Metagenômica

A metagenômica é descrita como a análise funcional e de sequencias de genomas coletivos contidos em uma amostra (HANDELSMAN, 2004; WOOD; SALZBERG, 2014). Assim, o conjunto de genomas de uma determinada amostra ambiental é denominada metagenoma. Essa análise utiliza técnicas clássicas de biologia molecular (purificação de DNA, clonagem e transformação) e de microbiologia (caracterização fisiológica) e a combinação desses dois campos frente a vasta diversidade desconhecida, tornam ilimitadas as possibilidades para a prospecção biotecnológica (THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012).

As comunidades microbianas contêm uma complexidade incomparável, o que as torna difíceis para descrever e comparar. Caracterizá-las contribui para o entendimento de processos ecológicos que direcionam interações microrganismo e seus hospedeiros, bem como a biorremediação e a biogeoquímica. Além disso, uma estimativa da riqueza de espécies de um ambiente é um indicativo da plenitude do perfil de uma comunidade. Há dificuldade em estimar a diversidade de uma comunidade microbiana, devido à estrutura desta que

raramente se encaixa a uma distribuição bem definida (NIELSEN et al., 2014; ZHOU et al., 2019).

O solo é considerado um dos mais complexos e desafiantes ambientes para os microbiologistas e contém a maior diversidade microbiana do planeta. A maioria dos micro- organismos presentes no solo ainda não está caracterizada e representam um reservatório enorme de diversidade genética e metabólica ainda não muito explorado (MENEGHINE, 2016). Devido à imensa heterogeneidade física, química e biológica, o solo é considerado o ambiente microbiano mais diverso no mundo (GOMIERO; PIMENTEL; PAOLETTI, 2011; JACOBSEN et al., 2019). Os genomas destas espécies, principalmente as não-cultiváveis, codificam um reservatório inexplorado de novas enzimas e importantes metabólitos (PARIKH; JAMES, 2012).

1.11.1. Estratégia para acessar a diversidade de micro-organismos do solo

O solo é essencial para o desenvolvimento do ser humano e outros organismos no planeta. É a partir dele que ocorre a produção de nutrientes, que por sua vez são extremamente importantes para sobrevivência de qualquer ser vivo. Logo, a qualidade do solo é essencial na agricultura a fim de que haja a produção de alimentos de boa qualidade e para a manutenção das mais variadas espécies.

Porém, o conceito de qualidade do solo é amplo, uma vez que as atividades de manejo executadas pelo homem influenciam diretamente este ambiente (MENEGHINE, 2016; RAMOS et al., 2015; SOUZA; GUIMARÃES; FAVARATO, 2015).

O solo consiste num sistema heterogêneo, descontínuo e estruturado, formado por microhabitats que apresenta diferentes características químicas, físicas e biológicas altamente interdependentes(VALARINI et al., 2011).

Além dos benefícios nutricionais fornecidos ao solo por meio de adubação mineral e orgânica é importante ressaltar a importância dos micro-organismos, que, do ponto de vista agronômico, eles auxiliam na manutenção do equilíbrio, controle de micro-organismos patogênicos (GOMIERO; PIMENTEL; PAOLETTI, 2011; JACOBSEN et al., 2019).

O solo geralmente conta com uma elevada diversidade de arqueias, bactérias e fungos que auxiliam nos processos de ciclagem de nutrientes e os mesmos possuem grande potencial como indicadores da qualidade do solo por estarem intimamente associados aos processos ecológicos (FIGUEIREDO, 2015; MENEGHINE, 2016; VAL-MORAES et al., 2011).

A utilização de medidas de diversidade ou o cálculo de um indicativo de diversidade envolve uma informação refinada contida em dados de análise de comunidade e é representada por um valor numérico que reflete o número e abundância relativa de grupos taxonômicos em uma única comunidade microbiana (BENT; FORNEY, 2008; MCKINLEY, 2019; MENDES et al., 2015).

A microbiologia passou por uma transformação que mudou a visão dos microbiologistas de como estudar certas peculiaridades dos micro-organismos. O fato de que muitos dos micro-organismos não podiam ser cultivados em laboratório, fomentou o estudo de micro-organismos não cultiváveis. A mudança culminou com o desenvolvimento de várias técnicas, incluindo a análise genética de um conjunto de micro-organismos uma vez que o cultivo e isolamento de micro-organismos pelos métodos tradicionais permite o cultivo de somente 0,1 a 1,0% da microbiota do solo (BUERMANS; DEN DUNNEN, 2014; HANDELSMAN, 2004; MEYER et al., 2019).

O DNA total da comunidade microbiana do solo pode ser acessado utilizando-se da metagenômica, que é uma poderosa ferramenta para explorar a ecologia e perfil metabólico do complexo ambiente das comunidades microbianas, bem como identificar novas biomoléculas pelo uso de bibliotecas construídas oriundas de ácidos nucléicos isolados (HEATHER; CHAIN, 2016; MENDES et al., 2015).

É válido lembrar que a construção de bibliotecas metagenômicas inicia-se pelo isolamento de DNA de alta qualidade que seja adequado para clonagem e represente a diversidade microbiana presente na amostra original. Dessa forma, as etapas para a construção de bibliotecas metagenômicas incluem: (i) isolamento de DNA do solo; (ii) ligação do DNA em vetor específico; (iii) clonagem do DNA e inserção do vetor em célula hospedeira e (iv) construção da biblioteca metagenômica (PEIXOTO, 2013).

Sendo assim, a diversidade microbiana em ambientes como o solo, sedimentos ou água pode ser acessada pela análise de genes considerados “relógios moleculares”, como os

RNAs ribossômicos 16S rRNA, 18S rRNA e os espaçadores transcritos internos (ITS), devido a

esses apresentarem regiões conservadas que podem ser utilizadas na comparação e classificação taxonômica dos micro-organismos. Desde a clonagem e sequenciamento, o processo é relativamente rápido e considerado uma poderosa ferramenta para entendimento da dinâmica e diversidade das comunidades microbianas dos mais diversificados ambientes(CHÁVEZ-ROMERO et al., 2016; PASSOS, 2014).

1.11.2. Marcadores moleculares utilizados na identificação de micro-organismos

Em 1987, Woese discorreu sobre a classificação filogenética baseada em características morfológicas para plantas e animais ser relativamente mais fácil visto a riqueza em detalhes morfológicos complexos que esses organismos apresentam em relação às bactérias, que possuem características mais simples. A classificação de organismos com base nos caracteres morfológicos se torna complexa e passível de erros tendo em vista as “armadilhas” que a técnica pode resultar. Como alternativa a essas “armadilhas”, o uso de genes do RNA ribossômico (rRNA) como marcadores moleculares foi considerado mais vantajoso, visto a sua elevada regularidade funcional entre micro-organismos, e por permitir que durante a classificação filogenética ocorra a identificação do táxon mais elevado.

O gene 16S rRNA (ou 16S rDNA) presente em procariotos, pode ser utilizado na identificação de bactérias em análises utilizando sequenciamento de DNA, seja ele proveniente de isolados ou metagenoma (HANDELSMAN, 2004; MEYER et al., 2019; PASSOS, 2014). Este gene possui aproximadamente 1.500 pares de bases (pb) e apresenta 9 regiões conservadas 140 intercaladas com 9 regiões variáveis, onde o comprimento de cada região varia de organismo para organismo. Essa estrutura pode ser sequenciada utilizando métodos de Sanger ou Pirosequenciamento (HEATHER; CHAIN, 2016; PEIXOTO, 2013).