Melhoramento genético e Transformação de cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar é uma planta de grande interesse econômico, pois dela podem ser obtidos diversos produtos. Toda a planta pode ser utilizada em processos industriais, pois sua biomassa contém grande quantidade de açúcares, lignina, celulose e hemiceluloses. Hoje a cana-de-açúcar serve para produção de alimento, farmacêuticos e de energia. O setor sucroalcooleiro vem ganhando amplo espaço tanto nacional como internacionalmente, graças à necessidade e à constante busca de novas fontes de energia, principalmente energia renovável. Até o momento, o etanol produzido de cana ainda é obtido através de fermentação do caldo, mas agora as pesquisas estão evoluindo para o desenvolvimento de biocombustíveis de segunda geração a partir da degradação de componentes do bagaço como a celulose (GOEBEL e SALLAM, 2011).

Mesmo apresentando o sistema de produção de açúcar e etanol mais eficiente do mundo, o crescimento da demanda por esses produtos no Brasil exige uma expansão da área cultivável e aumento da produtividade. Com isso crescem as preocupações quanto à demanda de água, a poluição do solo e do ar e também quanto a fatores que afetam a produção, como a imprevisibilidade do clima, fatores abióticos e o ataque de doenças e pragas.

Existem mais de 1500 espécies de insetos que atacam as lavouras de cana-de-açúcar em todo o mundo (BOX, 1953). No Brasil, a broca da cana D. saccharalis tem sido a praga mais devastadora durante muitos anos, mas o uso do controle biológico vem sendo realizado com sucesso para manter a população deste inseto em níveis baixos. Entretanto, após relatos da presença da broca-gigante em canaviais do estado de São Paulo surgiu uma grande preocupação, pois este inseto não possui nenhum inimigo natural conhecido e o uso de pesticidas químicos tem sido ineficaz (BOTELHO; GARCIA; MACEDO, 2006). Dessa maneira a identificação de formas alternativas para o seu controle torna-se uma exigência.

Apesar de ser a forma principal de obter novas cultivares, o melhoramento genético convencional por meio de cruzamentos é um processo laborioso, que consome tempo e que depende de fatores como época de florescimento, viabilidade do pólen da variedade doadora, incompatibilidade genética ou citoplasmática, entre outros (CESNIK e MIOCQUE, 2004). No caso da cana-de-açúcar essa inviabilidade torna-se ainda mais evidente devido à falta de germoplasmas que possam ser utilizados para a introgressão de resistência ao ataque de insetos (WENG et al., 2011).

150 O uso de transgenia em cana-de-açúcar tem sido uma estratégia amplamente estudada e utilizada para a introdução de características de interesse. Atualmente existem plantas transgênicas de cana-de-açúcar com diversas características de interesse comercial, como plantas contendo o gene nptII (ARENCIBIA et al., 1998; BOWER et al., 1996; ELLIOTT et al., 1998; GAMBLEY; FORD; SMITH, 1993), resistentes a herbicidas (CHOWDHURY e VASIL, 1993; GALLO-MEAGHER e IRVINE, 1996; MANICKAVASAGAM et al., 2004), ao vírus do mosaico (BUTTERFIELD et al., 2002; INGELBRECHT; IRVINE; MIRKOV, 1999), ao vírus Fiji (MCQUALTER et al., 2004), à bactéria causadora da escaldadura das folhas (ZHANG; XU; BIRCH, 1999), ao estresse hídrico (MOLINARI et al., 2007; ZHANG et al., 2006) e com alterações metabólicas (ENRÍQUEZ et al., 2000; MCQUALTER et al., 2005; SANTOSA et al., 2004; VICKERS et al., 2005).

Foram obtidas também, plantas transgênicas resistentes a insetos expressando uma toxina Cry1Ab (BRAGA et al., 2003), uma toxina Cry1Ab truncada (ARENCIBIA et al., 1999; ARENCIBIA et al., 1997), uma toxina Cry1Ac (WENG et al., 2011), expressando inibidores de proteases (CHRISTY et al., 2009; FALCO e SILVA-FILHO, 2003) e expressando lectinas (SETAMOU et al., 2002). Esses dados são animadores e indicam que a identificação e expressão de moléculas tóxicas contra a broca-gigante em plantas transgênicas de cana-de-açúcar podem levar à diminuição dos ataques do inseto nas lavouras.

Para a transformação de plantas de cana-de-açúcar, os métodos mais utilizados são o uso da bactéria Agrobacterium tumenfaciens e da biobalística. A transformação mediada por agrobactéria produz linhagens transgênicas com baixo número de cópias do DNA transferido (T-DNA), permite transferir longas cadeias de DNA com risco pequeno de quebra durante a inserção e permite maior estabilidade de integração do DNA no genoma ao longo das gerações. Porém no caso da cana-de-açúcar e de monocotiledônias em geral, o uso desta ferramenta é restringido a algumas poucas variedades e com baixa eficiência (JACKSON; ANDERSON; BIRCH, 2013).

Atualmente, o método de biobalística tem sido o mais utilizado para o desenvolvimento de eventos de cana-de-açúcar transgênica. O uso desta ferramenta para a introdução do DNA no genoma da planta não depende do genótipo a ser utilizado, mas necessita, principalmente, do desenvolvimento de técnicas de cultura de tecidos e de regeneração de plantas, as quais já vêm sendo aperfeiçoadas em trabalhos recentes (BASNAYAKE; MOYLE; BIRCH, 2011; IJAZ et al., 2012). Contudo, uma limitação inerente a essa ferramenta deve-se à chance maior de inserções múltiplas do transgene,

151 resultando em silenciamento ou instabilidade da integração no genoma das plantas (LESSARD et al., 2002), além de apresentar um risco de inserção de partes do backbone do vetor de transformação. Ao transformar calos embriogênicos de cana por meio de agrobactéria e biobalística, Jackson e colaboradores (2013) avaliaram a eficiência, a estabilidade da inserção e o número de cópias do gene repórter da enzima luciferase. Ao transformar células da variedade Q117 utilizando diferentes concentrações do vetor inteiro e também diferentes concentrações apenas do cassete de expressão, os autores observaram que o uso de baixas concentrações (cerca de 6 ng) do cassete de expressão pode melhorar a qualidade dos eventos obtidos.

Assim, com o desenvolvimento ou atualização de ferramentas para a transformação de plantas, associados à identificação de variedades mais responsivas à cultura de tecidos e à regeneração, espera-se que o tempo de obtenção de novas cultivares seja reduzido bem como abrirá a possibilidade de introdução de características que não são encontradas naturalmente nos germoplasmas de cana (JAIN et al., 2007).

O objetivo do presente trabalho é o de transformar calos embriogênicos de cana-de- açúcar, visando a obtenção de plantas resistentes ao ataque de T. licus licus, contendo contruções gênicas que permitam a expressão de toxinas Cry, estudadas no capítulo II deste estudo e de dsRNAs, estudados no capítulo III, visando uma estratégia alternativa de administração ds dupla fita de RNA para larvas neonatas da broca-gigante.

152 2. Material e Métodos