Metabolismo energético

As principais vias metabólicas que tiveram suas enzimas mais, ou exclusivamente, expressas na condição Fe+, foram aquelas relacionadas ao metabolismo energético, sugerindo uma reprogramação metabólica em resposta ao acúmulo do ferro.

O fungo Paracoccidioides brasiliensis em condições de depleção de ferro, mostrou uma diminuição de proteínas relacionadas ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (PARENTE et al., 2011). Muitas das enzimas dessa via metabólica possuem um cluster de Fe-S em seu centro ativo, o que justificaria a troca metabólica para vias nas quais as enzimas não utilizem o ferro em seu núcleo catalítico, o que pode ser visto em C. violaceum. Corroborando os resultados de nosso trabalho, Nwugo e colaboradores (2011) ao estudarem a resposta proteica de Acinetobacter baumannii às condições de carência e excesso de ferro, observaram um aumento na expressão de proteínas relacionadas ao ciclo do TCA quando a bactéria foi cultivada em um meio rico neste metal. Proteínas desta via como a succinato desidrogenase (Sdh) e Aconitato hidratase (AcnB) tiveram a sua expressão induzida pelo ferro tanto em C. violaceum quanto em A. baumannii, indicando que o uso de enzimas que possuem o ferro em seu centro catalítico e, consequentemente, as vias que utilizam essas enzimas, é uma estratégia disseminada entre os microrganismos

para evitar o acúmulo de ferro livre no citoplasma. Também relacionado ao ciclo do TCA, as proteínas citrato sintase (GtlaA), α-cetoglutarato desidrogenase (SucA) e Succinil-CoA sintetase (SucC) também aumentaram a sua expressão em decorrência do ferro, sugerindo que não apenas as proteínas da via com o metal em sua composição aumentam mas também aquelas que não o possuem. Assim, provavelmente devido ao aumento na produção de intermediários do ciclo do TCA produzidos pelas ferro-enzimas, todo este ciclo está mais ativo, em consequência de regulação alostérica causada pelos intermediários, que são substratos para etapas seguintes da via.

O ciclo do Glioxilato é uma via metabólica na qual algumas de suas enzimas fazem parte do ciclo do ácido tricarboxílico. Apesar disso, este ciclo não acontece em mamíferos devido a ausência de duas proteínas exclusivas dessa via, a Isocitrato Liase (AceA) e a Malato sintase (AceB), sendo encontrado apenas em alguns invertebrados, plantas e microrganismos (ENSIGN, 2006). Pieper e colaboradores (2010) ao estudarem os efeitos da carência de ferro na bactéria patogênica Yersinia pestis observaram uma diminuição na expressão de enzimas tanto da via do ciclo do TCA quanto do Glioxiltato. Em C. violaceum foi observado o aparecimento da malato sintase e um aumento na expressão da isocitrato liase na condição Fe+. Esta via é um desvio do ciclo do TCA, sendo responsável pela síntese de succinato a partir de duas moléculas de Acetil-CoA. Além disso, permite a assimilação de carbono a partir de compostos C2 como o acetato o que pode levar a gliconeogênese ou outros processos biosintéticos (ENSIGN, 2006; DUNN et

al., 2009). AceA e AceB, juntamente com outras enzimas do ciclo do Glioxilato,

também estão relacionadas com o mecanismo de patogenicidade de algumas bactérias como revisado por Dunn e colaboradores (2009). O crescimento de bactérias mutantes nestas enzimas torna-se ineficiente em meio com ácidos graxos ou acetato, sugerindo que estas enzimas sejam necessárias para virulência. Soma-se a isso o fato da Malato Sintase ter sido relacionada com atividade de adesina, aumentando a aderência de Mycobacterium turbeculosis em superfícies epiteliais de pulmão (MUNÕZ-ELÍAS e MCKINNEY, 2005; KINHIKAR et al., 2006). Dessa forma, o aumento de atividade do ciclo do Glioxilato em C. violaceum, além de ter um papel na reprogramação

metabólica, poderia também estar relacionado com o sucesso da patogenicidade da bactéria, visto que o cultivo com o ferro está reprimindo seu crescimento como é possível observar no gráfico de crescimento (Figura 7).

Ainda relacionado ao metabolismo energético, foi observado o surgimento de uma subunidade da enzima NADH desidrogenase (NuoD). Esta enzima faz parte do complexo NADH: ubiquinona oxirredutase, responsável pela oxidação do NADH, contribuindo para o gradiente de prótons da cadeia respiratória. Como as outras enzimas mencionadas acima, a NuoD possui em seu centro catalítico um núcleo de ferro e enxofre, o que justificaria o aumento em sua expressão na condição Fe+.

