Metiltransferases 16S RNAr

Em 1989, Cundliffe observou que os actinomicetos produtores de aminoglicosídeos abrigavam genes 16S RNAr específicos, para proteger a bactéria do antibiótico produzido (DOI e ARAKAWA, 2007). Acreditava-se que este mecanismo de resistência estava restrito a esses microrganismos produtores, porém em 2002, o primeiro gene responsável por codificar uma metiltransferase foi descrito na Polônia em um isolado de Citrobacter freundii e designado de armA (GOLOBIEWSKI et al., 2007). No ano seguinte, na França (GALIMAND et al., 2003) e no Japão (YOKOYAMA et al., 2003), foram relatados outros casos de isolados de espécies clínicas relevantes (K. pneumoniae e P. aeruginosa) produtoras de metiltransferases 16S RNAr. Foi visto que, estas enzimas adicionavam grupamentos químicos (grupamentos metila) ao ribossomo bacteriano, mostrando-se capazes de conferir um nível elevado de resistência a aminoglicosídeos utilizados clinicamente (DOI e ARAKAWA, 2007; WACHINO e ARAKAWA, 2012).

Os genes 16S RNAr implicados na resistência aos aminoglicosídeos são classificados em dois subgrupos, dependendo da posição do nucleotídeo para ser modificada no sítio A do 16S RNAr (BEAUCLERK e CUNDLIFFE, 1987) (Figura 8). A 16S-RMTase N7-G1405 sofre uma metilação pós-transcricional no nitrogênio na posição 7 do resíduo G1405 o que confere uma resistência exclusivamente a aminoglicosídeos 4,6- DOS, tais como amicacina e gentamicina (DEMYDCHUK et al., 1998). A N1-A1408 16S RNAr sofre uma modificação no nitrogênio na posição 1 do resíduo A1408, o que confere uma elevada resistência aos aminoglicosídeos (4,6-DOS), assim como aos (4,5-DOS), tais como neomicina (OHTA e HASEGANA, 1993ª). Essa metilação impede a ligação do aminoglicosídeo com a subunidade menor do ribossomo. Dessa forma, o fármaco não reconhece seu sítio alvo, não se liga ao ribossomo e não impede a tradução pelo RNA mensageiro, garantindo o alto nível de

resistência conferido por esse mecanismo (DURANTE-MANGONI et al., 2009; WACHINO e ARAKAWA, 2012).

Figura 8. Locais de decodificação na região A do 16S RNAr na subunidade 30S.

Fonte: Wachino e Arakawa, 2012.

Até o presente, foram descritos dez tipos de metiltransferase 16S RNAr: Uma delas, denominada ArmA (aminoglycoside resistance methyltransferase), descrita por Galimand et al. (2005) em K. pneumoniae. Outros oito tipos descritos são variantes de Rmt (ribossomal methyltransferases) como RmtA (YOKOYAMA et al., 2003), RmtB (DOI et al., 2004), RmtC (WACHINO et al., 2006), RmtD (DOI et al., 2007), RmtE (DAVIS et al., 2010), RmtF (GALIMAND et al, 2012), RmtG (BUENO et al., 2013) e RmtH (O’HARA et al., 2013). Outro tipo de metiltransferase 16S rRNA é NpmA (WACHINO et al., 2007).

As enzimas ArmA (GOLEBIEWSKI et al., 2007) e RmtA (YOKOYAMA et al., 2003) revelaram o surgimento das metiltransferases adquiridas exogenamente. Em 2002, na Polônia, um gene que codificava a ArmA, foi depositado como parte da sequência de um plasmídeo de Citrobacter freundii. Em 2003, uma cepa resistente a aminoglicosídeos de Pseudomonas aeruginosa foi isolada no Japão e descrita como produtora de RmtA. Esta nova enzima mostrava uma semelhança em 35% com metiltransferases de vários actinomicetos, sugerindo que esses genes são adquiridos horizontalmente de microrganismos não patogênicos (DOI, 2006). Ainda no Japão, DOI et al., em 2004 identificou a enzima RmtB em Serratia marcescens, muito relacionada a RmtA, compartilhando 82% dos aminoácidos. Desde então, já foi encontrado em diversos países, como China (CAO et al., 2014), Índia (HIDALGO et al., 2013), Arábia Saudita (AL SHEIKH et al., 2014), EUA, México, Brasil (FRITSCHE et al., 2008) e Bélgica (BOGAERTS et al., 2011).

