Ghislain et al. (1994), isolaram o gene de A. thaliana que codifica para a AK (ATP: L- aspartato 4-fosfotransferase) a partir de uma biblioteca de DNA genômico, usando o gene ak-hsdh de cenoura como sonda hibridizante. A região codificando a apoproteína é interrompida por 15 íntrons. Foi identificada uma seqüência para direcionamento ao cloroplasto upstream da região codificante o que explicaria a localização no cloroplasto da enzima. Análise da seqüência 5' revelou a presença de elementos promotores conservados, como seqüência similares ao sítio de união de O2 e de GCN4 de levedura.
O gene ak-hsdh de Arabidopsis, como já descrito em cenoura (WEISEMANN; MATTHEWS, 1993), esta estruturado em 4-domínios, na região 5' localiza-se o peptídeo trânsito e o domínio AK; uma região interdomínio; e na região 3' o domínio HSDH (GHISLAIN et al. 1994).
Dante et al. (1999), clonaram e caraterizaram o gene DapA que codifica para DHDPS, a partir de plântulas de Coix lacryma-jobi cv Adlay. O gene DapA, foi observado estar presente em cópia simples e estruturado em três éxons interrompidos por dois íntrons. Detalhes da estrutura na região 5´ revelaram uma seqüência de união para GCN4 upstream ao sítio de início da transdução. A análise da expressão do gene DapA mostrou aumento nos níveis de mRNA dhdps em coleoptiles, embriões imaturos e endospermas. Plântulas crescidas no escuro apresentaram níveis diminuídos de mRNA.
Clones e cDNAs codificando a enzima bifuncional LOR-SDH foram isoladas a partir de Arabidopsis (TANG et al., 1997; EPELBAUM et al., 1997) e milho (KEMPER et al., 1999).
Tang et al. (1997), identificaram e caraterizaram um cDNA de Arabidopsis que codifica para uma enzima SDH monofuncional (designado cAt-SDH) e um cDNA LOR-SDH
(designado cAt-LOR-SDH). A proteína estaria conformada de um domínio LOR, um domínio intermediário e o domínio SDH, como foram também observados para outros polipeptídios bifuncionais, como AK-HSDH (GHISLAIN et al., 1994; GALILI, 1995). Finalmente, foi observado que SDH e LOR-SDH são codificados por um simples gene em Arabidopsis.
Kemper et al. (1999), isolaram um clone de cDNA (ZLORSDH) que codifica para a enzima bifuncional LOR-SDH de endosperma de milho. Foi observado banda simples quando hibridizado o mRNA ZLORSDH com DNA genômico de milho, sorgo e Coix, sugerindo a presença de um gene em copia simples na família Andropogoneae sp. A análise de seqüências de aminoácidos do polipeptídeo LOR-SDH de milho, mostrou uma estrutura em domínios similar a observada para LOR-SDH de Arabidopsis (DANTE et al., 1997).
A análise de seqüência dos genes lor-sdh de milho e Arabidopsis contêm seqüências TATA e CCAAT no contexto do promotor e também na região interna (Figura 4). Isto permitiria um promotor para a produção de transcritos codificando o polipeptídeo bifuncional e o outro para a produção de transcritos SDH monofuncionais. Ainda, seqüências de união para GCN4 podem ser encontradas em regiões promotoras localizadas upstream e internamente no gene de milho, mas somente na região promotora interna do gene de Arabidopsis. Sítios de união para O2 estão presentes nas regiões promotoras upstream e interna do gene lor-sdh de Arabidopsis, mas somente na seqüência promotora upstream do gene lor-sdh de milho. Possivelmente, ambas as seqüências O2 e GCN4, estão envolvidas na regulação transcricional dos genes lor-sdh de milho e Arabidopsis, e, portanto, a ausência de uma seqüência O2 no promotor interno de milho deveria explicar porque esta espécie expressa apenas o polipeptídeo bifuncional, entretanto Arabidopsis expressa a enzima LOR-SDH e a enzima SDH monofuncional a partir do mesmo gene (ARRUDA et al., 2000).
Mauri et al. (1993), demonstrou que O2 pode substituir a proteína GCN4 em células transgênicas de levedura. Foi observado que a seqüência protegida pela união de O2 é também o sítio de união do fator transcricional GCN4.
De grande interesse, resulta a presença destas duas seqüências na região promotora dos genes que codificam para ak-hsdh de cenoura (WEISEMANN; MATTHEWS, 1993) e Arabidopsis (GHISLAIN et al., 1994), e DHDPS de Coix lacryma jobi (DANTE et al., 1999).
Trabalhos anteriores informaram que a regulação transcricional mediada pela proteína O2 em vários genes codificando proteínas de endosperma envolveu também a união da proteína GCN4 a mesma seqüência na região promotora (LHOMER et al., 1991; MADDALONI et al., 1996; YUNES et al., 1998).
Zhu-Shimoni et al. (1997), utilizaram um transgene contendo a região promotora AK- HSDH (seqüência GCN4 deletada) fusionada a GUS e transformaram plantas de tabaco. A análise funcional do transgene revelou diminuição na atividade da enzima AK-HSDH. Posteriormente, Yunes et al. (1998), verificou a união da proteína quimérica β-Gal::O2 de milho a seqüência para o sítio de união de GCN4 no promotor do gene 22kDa α-coixina. Entretanto, Dante et al. (1999), não observaram a união de O2 (β-Gal::O2) de milho com a sítio de união para GCN4 do gene dhdps de Coix.
Estas seqüências reguladoras são muito similares ao sítio de união a GCN4 existentes na maioria dos genes de levedura que codificam as enzimas envolvidas na biossíntese dos aminoácidos e donde GCN4 atua regulando a expressão das enzimas em resposta as necessidades de aminoácidos (HINNEBUSCH, 1988).
Estudos de expressão transitória do promotor C-hordeína, sugerem que a seqüência GCN4 box poderia regular a expressão do gene desta proteína de reserva de cevada em resposta ao nitrogênio (MULLER; KUNDSEN, 1993).
Grant e Bevan (1994) sugerem que o NH3 produzido pela desaminação de ASN para
formar ASP seria o sinal que induz a expressão dos genes das proteínas de reserva. Usando o gene quimérico para o promotor da asparraginase de pepino fusionado a GUS, observaram coloração azul nas células do endosperma de tabaco e o máximo de expressão foi alcançado dias prévios ao início da expressão dos genes que codificam para as proteínas de reserva. Este período é também caracterizado pela conversão rápida de ASN em ASP (KARCHI et al., 1993). É possível que a indução dos genes que codifica para as proteínas de reserva da semente bem como os genes que codificam para as enzimas envolvidas na síntese de aminoácidos, seja regulada pelos níveis de NH3. Recentemente,
Hernández-Sebastià et al. (2005), informaram que os níveis de ASN em soja atuariam como um sinal metabólico do status de nitrogênio da semente controlando o acúmulo de produtos de armazenamento durante o desenvolvimento de sementes em linhas de soja para baixa e elevada proteína.