Foi considerado as bexigas com lesões mais representativas dos grupos de animais e as dispersões para o tratamento a que foram sumetidos levaram aos seguintes espectros (Figura 31). A partir dos espectros podemos obter a tabela com os picos identificados (Tabela 5).
Figura 31: Espectro típico de absorção do infravermelho Transformada de Fourier das bexigas dos grupos de estudo em análise, e as formulações a que cada grupo de tratamento foi submetido com suas bandas determinadas. Controle (a), Câncer (b), formulação de rGo (c), grupo tratado com rGO (d), formulação de rGo+Cis (e), grupo tratado com rGO+Cis (f), formulação de rGo+Doxo (g), grupo tratado com rGO+Doxo (h), formulação de rGo+Cis+Doxo (i), grupo tratado com rGO+Cis+Doxo (j).
93
94
Tabela 5: Análise do espectro de FTIR das bexigas urinárias Controle (Grupo 1), Câncer (Grupo 2), Câncer+rGO (Grupo 3), Câncer+rGO+CIS (Grupo 4), Câncer+rGO+DOXO
(Grupo 5) e Câncer+rGO+CIS+DOXO (Grupo 6).
Comprimento de onda (cm-1) Atribuições do pico Ref
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6
3346 Composto
3321 Banda NH 1
3301 3301 3301 Banda amida A 1
3291 Amida A (alongamento N-H) 1
3002 Anel de C-H; Vibrações de alongamento de CH (permanece
inalterada pela substituição de de metoxi e hidroxil) 1 2922 2920 2922 2922 2922 2920 Vibração de alongamento assimétrico de CH2 das Cadeias de acil
(lipídios) 1
2852 2852 2852 2854 Vibração de alongamento simétrico de CH2 das Cadeias de acil
(lipídios) 1
2844 2842 Alongamento simétrico do metoxi 1
2373 * 2363 2363 2363 2363 * 2353 * 2343 2343 2343 2343 2343 * 2333 * 2142 * 2112 2110 2110 *
2102 Combinação de uma rotação prejudicada e ligação de O-H (água) 1
2082 *
1743 1743 Modo de alongamento do C=O dos lipídios 1
1738 1738 Modo de alongamento do C=O dos lipídios 1
1733 Banda de ester de ácido graxo 1
1643 1643 Composto Banda de Amida I (devido as vibrações de
alongamento de C=O
1
95
Cont...
Comprimento de onda (cm-1) Atribuições do pico Ref
1553 1553 1553 1553 Alongamento CO; Folha-α da amida II (banda de amida II
principalmente força do alongamento de C-N e vibrações fracas de ligações de C-N-H ligado ao alongamento de C=O
1
1543 1543 Amida II 1
1473 Ligação de CH2 de cadeias de metileno em lipídeos 1
1463 1463 1460 Modo de quebra CH2 da cadeia de acil (fosfolipídeo) 1
1452 Banda de proteínas; Metoxil em forma de guarda chuva;Forma de
ligação de C-H de proteínas estruturais
1
1450 Deformação do metileno em biomoléculas 1
1402 Ligações simétricas de CH3 de grupos de metil de proteínas 1
1392 Particula de C 1
1385 Alongamento C-O, deformação de C-H, deformação de N-H 1
1372 Alongamneto de citosina C-N, guanina 1
1352 *
1247 Colágeno I e IV;Alongamento assimétrico do fosfato 1
1244 1244 1244 Colágeno I e IV; Alongamento assimétrico do fosfato 1
1237 Composto de amida III e vibração do fosfato de ácidos nucleicos 1 1234 Composto de amida III assim como vibração fosfato de ácidos
nucleicos
1
1164 1162 Modo de alongamento principalmente de C-O dos grupos de C-OH
de serina, threosine, e proteínas tirosina
1
1154 Vibrações de alongamento de ligações de hidrogênio de grupos C-OH 1
1104 Alongamento simétrico de P-O-C 1
1094 1096 Alongamento simétrico PO-2 (fosfato II) 1
1084 DNA (banda devido a vibrações de PO-2; Alongamento simétrico do
fosfato; Absorbância por ligações fosfodiester de fosfato/ cadeias de açúcar de ácidos nucléicos; Região de ácido nucléico; Banda de fosfato
ácido nucleíco
1
1069 Característica de tecido maligno 2
* Não foi encontrado pico na literatura
1Movasaghi et al (2008) 2Mehrotra et al. (2010)
96
Estudos realizados por Caiene et al. (2012) relatam que a utilização de espectroscopia de infravermelho (IV) na determinação bioquímica e estrutural de tecidos sem a utilização de corantes ou outros agentes de contraste era utilizada desde os anos de 1940. Esta técnica permitiu a investigação de macromoléculas químicas associadas a patologia que se manifestam através de alterações químicas no tecido. Essas alterações seriam refletidas no espectro de IV com alterações nas formas e intensidade de grupos funcionais específicos das macromoléculas. As amostras biológicas são complexos abundantes de proteínas, lipídeos, ácidos nucleicos e carboidratos, assim os espectros no IV contém bandas de absorção fundamentado no modo vibracional destes complexos.