A glicólise é a principal via catabólica da glicose. A degradação da glicose até o piruvato faz parte do metabolismo energético central da maioria dos sistemas biológicos, com grande conservação de rotas entres os domínios

Eukaryota e Bacteria, divergindo em algumas minúcias em Archaea

(VERHEES et al., 2003). É observado um aumento na expressão de enzimas que compõem a via da glicólise em diversos trabalhos que investigaram as consequências das limitações de ferro em bactéria e fungos (PARENTE et al., 2011; JO et al., 2009; FRIEDMAN et al., 2006). Dessa forma, é de se esperar que aconteça uma diminuição nas enzimas dessa via em C. violaceum quando cultivada em grandes concentrações desse metal. Boa parte das enzimas responsáveis pelas etapas iniciais da oxidação da glicose foi representada com significância estatística. A etapa inicial da glicólise (etapa preparatória) converge para a degradação de uma molécula de glicose (seis carbonos) até duas de gliceraldeído-3-fosfato (G3F, três carbonos). As enzimas Frutose 1,6- bifosfato aldolase e Triose Fosfato Isomerase (AgaY e TpiA, respectivamente) aumentaram a expressão em C. violaceum na condição Fe+. A segunda etapa da glicólise, a etapa de pagamento, compreende o final dessa via na qual finalmente os intermediários oxidados da glicose são convertidos em piruvato. De maneira contrária ao que foi observado na etapa preparatória, enzimas como a Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, Fosfoglicerato quinase e Piruvato quinase (GapA, Pgk e PykF, respectivamente) deixaram de ser expressas e/ou diminuíram a sua expressão na condição experimental. Ao que parece, C. violaceum está iniciando a glicólise até as etapas que formam o

G3F, enquanto que a oxidação deste intermediário até o piruvato e, consequentemente, até o Acetil-CoA (etapa catalisada pela Piruvato desidrogenase – não detectada em níveis significantes) está diminuindo. Dessa forma, o ciclo do TCA estaria perdendo a principal via que o alimenta. Assim, a

C. violaceum necessitaria de vias anapleróticas para alimentar este ciclo, o que

pode ser observado pelo aumento na expressão de enzimas como a Acetil-CoA sintetase (AcsA), Glutamato desidrogenase (GdhA) e Aspartato Amônia-Liase (AspA) que produz Acetil-CoA, α-cetoglutarato e fumarato, respectivamente. A não-utilização do gliceraldeído-3-fosfato no restante da glicólise pode estar relacionada com o direcionamento deste composto para alguma outra função, provavelmente relacionada com a adaptação da bactéria a condição de estresse. O aparecimento da enzima Glicerol kinase (GlpK), que produz G3F a partir de glicerol e ATP, na condição Fe+ é mais um indício de que C.

violaceum necessita aumentar os níveis dessa molécula para realizar alguma

outra função que não o metabolismo energético usual. As proteínas envolvidas no metabolismo de lipídios foi outro grupo de proteínas que, apesar de pouco representadas, foram encontradas na análise do perfil protéico. A Acil-CoA desidrogenase (CaiA), enzima chave no catabolismo de ácidos graxos, apareceu em C. violaceum na condição Fe+, indicando um aumento da beta- oxidação, processo no qual há uma grande produção de acetil-CoA, o que seria mais uma via anaplerótica que estaria alimentando o ciclo do TCA. Em contrapartida, foi observada uma diminuição de enzimas relacionadas com a biossíntese de lipídios. A acetil-CoA carboxilase catalisa a etapa inicial na formação de malonil-CoA, reação irreversível no anabolismo de ácidos graxos. Quatro subunidades desta enzima (AccA-D) tiveram a sua expressão diminuída ou desapareceram na condição Fe+. Esses resultados mostram que C.

violaceum está mobilizando sua reserva lipídica, provavelmente para alimentar

o ciclo do TCA. Parente e colaboradores (2011) observam diferenças nesse resultado em que enzimas envolvidas na beta-oxidação diminuíram a sua expressão em P. brasiliensis em condições de escassez de ferro. A figura 15 integra algumas vias metabólicas relacionadas com o metabolismo energético em C. violaceum.

Figura 15 Integração do meta das enzimas com ferro em seu e do ciclo do Glioxilato. Entret primeira etapa está mais Gliceraldeído 3-fosfato, que p violaceum.