Seleção das sequências para validação de genes de referência

Um dos objetivos deste trabalho foi a análise da expressão relativa de dois genes envolvidos em processos vitais do inseto, os genes que codificam a enzima quitina sintase II e V-ATPase subunidade A. Uma etapa importante para essa análise é estabelecer quais genes podem ser utilizados como referência para a quantificação relativa da expressão do gene alvo. A confiabilidade de qualquer experimento de análise de expressão relativa por qRT-PCR pode ser maior com a inclusão de genes que funcionem como controles endógenos para corrigir variações na eficiência de amplificação das reações e na quantificação de uma amostra para outra, sendo chamados de genes de referência ou housekeeping genes, os quais se presumem que tenham a expressão constitutiva sob diferentes condições experimentais (BUSTIN, 2002; RADONIC et al., 2004; SCHMITTGEN e LIVAK, 2008). Esses genes têm sido escolhidos de duas maneiras: a partir de estudos previamente realizados com os mesmos ou utilizando homólogos de genes amplamente utilizados como referência em outros organismos modelos (TENG et al., 2012). Entretanto, essas escolhas empíricas geralmente não possuem embasamento experimental e podem levar a interpretações errôneas da maioria dos resultados (JIAN et al., 2008).

Dentre os genes de referência mais utilizados na literatura, encontram-se o codificador da subunidade ribossomal 18S (RPS18), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), fator de elongação (EF-1α), β-actina (β-ACT), α-tubulina (α-TUB) e β-tubulina (β-TUB) (LOURENÇO et al., 2008; MARONICHE et al., 2011; SCHARLAKEN et al., 2008). Existem evidências que sugerem que os genes de referência nem sempre são expressos de maneira estável em diferentes condições. O gene da β-actina, por exemplo, pode ser regulado pelo matrigel, uma matriz gelatinosa repleta de proteínas produzida por alguns tipos de células. Neste trabalho, Selvey e colaboradores (2001), demonstraram por qRT-PCR ao contrário do que foi observado para a expressão de β-actina, que a expressão do gene da subunidade ribossomal 18S apresentou um padrão de expressão mais consistente, com melhor reprodutibilidade e sem sofrer regulação pelo matrigel. Outros genes de referência como α- tubulina e GAPDH foram citados por apresentarem níveis de expressão variados em determinadas circunstâncias como, diferentes tecidos ou estágios de desenvolvimento (BRUNNER; YAKOVLEV; STRAUSS, 2004; DHAR et al., 2009; DONG et al., 2011; LORD et al., 2010; PEI et al., 2007; TRIVEDI e ARASU, 2005; WANG et al., 2010).

121 Os trabalhos de análise da expressão de genes de insetos começaram muito incipientes, na maioria das vezes os estudos eram realizados utilizando como base os genes de referência já conhecidamente utilizados para outros organismos, porém sem qualquer trabalho de avaliação da estabilidade da expressão dos mesmos. Lourenço e colaboradores (2008) iniciaram a validação de genes de referência de abelhas, em diferentes tecidos e também entre abelhas operárias e abelhas rainhas. Foram analisados os níveis e a estabilidade da expressão dos genes da actina (ACT), proteína ribossomal 49 (RP49), fator de elongação 1-Alfa (EF1-α) e da proteína de associação ao TATA box (TBP-AF) por meio do uso de programas de computador disponíveis na rede mundial como o geNorm (VANDESOMPELE et al., 2002), NormFinder (ANDERSEN; JENSEN; ORNTOFT, 2004) e Bestkeeper (PFAFFL et al., 2004). No mesmo ano, Scharlaken e colaboradores (2008) realizaram a validação de 11 genes de referência de cérebros de abelhas infectadas por E. coli utilizando os mesmos programas.

Visando avaliar a expressão diferencial de genes de T. castaneum, pesquisadores identificaram diversos genes que vinham sendo rotineiramente utilizados como genes de referência por diferentes autores. Ao analisar a estabilidade da expressão de cada um desses genes, com os programas geNorm e NormFinder, após a infecção do inseto por fungos, eles observaram que a β-actina, α-tubulina e RPS6 não apresentavam estabilidade suficiente para serem usados em qRT-PCR. Os genes mais estáveis foram o genes de proteínas ribossomais RPS13, RPS18 e RPL13a. Além disso, foram identificados outros genes que podem ser utilizados como normalizadores, sintaxina-1, sintaxina-6 e E-caderina (LORD et al., 2010).

Novos trabalhos de validação de genes de referência em insetos têm surgido, a maioria deles utilizam os programas supracitados como uma maneira mais rápida e confiável de determinar a estabilidade e a forma de expressão de genes em diferentes condições fisiológicas e para vários tipos de tecidos (MARONICHE et al., 2011; PAIM et al., 2012; VAN HIEL et al., 2009). Recentemente, foi realizado estudo de validação de genes de referência para quatro lepidópteros, incluindo Bombyx mori, Plutella xylostela, Chilo supressalis e Spodoptera exígua (TENG et al., 2012). Com esses resultados os autores proveem novas oportunidades de aplicação desta metodologia para a caracterização e análise de expressão de genes de insetos considerados importantes pragas da agricultura.

No caso da broca-gigante não existe indicação de genes de referência até o momento. Dessa forma foi realizada uma extensa busca no transcritoma desse inseto visando identificar genes utilizados como referência em experimentos de qRT-PCR com outros organismos. Foram selecionados sete genes candidatos que codificam para a síntese de β-actina (β-ACT),

122 α-tubulina (α-TUB), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), fator de elongação 1- Alfa (EF-1α), ubiquitina (UBQ), fosforibosil-pirofosfato-sintetase (PRPP) e para a subunidade ribossomal S18 (RPS18). Os genes foram analisados quanto à sua estabilidade de expressão em diferentes fases do ciclo de vida do inseto como, ovo, larvas neonatas, larvas de último ínstar, pupas e adultos. A análise da estabilidade foi realizada com os programas Bestkeeper, geNorm e NormFinder, que são aqueles que vêm sendo utilizados com maior frequência nos trabalhos científicos.

Há certo tempo existe uma preocupação na comunidade científica internacional em relação às inúmeras fontes de erro inerentes a um experimento de qRT-PCR, desde o desenho do experimento, passando pela integridade e garantia de repetibilidade da extração de RNA e síntese de cDNA, até a PCR propriamente dita e seus métodos de análise (BUSTIN, 2010; FLEIGE e PFAFFL, 2006; FLEIGE et al., 2006; LEFEVER et al., 2009). Apesar de utilizar um método fluorimétrico para quantificar o RNA, a eficiência da síntese de cDNAs não foi quantificada. Para tentar diminuir o erro gerado por uma possível diferença de quantidade de cDNA, todas as amostras foram diluídas previamente 30, 40 e 50 vezes, e uma corrida prévia mostrou que 40 vezes era uma quantidade considerada suficiente para que os valores de Cq se mantivessem entre os ciclos 15 e 30. Assim, todos as corridas foram feitas diluindo o cDNA 40 vezes. As qRT-PCRs realizadas para os sete genes foram feitas colocando todos os cDNAs para um mesmo gene numa mesma placa. Um mesmo cDNA com o mesmo gene foi sempre utilizado como normalizador entre as placas. As análises das curvas de dissociação de cada corrida não apresentaram dímeros de iniciadores nem amplificações inespecíficas.