A análise da frequência de grupos característicos do tecido permitem uma estimativa qualitativa da sua composição química. Dentre as características biomoleculares o estado conformacional, o comprimento da cadeia lateral e as ligações inter e intra cadeias são características que podem ser avaliadas. A técnica do espectro Infravermelho Transformada de Fourier (FTIR) tem sido bastante utilizada no campo do câncer na compreensão da biologia do tumor. As diferenças observadas nos tecidos controle, câncer e os grupos tratados refletem no espectro mudanças em relação aos ácidos nucleícos, lipídeos e proteínas, com a presença de novas proteínas e mudanças na sua conformação e composição (Mehrotra et al., 2010).
Foi observado uma banda em 3346 no grupo rGO+CIS+DOXO, a mesma foi encontrada na dispersão deste composto, indicando que tal banda é característica da dispersão de tratamento.
O controle apresentou banda em 3321 cm-1 característico de banda NH associado
a aminas secundárias, o qual aparece deslocado nos grupos câncer, rGO, rGO+CIS em 3301 cm-1, o deslocamento observado é indicativo de alteração na estrutura das proteínas,
enquanto no grupo rGO+DOXO a banda referente a amida A apresenta um alongamento em N-H, indicando uma tendência de recuperação do tecido, isso porque a banda de amida A é característica de tecidos normais.
Caine et al. (2012) identificaram que as bandas entre 3050 e 2800cm-1 tratam-se
de uma região dominada por absorções de alongamento simétrico e assimétrico da ligação C-H do metil, metileno e metino, grupos funcionais comuns em ácido graxos. No estudo realizado, observamos banda carbonil-éster em 1725-1745cm-1 que pode ser característica
do órgão quando rica em lipídeos. Nesse sentido, notamos que em todos os grupos em discussão, com exceção do grupo rGo+DOXO, foram encontradas as bandas referidas, indicando uma reestruturação dos fosfolipídios do urotélio.
97
Glassford et al. (2013) apontam que utilizando o FTIR podemos ainda obter informações sobre a estrutura e o comportamento de proteínas, onde existem 5 bandas características, sendo três conhecidas como a bandas de amida, as mais usadas em estudos de IV. A banda de amido I possui a absorção mais forte no IV com comprimentos de onda entre 1600 e 1700 cm-1, aparece devido vibrações de alongamento de C=O juntamente
com alongamento fraco de C-N e ligações de N-H, já a banda de amido II ocorre nas bandas de 1500 a 1600 cm-1 é derivada principalmente do alongamento da ligação de C-
N com o plano de ligação de N-H, a banda de amido III possui comprimento de onda de 12000 a 13000 cm-1, sendo que a vibração devem-se ao complexo de ligação com N-H e
o alongamento de N-H.
A banda de amida I, amida II e amida III foram encontradas respectivamente nos grupos tratados com rGO+CIS e rGO+DOXO, em todos os grupos e no grupo de rGO+DOXO e rGO+DOXO+CIS. As três bandas de amida são responsáveis pela elucidação da estrutura secundária da proteína, sendo que a amida I é mais sensível as mudanças estruturais devido a ligação de hidrogênio e a mais usada em análise da estrutura secundária de proteína. (Mehrotra et al., 2010).
