Várias mutações nos genes de endospermas de milho foram observadas alterando a síntese de proteínas de reservas da semente (MERTZ et al., 1964).
Os genes mutantes mais importantes para melhorar a qualidade das proteínas de milho são opaco2 (MERTZ et al., 1964) e floury2 (NELSON et al., 1965).
O gene o2 afeta um lous do cromossomo VII que controla a transcrição de gene que codificam para proteínas de reserva nas sementes de milho (KODRZYCKI et al., 1989) e é segregado mendelianamente como um simples gene recessivo. Entretanto o gene fl2 é semidominante e localizado no cromossomo IV (KODRZYCKI et al., 1989).
Embora, o2 altere favoravelmente o espectro de aminoácidos nos grãos de milho comparado ao milho normal, ele apresenta várias deficiências que limitam seu uso comercial. No referente à produção de grãos o2 apresenta queda da produção, correlacionado com uma diminuição no peso de 10% a 15%. Os teores de umidade relativa são maiores o que implica na necessidade de secagem adicional após a colheita. Os grãos são farináceos de tonalidade cinza e aparência opaca o que contrasta com a semente brilhante e transparente do milho flint ou dent. Consequentemente, as sementes o2 são mais susceptíveis a infeção por Sitophilus oryzae (perda de peso do grão), Cephalosporium acremonium e Fusarium moniliforme (podridão da semente). Para outras características da planta a informação disponível não sugere qualquer relação significante do gene o2 no referente a mudanças na longitude da espiga, diâmetro da espiga, número de linhas de grão por espiga e número de grãos por linha da espiga (SINGH; ASNANI, 1975).
É preciso ressaltar que a avaliação das características entre o milho selvagem e mutante, deve ser visada no contexto do background genético dos materiais e procedimentos usados no desenvolvimento das variedades mutantes de milho, seja opaco ou floury.
Através da microscopia eletrónica foi observado diferenças nos componentes intracelulares no endosperma do milho selvagem e o2. Normalmente existe um malhado constituído de glutelina é imerso nesta matriz numerosos corpúsculos protéicos, esféricos com aproximadamente 1µm de diâmetro, constituídos de zeína (LENDING; LARKINS, 1992). Em contraste, em o2 são muito pequenos e sempre cobertos pela grande quantidade de glutelina (WALL; PAULIS, 1975).
Mertz et al. (1964), foi o primeiro a determinar que o2 produz uma mudança na proporção de proteínas no endosperma, melhorando a qualidade nutricional da semente. Isto resultou na diminuição nas quantidades de zeína com aumento proporcional da fração não-zeína. Foi constatada que a maior fração foi a glutelina. O aumento nas quantidades de LYS foi atribuído ao aumento da fração glutelina.
Sodek e Wilson (1971) trabalhando com sementes de milho e R802fl2, observaram aumento da fração não-zeína. O gene o2 provocou pouca variação nas quantidades de glutelina, enquanto fl2 causou incremento de glutelina, mas teve pouco efeito nas quantidades de zeína. A composição de aminoácidos das proteínas em o2 e fl2 revelou quantidades maiores de LYS na fração glutelina. Em R802fl2 registrou 5,5% de LYS, entretanto o o2 quantidades similares ao controle (4,7% de LYS).
Misra et al. (1975), analisaram a composição de aminoácidos em Oh43o2, fl2 e duplo mutante o2/fl2. A análise revelou níveis maiores de LYS nos mutantes. No endosperma o2 os níveis de LYS aumentaram 2-vezes. O efeito do gene fl2 mostrou mudanças nos níveis de aminoácidos na mesma direção como os observados em o2, mas o efeito foi menor. O duplo mutante o2/fl2 foi similar a fl2 para os níveis de LYS.
