 0,9mL de PBS). A suspensão obtida foi centrifugada a 2000×g por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado, identificado e armazenado à temperatura de –70o_{C até o uso.}

3.3. Experimentos in vitro

3.3.1. Cultura de células

Células de rim de macaco verde africano, também denominadas células Vero E6 (ATCC-CCL81) foram mantidas em meio mínimo essencial (MeM, Cultilab, Campinas-SP, Brasil) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), sob uma temperatura média de 36o_{C e na presença de 5% de CO2. Os repiques para}

manutenção celular foram realizados a cada 3 ou 4 dias, com a utilização de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil) para o desprendimento celular.

3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vitro

• Ribavirina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em solução de NaCl a 0,85% em água destilada e estocada a 4o_C.

• Ácido micofenólico (Sigma Chemical Co. St. Louis MO): diluído em solução etanólica a 30% e estocado a 4o_C.

• Interferon-alfa-2a ou Roferon-A (Hoffmann-La Roche, EUA): mantido a 4o_C.

• Guanosina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em solução de etanol a 30% e estocada a 4o_C.

• Solução de “trypan blue” utilizada no ensaio de citotoxicidade: Para cada 10mL da solução estoque adicionou-se 100mg de “trypan blue” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 10mL de PBS. Esta solução foi armazenada no escuro à temperatura ambiente.

• Solução de agarose 1% utilizada no ensaio de placa: Para cada 200mL de solução estoque adicionou-se 2g de agarose “low-melting-point” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 200mL de água destilada. A suspensão assim preparada foi esterilizada a 120o_{C e armazenada em}

geladeira. No momento do uso, o gel formado era liquefeito colocando-se a agarose em microondas por 2 minutos seguido de manutenção da solução em banho-maria a 37o_{C até o uso.}

• Meio MeM 2x utilizado no ensaio de placa: Para cada litro de meio adicionou-se 200mL de MeM 10x (suplementado com glutamina e antibiótico) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 100mL de SBF (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 20mL de uma solução de aminoácidos

não-essenciais (0,2mM) (Gibco BRL, Life Technologies, Inc.), 2mL de uma solução de piruvato de sódio (2mM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 38mL de uma solução de bicarbonato de sódio a 8,4% e 500mL de água destilada ou água deionizada em MILLI-Q. Todos os compostos foram misturados, com exceção do SBF e o pH da solução foi corrigido para pH 7,2 – 7,4 com soluções de bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio. Posteriormente, foi adicionado à solução água destilada ou água deionizada em MILLI-Q em q.s.p. 900mL. O meio obtido foi esterilizado por processo de filtragem em membrana de poro de 0,22µm em um sistema fechado (Corning, NY, EUA). Após a filtração, o SBF foi adicionado ao meio e o mesmo foi aliquotado e armazenado em geladeira até o momento do uso.

• Solução de “naphtol blue-black” utilizada no ensaio de placa: Para cada litro da solução estoque adicionou-se 1,0g de “naphtol blue-black” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 13,6g de acetato de sódio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 60mL de ácido acético glacial (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e 940mL de água destilada. Esta solução foi armazenada no escuro à temperatura ambiente (MORENS et al., 1985).

3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-αααα-2a sobre células Vero E6

A avaliação da toxicidade dos medicamentos selecionados sobre as células Vero E6 foi realizada por meio da metodologia de exclusão por “trypan blue” (KINCHINGTON et al., 1995). Resumidamente, células Vero

E6 distribuídas em placas de 24 cavidades receberam somente meio ou este adicionado de diferentes concentrações de RBV, MPA ou IFN-α-2a (Tabela 2). A placa foi, então, incubada por 3 dias em estufa a 36o_{C e 5%}

de CO2. Decorrido o período de incubação, as células provenientes do

sobrenadante e as células desprendidas das cavidades com auxílio de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), foram centrifugadas a 2000×g por 10 minutos a 4o_{C e ressuspensas em uma solução (v/v) de PBS e de}

“trypan blue” (500µL de cada). Em seguida, realizou-se a contagem de células mortas (azuis) e vivas (não coradas) em câmara de Neubauer e a porcentagem de células viáveis foi calculada tanto para as células incubadas com meio, como para as células incubadas com as diferentes concentrações dos medicamentos. Determinada a concentração máxima não tóxica, diluições da droga abaixo deste valor e incluindo o mesmo foram utilizadas nos experimentos in vitro na presença dos vírus.

Tabela 2: Concentração dos medicamentos adicionados à cultura de células Vero E6.

Medicamento Concentrações utilizadas

Ribavirina 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256 µg/mL

Ácido micofenólico 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128 µg/mL Interferon-alfa-2a 1; 10; 100; 1.000; 10.000; 100.000

3.3.4. Otimização da metodologia de ensaio de placa

O ensaio de placa utilizado para quantificação viral, foi padronizado por nós, baseado na metodologia preconizada por MORENS e colaboradores em 1985, com algumas modificações.

Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades e incubadas por 24 horas a 36°C e 5% CO2 tiveram o meio removido e no

lugar deste foi adicionado 200µL de meio (controle negativo) ou 200µL das diferentes diluições virais (10-2 _{a 10}-6 _{ou 10}-3 _{a 10}-7_{) provenientes da}

diluição de alíquotas da semente viral em meio MeM contendo 5% de SBF. As amostras foram distribuídas em quadruplicata conforme demonstrado na figura 8 e as células foram incubadas por 2 horas a 36o_{C e 5% de CO2,}

sofrendo agitação branda a cada 30 minutos. Após o período de incubação, tanto o meio como o inóculo viral foram removidos e em seguida, adicionou-se 1mL/cavidade de meio proveniente da mistura (v/v) de agarose 1% e de meio MeM 2x e as células foram incubadas em estufa por 3 dias para OROV e GUAV, 5 dias para CARV e GROV, e 9 dias para TCMV. A cada 3 dias o meio (500µL de MeM 2x/agarose) era substituído para manutenção da viabilidade celular. Decorrido o período de incubação, o meio foi removido por completo e no lugar deste adicionou-se 500µL da solução de “naphtol blue black” e as placas foram incubadas por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, a solução de “naphtol blue black” foi removida e as placas formadas pela ação citolítica dos vírus foram contadas utilizando-se microscópio invertido. O título viral

obtido foi determinado como PFU (Unidade Formadora de Placa) por mililitro (mL), cujo cálculo está exemplificado na figura 8:

Exemplo de cálculo de PFU/mL baseado na figura anterior:

• Diluição viral onde é possível a contagem individual das placas (em branco): 10-5

• Média do total da contagem das placas: 8 placas ÷ 4 (quadruplicata) = 2

• Resultado A: 2 x 105 PFU/200µL do inóculo viral

• Correção do valor obtido para 1mL: multiplica por 5 o resultado A • Resultado B (definitivo): 2 x 105 _{x 5 PFU/mL = 1,0 x 10}6 _PFU/mL • Neste caso, o título viral é: 1,0 x 106 _PFU/mL

Figura 8: Esquema ilustrativo de uma placa de 24 cavidades após ser submetida à metodologia de ensaio de placa, bem como um exemplo de cálculo do título viral obtido pela leitura desta placa.

3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do IFN-αααα-2a sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro

Uma vez determinadas as concentrações não tóxicas dos medicamentos para as células Vero E6 e uma vez padronizado o ensaio de placa para OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, fomos avaliar a atividade antiviral dos medicamentos sobre os vírus utilizando-se de 3 diferentes análises segundo a metodologia preconizada por DIAMOND e colaboradores (2002).

Primeiramente analisamos o efeito antiviral dos medicamentos quando adicionados à cultura celular, na concentração máxima não tóxica, em um período antecedente à infecção viral. Para este fim, células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica 24 horas antes do contato com o inóculo viral (item 3.3.4), junto do inóculo viral e posteriormente ao mesmo no momento da adição do meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero E6 receberam somente meio nestes mesmos períodos. Os medicamentos foram recolocados a cada três dias quando o meio das células Vero E6 era substituído por meio novo (item 3.3.4).

Em uma segunda análise, fomos avaliar o efeito antiviral dos medicamentos quando adicionados em cultura celular num período posterior à infecção viral. Para tanto, células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica dos medicamentos 2 horas após a adição do inóculo viral conjuntamente ao meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero

E6 receberam somente meio neste período. Além do período de 2 horas após a infecção viral, foi testado também a atividade antiviral dos compostos quando os mesmos eram adicionados 24, 48 e 72 horas após a infecção viral. Da mesma maneira, os medicamentos eram recolocados a cada três dias no momento da troca do meio de manutenção.

A terceira análise foi realizada somente após o medicamento ter apresentado capacidade antiviral significante sobre os vírus, quando da aplicação da primeira e segunda análise anteriormente descrita. Assim, a terceira análise foi realizada com a finalidade de obter uma concentração do medicamento menor que a máxima concentração não tóxica e que fosse capaz de inibir de maneira significante a replicação viral em tratamentos iniciados 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral. Portanto, tal análise poderia sugerir uma dose com eficácia antiviral, mas que por estar em menor concentração causaria menor dano celular.

A partir dos dados obtidos destas três análises, foi possível predizer a possibilidade dos medicamentos selecionados de apresentarem ou não atividade antiviral em experimentos in vivo, os quais foram realizados em seguida.

3.4. Experimentos in vivo

3.4.1. Animais

Foram utilizados em todos os experimentos camundongos suíços recém-nascidos provenientes do biotério central da Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto-SP, Brasil. Os animais foram mantidos em caixas individuais num sistema isolado no biotério do Centro de Pesquisa em Virologia (USP), onde todos os experimentos foram realizados. Todos os protocolos experimentais utilizando animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP) através do número 006/2004 (Anexo 10.3).

3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vivo

• Ribavirina (Item 3.3.2) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). • Interferon-alfaA recombinante de camundongo expresso em E. coli (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO): diluído em uma solução de NaCl a 0,85% e de albumina bovina a 0,1% conforme instruções do fabricante, aliquotado e estocado a -70oC. No momento do uso, o IFN-αA foi diluído

em solução fisiológica gelada e permaneceu em gelo no decorrer dos experimentos in vivo.