No grupo Câncer podemos encontrar pico no comprimento de onda ~1380cm-1.
De acordo com estudos de Caine et al. (2012), esse comprimento de onda corresponde a vibração de ligação simétrica de lipídeos e proteínas entre as bandas de amida II e amida III. Um pico em 1473 cm-1 no grupo rGO+DOXO representa uma ligação de cadeia de
metileno em lipídeos, indicando uma reestruturação dos fosfolipídios do urotélio.
As bandas vibracionais de amida I aparecem principalmente devido as vibrações de alongamento de C=O do grupo amida da cadeia de proteínas, caracterizada pela estrutura secundária da proteína em forma de α-hélice. Já as bandas em 1543 cm-1 e 1554
cm-1 de ligações de N-H vibracionais de amida são atribuídas a estrutura secundária de
folha-β de proteínas, sendo uma região sensível a mudanças da geometria molecular e ligações de hidrogênio de grupos peptídeos. A característica de folha-β em tecidos malignos, pode ser atribuído a conversão de alfa a beta na estrutura secundária de proteínas em tecido carcinomatoso (Mehrotra et al., 2010).
Os mesmos autores relatam que a perda do perfil proteico indica uma diversificação de função durante um processo neoplásico, o que vêm de encontro as alterações observadas nos espectros no atual estudo.
98
Bandas em 1402 cm-1 no grupo rGO+DOXO e 1452 cm-1 no grupo rGO indicam
alterações que correspondem a ligação de proteínas devido a exposição aos respectivos tratamentos, apontando uma reestruturação das proteínas que compõe o tecido.
Uma banda em 1392 cm-1 no grupo rGO é caracterizada por ser de uma partícula
de carbono o que pode significar não ser necessariamente atribuído ao composto, haja vista que o rGO possui bandas características em 1350 e em 1580 cm-1 como
caracterizado no item 5.1.6 e mascarado ao realizar a dispersão em Pluronic F68. No presente estudo foram encontrados comprimentos de onda abaixo de 1300 cm- 1 no grupo rGO+DOXO. Caine et al. (2012) citam que esses picos em comprimentos de
onda abaixo de 1300 cm-1 devem-se a alongamentos de grupos fosfodiéster encontrados
no DNA, RNA e fosfolipídeos; sendo que se o alongamento for simétrico ~1235 cm-1, se
assimétrico ~1080 cm-1, cuja hipótese deve-se a utilização da Doxo no tratamento dos
animais, isso porque a mesma se liga ao DNA e inibe a síntese de ácido nucléico.
De acordo com Mehrotra et al. (2010), a observação de bandas na região de 1238 cm-1 é característica do alongamento assimétrico de grupos fosfodiéster encontrado nos
ácidos nucléicos. Bandas na região de 1084 deve-se a interações no DNA devido a vibrações de fosfato, alongamento simétrico por ligações de fosfodiéster. Bandas na região de 1104 cm-1 devem-se ao alongamento de da ligação P-O-C.
No presente estudo a banda 1238 cm-1 foi identificada no grupo
rGO+CIS+DOXO; banda em 1084cm-1 no grupo rGO+DOXO e banda 1104 cm-1 no
grupo rGO+CIS, indicando a ação dos quimioterápicos nos ácidos nucleicos das células neoplásicas.
No grupo Câncer foi observado um pico em 1069 cm-1, o qual de acordo com
estudos realizados por Mehrotra et al. (2010) é característico de tecidos malignos.
A diferença de vibração simétrica ou assimétrica das vibrações de fosfato indica uma elevada quantidade de DNA em tecido maligno causada pela intensa atividade proliferativa nas células cancerosas (Mehrotra et al., 2010).
5.7 Medição de Espectroscopia de Raman
A espectroscopia de Raman é um complemento ao FTIR, é baseada na dispersão inelástica de fótons de um laser, pois as bandas que são fortes pela técnica de Raman geralmente são fracas no FTIR e vice-versa. A maior limitação da técnica de Raman deve-
99
se a dispersão espontânea dos fótons, sendo extremamente fraca e requerendo um longo tempo de aquisição para medição (Caine et al., 2012).