Outras análises, realizadas em W22o7 e o2/o7 por Misra et al. (1975) determinaram que o7 apresentou níveis maiores de LYS do que Oh43o2. O duplo mutante o2/o7 não mostrou efeito aditivo para as quantidades de LYS. Os resultados sugerem que o7 e fl2 não produzem um efeito aditivo sobre os níveis de LYS quando combinados com o2; embora os mutantes apresentassem aumento nas quantidades de albumina, globulina e glutelina com redução da zeína. A análise de aminoácidos das frações revelou níveis maiores de LYS em albumina, globulina e glutelina, mas quantidades baixas na fração zeína. A composição de aminoácidos destas frações protéicas foi similar entre genótipos, sugerindo que as mutações foram responsáveis pelas mudanças nas proporções das diferentes frações.
Di Fonzo et al. (1980), estudando a interação entre os genes mutantes o2 e fl2, e entre o2 e o7 no milho W64A e W22, respectivamente. Os resultados indicaram que três doses do alelo recessivo o2, inibem a ação de fl2 e persiste o fenótipo de o2 para as quantidades de zeína. Quando avaliados o2 e o7 foi observado que estes alelos em condição homozigota reduzem as quantidades de zeína com um leve incremento de albumina, globulina e glutelina. Porém, no duplo mutante o2o7, há redução aditiva da síntese de zeína. Assim, o2 é aparentemente epistático sobre fl2 no controle da síntese de zeína, entretanto junto à o7 pareceriam atuar independentemente.
Habben et al. (1993) observou em W64Ao2, 490ug de LYS comparada com 350ug do W64A. Mediante análise de SDS-PAGE de proteínas do endosperma indicaram que várias proteínas dentro da fração não-zeína foram mais abundantes no mutante do que no genótipo normal.
Yau et al. (1999), trabalhando com o2 de milho T224, MO17 e B73 observaram níveis maiores de LYS, aumento nas quantidades de albumina, globulina, glutelina e redução da zeína. Exceto quando comparados B73 e B73o2, com quantidades similares.
Outra mutação recessiva, denominada o5 foi observada produzindo redução específica da classe zeína 20kDa (MOTTO et al., 1996).
Plotnikov e Bakaldina (1996) observaram que nos grão o2 há redução do conteúdo de zeína mRNA, sendo de 15% para 19kDa e 90% para 22kDa; comparado com o genótipo normal. Paralelamente, houve aumento de 60-70% da atividade RNase no grão o2. Aparentemente, a estabilidade diferencial dos mRNAs representam um fator importante na modulação pós-transcricional da expressão de genes que codificam para a fração zeína durante o desenvolvimento da semente de milho.
Outras proteínas são também afetadas pela mutação o2, por exemplo, a atividade ribonuclease é 2-vezes a 6-vezes maiores no endosperma mutante, alem da falta de uma albumina de 32kDa (b32) que foi observado seguir um padrão de acúmulo coordenado com o acúmulo de zeína no endosperma normal (SOAVE et al., 1981). A mutação o2 também afeta o catabolismo da LYS, causando uma diminuição na degradação de LYS no endosperma (SODEK; WILSON, 1970; BROCHETTO-BRAGA et al., 1992).
DamervaL e Guilloux (1998) analisaram o efeito da mutação o2 na expressão de proteínas durante o desenvolvimento das sementes de milho W64A, F2, F7, W22, B37 e OH43 e observaram proteínas com redução no nível de expressão, como a acetohidroxiacido sintase (AHAS) que catalisa o primeiro passo na biossíntese de aminoácidos derivados da THR e a enzima ortofosfato diquinase localizada no citoplasma (cyPPDK). Com níveis elevados de expressão foram identificadas a aspartatico proteinases, que participa na degradação das proteínas de reserva durante o início da germinação; duas isoformas de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, envolvidas na glicolise no citoplasma; UDP-glucuronosil transferase (UDPGT) que catalisa a degradação de metabólitos tóxicos produzidos durante os processos de amadurecimento das sementes; e sorbitol desidrogenase responsável pela conversão de fructose em sorbitol que em principio pode ser convertida à glicose pela enzima aldosa redutase.
