Metaloproteases da Matriz

As metaloproteases da matriz (MMPs) estão implicadas em determinados pontos críticos no processo de metastização como no destacamento, na passagem das células cancerígenas para os vasos sanguíneos ou linfáticos (intravasamento) e ainda no processo inverso, ou seja, a passagem destas células para fora dos vasos sanguíneos ou linfáticos (extravasamento), Fig. i. 10 (Stamenkovic 2000).

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Figura i. 10 - Processo de metastização. Adaptado de (Wirtz et al. 2011).

As MMPs são endoproteases dependentes de zinco com capacidade de degradação dos componentes da matriz extracelular (Nagase et al. 1999). As MMPs têm funções cruciais em vários processos fisiológicos normais, como na degradação fisiológica da matriz extracelular, por exemplo, na formação e remodelação de tecidos, sua reparação e angiogénese e desenvolvimento de órgão (Shapiro 1998; Page-McCaw et al. 2007), na regulação de processos inflamatórios (Parks et al. 2004) e em doenças como o cancro (Egeblad et al. 2002).

Estas estão ligadas ao desenvolvimento das metástases do cancro, a inflamação crónica e a danos nos tecidos, em distúrbios neurológicos (Klein et al. 2011). Estas desordens ocorrem porque as MMPs regulam diferentes processos celulares, nomeadamente, a apoptose, angiogénese, invasão e metastização (Verma et al. 2014). As MMPs regulam a apoptose através da degradação da matriz proteica, que pode resultar numa ação apoptótica ou anti-apoptótica nas células endoteliais e epiteliais (Herren et al. 1998).

Estas proteases da família das metaloproteases (Klein et al. 2011), podem ser divididas em 5 subgrupos, identificados consoante os substratos sobre os quais exercem proteólise (Sbardella et al. 2012):

(i) colagenases (MMP -1, -8 e -13), que degradam colagénio fibrilar (Gioia et al. 2002);

(ii) estromelisinas (MMP-3, -10 e -11), que preferem proteoglicanos e glicoproteínas como substratos (Nagase et al. 1999);

(iii) as gelatinases (MMP-2 e -9), que são particularmente ativas na degradação de substratos da matriz extracelular (ECM) como o colagénio tipo I e colagénio tipo IV (Steffensen et al. 1995; Chambers et al. 1997; Stamenkovic 2000; Chow et al. 2007);

51 (iv) matrilisinas (MMP-7 e MMP-26), que não têm o domínio hemopexina-like e são capazes de processar o colagénio IV, mas não o colagénio I (Marchenko et al. 2001);

(v) MMPs membranares tipo I (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP- 24 e MMP-25). Apenas a MMP-14 e MMP-16 mostraram clivar colagénio fibrilar I (Ohuchi et al. 1997; Sabeh et al. 2009).

4.1.1 Gelatinases: MMP-2 e MMP-9

Dentro da família das MMPs, existem duas metaloproteases específicas, a gelatinase A (MMP-2) e gelatinase B (MMP-9). A maior diferença entre MMP-2 e MMP-9 é a diferente regulação da expressão (Huhtala et al. 1991).

Tipicamente a MMP-2 é expressa apenas constitutivamente com pequenos ajustes na regulação de aumento ou diminuição sob várias condições (Birkedal-Hansen et al. 1993). Pelo contrário, a expressão da MMP-9 é altamente indutível pelos fatores de crescimento, quimiocinas e outros sinais estimuladores (Hipps et al. 1991).

As gelatinases degradam vários tipos de colagénio presente na matriz extracelular, bem como gelatina e elastina (Fanjul-Fernandez et al. 2010). A ativação é conseguida por remoção proteolítica do pro-péptido por enzimas, como a tripsina, plasmina (Vanwart et al. 1990) e outras MMPs ou por stresse oxidativo. A ativação das MMPs pode ser influenciada pelas espécies reativas de oxigénio. A resposta inflamatória no local do tumor gera grandes quantidades de ROS que são produzidos pelos neutrófilos e macrófagos ativados. Estes oxidantes inicialmente ativam MMPs via oxidação do pró-domínio cisteína (Weiss et al. 1985) mas, eventualmente, em combinação com a enzima mieloperoxidase, contributo das células inflamatórias. (Fu et al. 2003).

O aumento da atividade das gelatinases tem sido observado numa variedade de patologias incluindo o cancro, inflamação, doenças infeciosas, doenças neurológicas degenerativas e doenças vasculares (Van den Steen et al. 2002). Estudos mostram que das MMPs, as gelatinases são as mais importantes para a formação de metástases (Bjorklund et al. 2005; Nikkola et al. 2005). Ambas são expressas em várias células incluindo fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, monócitos e osteoclastos (Fanjul-Fernandez et al. 2010) e vários estudos mostram que estão diretamente implicadas na formação de metástases, sendo altamente ativas nos tecidos circundantes ao tumor, degradando a matriz extracelular (Toda et al. 2006; Fanjul- Fernandez et al. 2010; Herszenyi et al. 2012).

Desta forma, ambas as gelatinases têm um papel crucial na invasão e metastização do cancro, pois as células estão ligadas entre si pela matriz extracelular e

52 quando esta é degradada, as células cancerígenas estão livres para iniciar a migração, entrar na corrente sanguínea, proliferar e colonizar outros locais. Vários estudos têm verificado esta relação entre as MMP-2 (gelatinase A) e a MMP-9 (gelatinase B) e a formação de metástases (Bernhard et al. 1994; Hua et al. 1996; Itoh et al. 1998; Parsons et al. 1998) e que com a inibição das gelatinases, em particular da MMP-9, é possível impedir de uma forma eficaz a formação de metástases e a invasão tumoral (Zheng et al. 2006; Yang et al. 2014).