Assim como no FTIR foram consideradas as bexigas com lesões mais representativas dos grupos de animais e as dispersões de tratamento a que foram sumetidos levaram aos seguintes espectros (Figura 32). A partir dos espectros podemos obter a tabela com os picos observados (Tabela 6).
Figura 32: Espectro típico de raman das bexigas dos grupos de estudo em análise, e as formulações a que cada grupo de tratamento foi submetido com seus picos determinados. Controle (a), Câncer (b), formulação de rGo (c), grupo tratado com rGO (D), formulação de rGo+CIS (e), grupo tratado com rGO+CIS (f), formulação de rGo+DOXO (g), grupo tratado com rGO+DOXO (h), formulação de rGo+CIS+DOXO (i), grupo tratado com rGO+CIS+DOXO (j).
100 ...Cont.
101
Comprimento de onda (cm-1) Atribuições do pico Ref
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6
730 Fosfotidilserina (lipídeo) 2
858 Tirosina, colágeno 1
866 863 Vibração de ribose, um dos modos distintos de RNA (com 915 e 974 cm-1) 1
930 Picos de carboidratos para soluções e sólidos 1
976 Vibração de ribose, um dos modos distintos de RNA (com 874 e 915 cm-1) 1
1086 1089 Vibração de gauche (C-C) 1
1242 Amida III (folha β e distribuição aleatória) 1
1259 Citosina (NH2), guanina
Amido III 1
1271 Movimento de CHα’ 1
1285 Citosina 1
1307 1308 1305 CH3/CH2 twisting ou modo de ligação de lipídeos / colágeno 1
1325 Modo wagging CH3CH2 em bases purina de ácidos nucleícos 1
1328 Fosfolipídeos típicos 1
1333 Guanina 1
1452 1452 1452
Banda de proteínas
Metoxil em forma de guarda chuva
Forma de ligação de C-H de proteínas estruturais 1
1457 Desoxirribose 1
102
Cont...
Comprimento de onda (cm-1) Atribuições do pico Ref
1462 1461 Dissacarídeos, sucrose, deformação de proteínas simétricas de CH2 e
CH3
3
1662 1662 Triptofano
Triptofano &/ ou folha-β Triptofano (IgG)
1
1667 1667
Banda de proteína Alongamento da banda C=C Estrutura α hélice da amida I Modo estrutural de proteínas tumorais
1
1668 1668 Alongamento do carbonil (C=O) Ester de colesterol 1
1758
Uma das posições de absorção para o alongamento de vibrações de
C=O do cortisol 1
1770 Vibrações de alongamento da ligação C=O da δ lactona 4
2870 2873 *
2907 Composto 1
2925 Alongamento simétrico de CH3 1
2951 Alongamento assimétrico de CH3 1
2953 Alongamento assimétrico de CH3 1
*não foi encontrado na literatura atribuição ao pico.
1 Movasaghi et al., 2007
2 Harvey et al., 2013
3 Hu et al., 2013
103
Segundo Kallaway et al. (2013) a espectroscopia de Raman é considerada um potencial método para os histopatologistas na identificação e classificação de mudanças bioquímicas relacionadas a carcinogênese, demostrando ser rápida, reprodutível e não destrutiva da composição específica de tecidos.
Estudos realizados por Chen et al. (2014) relatam que quando células normais iniciam um processo patogênico a estrutura conformacional e as macromoléculas que constituem a célula levam a uma mudança no tecido, assim a análise da espectroscopia de Raman pode revelar alterações fisiológicas, bioquímicas e estruturais em células bem como em tecidos, podendo ainda caracterizar uma bioquímica maligna quando associada a outras moléculas. A utilização desta técnica na análise de biomoléculas tem a vantagem de requerer uma pequena quantidade de amostra, ser rápida e resistente a interferência de água, não causando danos ao tecido. Assim, é amplamente usada na área médica através de: determinação de estruturas secundárias de proteínas; interações do DNA e fármacos quimioterápicos; diagnóstico de células danificadas assim como tecidos e análise de fluídos corporais.