O mutante fl2 parece atuar por um mecanismo diferente de aquele do mutante o2, este gene afeta cada grupo de zeína de modo equivalente e o efeito é altamente dependente da doses gênica (DI FONZO et al., 1980).
Em contraste a estrutura esférica e ordenada do corpúsculo protéico observado no milho normal, no mutante fl2 os corpúsculos são irregulares e os polipeptídios da fração zeína estão desorganizados (LENDING; LARKINS, 1992).
Outras caraterísticas da mutação é a presença de quantidades reduzidas de polissomos unidos a membranas (JONES, 1978) e de zeína mRNA (BURR; BURR, 1982), quando comparados ao endosperma normal.
Uma associação foi observada entre o mutante fl2 e a elevada produção de uma proteína solúvel b70 (BOSTON et al., 1991) que se apresenta em duas isoformas b70I e b70II (MOROCCO et al., 1991). Ambas apresentam níveis de expressão 10-vezes maiores em fl2. A b70 esta associada com os corpúsculos protéicos e a membrana do RER. Embora, a função biológica desta proteína é desconhecida é similar à proteína HSP70 (heat shock protein). Foi também purificada uma proteína b70III, similar em tamanho, mas levemente mais acídica (MOROCCO et al., 1991). As característica das b70 associadas aos corpúsculos protéicos são típicos das chaperonas HSPs e provem evidência para a presença no endosperma de uma proteína chaperona localizada no citoplasma. Os níveis da proteína b70III não foram alterados pelo gene fl2, por tanto o efeito da mutação fl2 de reprimir o acúmulo de zeína poderia ser devido a alterações no transporte dos polipeptídios para o lúmem do RER ou durante o processo de ensamblado dos polipeptídios para a formação dos corpúsculos protéicos, envolvendo a ação da b70I e b70II (MOROCCO et al., 1991). Recentemente, Coleman et al. (1995), informaram que o gene codificando para um membro de 24kDa da família de genes α-zeína 22kDa de milho apresentava na seqüência N-terminal a substituição de ALA por VAL no peptídio sinal, e na sétima estruturas α-hélice a substituição de ALA par THR, alem da inserção de HIS da proteína. Os defeitos estruturais associados a esta α-zeína explicariam muito dos efeitos fenotípicos da mutação fl2.
Li e Larkin (1996) determinaram que a proteína dissulfeto isomerase (PDI) do milho é codificada por um simples gene localizado no braço curto do cromossomo IV. Estas proteínas estão associadas às cisternas e corpúsculos do RE. Durante o desenvolvimento do endosperma, os níveis de PDI mRNA aumentaram entre 10-14DAP. Foi observado que no mutante fl2 houve aumento na expressão de PDI, existindo uma correlação positiva entre os níveis de mRNAs e proteínas com a dosagem de alelos fl2. O aumento de PDI é observado no RE, paralelamente a um aumento das proteínas BiP associadas a PDI,
ambas estão ligadas aos corpúsculos protéicos do RE. As BiPs são membros da família de chaperonas HSP70 e controlariam a oligomerização e conformação espacial das proteínas no lúmem do RE, removendo também aquelas proteínas que não estivarem na conformação espacial adequada. Ainda, a indução da PDI no mutante fl2 reflete o seu papel funcional como chaperona e atuaria em conjunto com as proteínas BiPs durante os diferentes estágios do processamento das proteínas da fração zeína para a construção dos corpúsculos protéicos.
Recentemente foram seqüenciados os 23 membros da família de genes α-zeína 22kDa de milho e observado que 22 destes membros estão ordenados em tandem no cromossomo 4S formando um cluster denso de genes. A cópia 23 desta família de genes esta também localizada neste cromossomo a 20cM de proximidade do centrômero e parece corresponder ao alelo normal da mutação fl2. (SONG et al., 2001).