Os inibidores das MMP’s (MMPIs) conseguiram reduzir a progressão do cancro/metástase em ensaios in vitro e em modelos animais, parecendo serem principalmente eficazes nos estados iniciais do cancro ou até na prevenção do desenvolvimento de micrometástases não detetadas após a cirurgia (Herszenyi et al. 2012).

Devido à aparente eficácia da inibição destas enzimas na prevenção de metástases, tem havido um trabalho desenvolvido na criação de inibidores de MMPs sintéticos. No entanto, os resultados não têm sido muito animadores, uma vez que devido à sua similaridade e ubiquidade, torna-se difícil inibir especificamente a MMP-9 ou a MMP-2 sem se observarem graves efeitos secundários, devido à inibição não seletiva das MMPs. Estudos realizados anteriormente com o objetivo de inibir a atividade das enzimas em doentes com cancro produziram resultados muito insatisfatórios com vários efeitos secundários e generalizados, como no sistema músculo-esquelético, devido à toxicidade dos inibidores (Zucker et al. 2004). Por esta razão, a investigação mais recente tem-se direcionado para novos compostos inibidores de MMPs, principalmente derivados de plantas, que apresentam um menor risco de aparecimento de efeitos secundários e de toxicidade e sendo clinicamente ativos contra vários tipos de células cancerígenas (Sarkar et al. 2010; Herszenyi et al. 2012).

A utilização de alimentos com atividade anticancerígena e anti-metastática, abriu portas para uma ação preventiva da formação tumoral, em que os alimentos ou os seus componentes proporcionam benefícios para a prevenção e/ou tratamento tumoral (de Mejia et al. 2010). Algumas estratégias terapêuticas de sucesso contra o crescimento do cancro do cólon têm sido alcançadas usando suplementos alimentares vegetais com ação sobre MMPIs usadas na prevenção ou em recidivas pós cirúrgicas (Markle et al. 2010).

Alguns trabalhos como o de Xu e Chang (Xu et al. 2012), com legumes e nove linhas tumorais humanas, levaram o World Cancer Relief Fund/American Institute for Cancer Research Committee a reconhecer o benefício do consumo de legumes no potencial decréscimo do risco de cancro embora haja necessidade continuar a pesquisa nesta área (Glade 2008).

53 Estudos in vivo e in vitro com dióspiro (Diospyros kaki L.) sugerem um papel relevante deste fruto na proteção contra os radicais livres e na prevenção de algumas doenças humanas (Giordani et al. 2011), o que é justificado pela sua composição química e pela sua riqueza em compostos fenólicos.

Já foi descrito que a β-criptoxantina e a quercetina no extrato de pele de dióspiro têm um efeito preventivo da carcinogénese (Chen et al. 2002; Nishino et al. 2002; Murakami et al. 2008).

Também os resultados de Izuchi e colaboradores (2011) mostraram um decréscimo na expressão de genes relacionados com o processo tumoral, sugerindo que o extrato de pele de dióspiro testado, suprime o stresse oxidativo que pode resultar em carcinogénese, contudo mais estudos são necessários para esclarecer o mecanismo pelo qual ocorre este efeito anticancerígeno (Izuchi et al. 2011).

As proantocianidinas do dióspiro também têm sido associadas à atividade antioxidante, atividade anti-inflamatória e prevenção da aterosclerose (Gorinstein et al. 2000) e existem, ainda, evidências que de que os extratos de dióspiro e seus constituintes possuem uma atividade antitumoral potente em células de cancro humano. Embora os mecanismos moleculares envolvidos permaneçam em grande parte desconhecidos, estudos mostraram que o ácido 24-hidroxiursólico, um triterpenóide encontrado no dióspiro, ativa a proteína cinase AMP-ativada (AMPK), inibe a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) em células HT-29 e induz apoptose celular por ativação de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), caspase-3 e fosforilação de p53 em Ser15. Também induz fortemente a fragmentação do DNA em células HT-29 e, assim, inibe significativamente a formação de colónias de células HT-29 em agar (Khanal et al. 2010). No entanto, não há nenhuma evidência da ação do dióspiro na atividade das metaloproteases da matriz (MMP-9 e MMP-2).

Existem várias linhas de evidência em que o extrato de dióspiro e seus constituintes têm atividade antitumoral potente contra células tumorais humanas. No entanto, os mecanismos moleculares em atividades antitumorais não são ainda compreendidos (Achiwa et al. 1997; Kawase et al. 2003; Direito et al. 2017).

A metodologia para estudar o possível efeito anticarcinogénico dos extratos fenólicos do dióspiro pode assentar em técnicas in vitro usando células de adenocarcinoma de cólon humano, HT-29, que são células epiteliais intestinais humanas, com características aderentes e tumorogénicas, no intuito de avaliar a implicação desses compostos fenólicos na prevenção do desenvolvimento do cancro colorretal, testando o efeito dos extratos na proliferação e invasão de células de carcinoma do cólon humano.

54 É usual avaliar a capacidade anti-proliferativa dos extratos em células HT-29, fazendo ensaio de migração celular e determinando as concentrações mínimas inibitórias (MICs).

É ainda de toda a utilidade estudar a inibição da atividade das enzimas MMP-9 e MMP-2 através da inibição da atividade gelatinolítica em células HT-29, com zimografia de substrato usando SDS-PAGE.