Os mesmos autores relatam ainda, que no tecido normal da bexiga urinária encontramos bandas em 875, 1080, 1289, 1303, 1446 e 1657 cm-1, as quais estão
aumentadas e podem ser associadas a lipídeos e proteínas. Draga et al. (2010) assinala que as bandas observadas no câncer de bexiga 1330, 1462 e 1662 cm-1 referem-se a
guanina, proteínas e triptofano respectivamente. Os picos do tecido normal geralmente aparecem deslocados ou ausentes nos tecidos tumorais, sendo deslocados entre 1 a 5 cm- 1. É reconhecido que a detecção de aminoácidos não aromáticos é um desafio porque eles
produzem fracos sinais vibracionais devido sua fraca polaridade. No entanto, aminoácidos aromáticos exibem picos significativos vibracionais devido a presença do anel de benzeno. Os picos identificados de ácido nucléico são decorrentes da vibração de bases de DNA, que são mascaradas em tecido normal. Durante a transformação maligna as células proliferam de maneira incontrolada e a quantidade de DNA aumenta significativamente, o que é acompanhado por mudanças de fosfato, desoxirribose ou bases (Chen et al., 2014).
De acordo com Hu et al. (2013) a presença de ácidos nucleicos na banda em 1340 cm-1 deve-se a malignidade da lesão neoplásica, tratando-se de um processo celular com
elevados níveis proteicos e lipídicos, o que condiz com os espectros analisados, onde foi visualizado a banda no Grupo Câncer, caracterizado pela administração do MNU induzir uma hipermetilação no DNA
104
Para observar a interação dos nanocompostos no tratamento do CBNMI foram considerados somente os picos diferentes dos apresentados no grupo controle e Câncer. Deste modo podemos identificar no grupo de tratamento rGO os seguintes picos: 930, 1285, 1770, 2958 cm-1.
Picos de carboidratos em 930 cm-1 de acordo com estudos realizados por
Kamemoto et al. (2010) revelam que esse acúmulo do composto ocorre durante a maturação, desaparecendo com a perda de diferenciação durante a neoplasia. O pico 1285 citosina de acordo com estudos de Buckmaster et al. (2009) são associados com ácidos nucleicos e a estrutura de DNA, sugerindo um começo da fragmentação do DNA durante apoptose, indicando que somente o nanocarreador rGO induz a apoptose celular.
No grupo de tratamento rGo+CIS foi observado o pico em 1667 cm-1,segundo
Movasaghi et al. (2007) refere-se a uma banda de proteína, alongamento da banda C=C, estrutura α hélice da amida I. Isso garante a hipótese que a Cis levou a uma reestruturação do tecido.
No grupo de tratamento rGO+DOXO foram observados os seguintes picos: 858, 1259, 1325, 1667, 2953 cm-1. Stone et al. (2007) citam que o pico em 858 cm-1 refere-se
a tirosina e o colágeno. A DOXO induz o colágeno 18, o qual é antiangiogênio consecutivamente levando a diminuição da proliferação celular.
O pico 1325 cm-1 ocorre devido ao movimento de CH3CH2 em bases purina de
ácidos nucléicos, segundo estudos de Buckmaster et al. (2009), indicando que esse pico é um marcador para morte celular, o qual sugere ocorrer pela interação entre a DOXO e o DNA. A banda 1667 cm-1 caracteriza alongamento da ligação C=C, ou estrutura α hélice
da amida I, sugerindo uma reestruturação das proteínas do tecido.
Lyng et al. (2007) afirmam que a banda em 2953 cm-1 refere-se ao alongamento
assimétrico de CH3, mostrando que a espectroscopia de Raman é capaz de distinguir o
CH3 de CH, CH2, os quais possuem as mesmas características no espectro.
Mudanças nas propriedades ópticas do tecido, como o aumento na espessura do urotélio, e mudanças morfológicas (densidade celular aumentada) causam uma atenuada penetração da luz excitada, diminuindo os fótons emitidos pelos tecidos na região do estroma dos tecidos neoplásicos em comparação com o tecido normal (Mo et al., 2009).