As enzimas ArmA e RmtB são predominantes no mundo, com relatos de ocorrência no Leste da Ásia, Europa, América do Norte e do Sul e Oceania (TIAN et al., 2011; POIREL et

al., 2010; WU et al., 2009; FRITSCHE et al., 2008; KANG et al., 2008; BOGAERTS et al., 2007, YAMANE et al., 2008b, 2007 b). O gene rmtB tem sido descrito como prevalente em membros da família Enterobacteriaceae (POIREL et al., 2014).

Em 2006, WACHINO et al., identificou a RmtC, isoladas de cepas de Proteus mirabilis. Esta enzima também foi detectada em isolados de S. 38ntérica do Reino Unido e dos Estados Unidos, K. pneumoniae do Quênia e da Índia, E.coli do Reino Unido e da Alemanha e Providencia stuartii da Índia (LIVERMORE et al., 2011; POIREL et al., 2011c,d; HOPKINS et al., 2010; FOLSTER et al., 2009).

As enzimas RmtD e RmtD2 foram encontradas distribuídas em países da America do Sul como Argentina e Chile (FRITSCHE et al., 2008; TIJET et al., 2011; YAMANE et al., 2008ª). No Brasil, a enzima RmtD foi encontrada em uma amostra clínica de P. aeruginosa (DOI et al., 2007b). Recentemente, um novo gene codificador de metiltransferase (rmtG) foi detectado em isolados de K. pneumoniae produtores de KPC-2 no estado de São Paulo (BUENO et al., 2013).

Outras metiltransferases foram encontradas esporadicamente como a RmtE e a NpmA detectadas em E. coli dos Estados Unidos e no Japão (WACHINO et al., 2007). As enzimas RmtF e RmtH foram identificadas em isolados clínicos de K. pneumoniae (O’HARA et al., 2013, GALIMAND et al., 2012). O mapa a seguir (Figura 9) mostra à distribuição mundial das enzimas que conferem as bactérias a resistência aos aminoglicosídeos.

Figura 9. Distribuição mundial das metiltransferases 16S RNAr.

Grande parte destes genes está associada com elementos genéticos móveis, como integrons e transposons inseridos em plasmídeos, denotando a sua capacidade de disseminação horizontal intra e inter espécies (DOI e ARAKAWA, 2007; DOI et al., 2007ª; DOI et al., 2007b; YAMANE et al., 2007; WACHINO e ARAKAWA, 2012).

Em diversos estudos têm sido evidenciada a presença de isolados carreando genes de metiltransferases 16S RNAr coexistindo com outros genes de resistência, especialmente blaKPC-2 (BUENO et al., 2013; DOI et al., 2007; GALANI et al., 2012; HABEEB et al., 2014;

HUANG et al., 2012; MEZZATESTA et al., 2013; ZACHARCZUK et al., 2014). Na China, Jiang et al. (2010) demonstraram, em K. pneumoniae, a presença de um plasmídeo carreando simultaneamente os genes blaKPC-2 e armA, mais tarde, Li et al. (2012) e Sheng et al. (2012)

descreveram a co-existência de rmtB e blaKPC-2 em isolados de K. pneumoniae. Achados

semelhantes também foram notificados na Grécia (GALANI et al., 2012). Em outro estudo, conduzido por Hidalgo et al. (2013) na Índia, o gene rmtB foi descrito em isolados que carreavam simultaneamente genes que codificam as enzimas NDM, CTX-M e RmtF, sendo esta descrita pela primeira vez. A co-existência de genes rmtB, blaNDM-1 e blaCTX-M-15 foi descrita em outro estudo conduzido na Bélgica (BOGAERTS et al., 2011). A presença simultânea de genes de metiltransferases 16S RNA e EMAs também foi previamente descrita. Hu et al. (2013), na China, relataram a detecção de aac(3)-Ib e aac(6’)-Ib, aph(3’)-VI e ant(3’’)-I em K. pneumoniae que carreavam simultaneamente os genes armA e rmtB. Ainda na China, Liang et al. (2015) observaram isolados de K. pneumoniae carreando os genes aac(3)-II, aac(6’)-Ib, ant(3”)-I, ant(2”)-I, armA e rmtB, simultaneamente.