No grupo de tratamento rGo+CIS+ DOXO foram observados os seguintes picos: 1242, 1328, 1457, 2951 cm-1. De acordo com Movasaghi et al. (2007) o pico 1242 cm-1
105
(2001) as vibrações de amida III é atribuída a estrutura de proteínas como a elastina e colágeno.
Movasaghi et al. (2007) identifica o pico 1328 cm-1 como fosfolipídeos típicos,
sugerindo uma reestruturação dos fosfolipídeos do urotélio. Para Movasaghi et al. (2007) a banda 1457 cm-1 é característica de desoxirribose, a hipótese de sua expressão é
decorrente da interação dos quimioterápicos com o DNA.
Bandas entre 1230 a 1300 cm-1 de acordo com Draga et al. (2010), referem-se a
lipídeos e proteínas, os quais no tecido normal da bexiga urinária são derivados da submucosa e camada muscular, sendo que para Chen et al. (2014) os picos de lipídios são gerados principalmente devido a vibração da membrana celular, ligações de C-C e C-H de lipídeos e de ácidos graxos insaturados C=C, o que indica a reestruturação nos fosfolipídeos das membranas nas células do urotélio.
Segundo Chen et al. (2014) picos atribuídos a compostos de amino III são principalmente produzidos pela vibração de alongamento de C-N e vibração de ligação N-H, os quais indicam proteína em estrutura de folha-β, a expressão de tais picos é indicativo de uma reestruturação das proteínas do tecido.
As mudanças que ocorrem estão associadas com a progressão da doença, como no caso da bexiga, onde os tumores geralmente são papilares e bastante vasculares que não penetram áreas necróticas (Stone et al., 2007). A identificação de mudanças químicas no espectro de Raman de tecidos saudáveis e tecidos patológicos permite o entendimento dos efeitos dos tratamentos, podendo-se otimizar as informações patológicas (Jong et al., 2006), sendo que a morte celular não ocorre como uma lenta degradação de biomoléculas, mas um evento singular rápido (Buckmaster et al. 2009). A espectroscopia de Raman permite uma primeira aproximação entre as bases bioquímicas promovendo um melhor entendimento do processo patológico e da carcinogênese (Stone et al., 2007).
106
6 CONCLUSÃO
Ao final das atividades desenvolvidas e mediante aos objetivos traçados na concepção deste estudo, pode-se concluir que:
- Todas a técnicas empregadas na caracterização da amostra de rGO mostraram- se úteis, fornecendo dados que confirmaram a natureza do composto. A utilização de um conjunto de técnicas demonstrou ser de importância e necessária para a obtenção de resultados confiáveis e mais seguros;
- A baixa toxicidade de rGO foi comprovada pela avaliação hepática com valores mais expressivos de TGO nos Grupos Câncer+rGO+CIS e Câncer+rGO+DOXO quando comparados com o Grupo Câncer+rGO+CIS+DOXO, podendo indicar um acúmulo no fígado decorrente de suas metabolizações, comprometendo seu funcionamento; e pela avaliação renal onde os valores de creatinina mostraram acometimento no Grupo Câncer enquanto que nos Grupos que receberam tratamento foi evidenciado valores próximos ao Grupo Controle, na avaliação do parâmetro de uréia o acometimento renal foi observado no Grupo Câncer, nos grupos com CIS e DOXO há uma tendência de recuperação renal devido ao rGO contornar a nefrotoxicidade dos quimioterápicos. Os indicadores bioquímicos indicam que o sistema nanoestruturado levou a uma redução na distribuição dos fármacos, minimizando os efeitos adversos;
- Na análise histopatológica, avaliando o grau de severidade das lesões, o Grupo Câncer comprovou que o modelo de indução foi efetivo, o Grupo+Câncer+rGO e Câncer+rGO+CIS não mostraram ser tratamentos efetivos. O Grupo Câncer+rGO+DOXO foi observado uma diminuição no grau de severidade das lesões. O