2.5 Infecção e Colonização

Todo paciente acometido por enterobactérias produtora de carbapenemase como a KPC podem ser classificados como: paciente colonizado, paciente infectado ou paciente contactante. O paciente colonizado é aquele que porta o microrganismo na pele e/ou superfícies mucosas sem nenhum sinal e/ou sintoma de infecção. Enquanto que o paciente infectado é aquele que desenvolve síndrome infecciosa de qualquer topografia (pneumonia, infecção de trato urinário, infecção de corrente sanguínea, meningite, etc), com verificação do microrganismo em cultura de líquido estéril (sangue, LCR, urina, etc) ou em cultura de secreção não estéreis que preencham critérios qualiquantitavos de infecção (lavado bronco- alveolar, cultura quantitativa de aspirado traqueal) segundo os critérios nacionais/ANVISA.

Nestes casos, o tratamento é feito com antibióticos específicos para o tipo de bactéria identificada. O paciente contactante é aquele que compartilhou o quarto com paciente com suspeita ou confirmação de colonização ou infecção por enterobactérias produtoras de KPC (ANVISA, 2010).

A colonização e/ou infecção de pacientes por mais de uma espécie bacteriana com perfil de resistência aos antimicrobianos, constitui um meio adequado para a transferência de genes codificadores para resistência entre patógenos, favorecendo a multirresistência (SNYDER et al., 2011). A rápida detecção de pacientes colonizados por bactérias resistentes, acrescida da adesão às medidas de controle, com destaque para as precauções de contato, pode reduzir a disseminação destes patógenos e impactar as taxas de infecções, morbi- mortalidade e, consequentemente, nos custos hospitalares (LANDELLE et al., 2013).

3.

OBJETIVOS

3.1. Geral

 Identificar a presença de genes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs) e de metiltransferases 16S RNAr em isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes portadores do gene blaKPC, provenientes de

hospitais de Recife-PE.

3.2. Específicos

 Determinar o perfil de susceptibilidade aos aminoglicosídeos amicacina, gentamicina e tobramicina nos isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC.

 Descrever o perfil das amostras (colonização ou infecção) nas quais foram isoladas K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC e resistente a aminoglicosídeos.

 Investigar a presença dos genes de EMAs: acetiltransferases aac(6’)-Ib; aac(3)-Ia, fosfotransferases aph(3’)- VI e nucletidiltransferases ant(2”)-Ia em isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC.

 Investigar a presença dos genes metiltransferases 16S RNAr: armA, rmtB, rmtD em isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC.

 Comparar a presença dos genes encontrados com o perfil fenotípico de resistência aos aminoglicosídeos dos isolados bacterianos estudados.

 Comparar os isolados de Klebsiella pneumoniae e de Enterobacter aerogenes com relação ao perfil fenotípico e genotípico encontrado.

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4. MATERIAIS e MÉTODOS

4.1. Isolados Bacterianos

Para esse estudo foram selecionados 28 isolados de K. pneumoniae e 30 isolados de E. aerogenes portadores do gene blaKPC e resistentes a um ou mais aminoglicosídeos (amicacina,

gentamicina e tobramicina), provenientes de pacientes de 4 hospitais terciários de Recife-PE, coletados em 2008, 2011 e 2012. Esses isolados fazem parte do estoque de culturas bacterianas do Laboratório de Bacteriologia e Biologia Molecular do Departamento de Medicina Tropical, UFPE. Os isolados foram identificados por sistema automatizado (Bactec 9120/ Phoenix-BD) e reidentificados bioquimicamente utilizando testes convencionais para confirmar a pureza da cultura. Em estudos anteriores esses isolados foram tipados quanto a relação clonal pela ERIC-PCR e a presença do gene blaKPC foi determinada por PCR e

sequenciamento de DNA (MELO et al., 2014; LOPES et al., 2014). As amostras de K. pneumoniae e E. aerogenes estão mantidas em estoque com glicerol 15% a -20°C, e para as análises foram cultivadas em Caldo Brain Heart Infusion (BHI) ou caldo Luria Bertani (LB) por 18 horas a 37°C e semeados em Ágar nutriente (AN). A tabela 1 resume as características dos 58 isolados selecionados.