CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Elza Ferreira Firmo
PESQUISA DE GENES DE RESISTÊNCIA A AMINOGLICOSÍDEOS
EM ISOLADOS DE COLONIZAÇÃO E INFECÇÃO DE Klebsiella
pneumoniae e Enterobacter aerogenes PORTADORES DO GENE bla
KPCPROVENIENTES DE HOSPITAIS DE RECIFE-PE
RECIFE 2016
ELZA FERREIRA FIRMO
PESQUISA DE GENES DE RESISTÊNCIA A AMINOGLICOSÍDEOS EM
ISOLADOS DE COLONIZAÇÃO E INFECÇÃO DE Klebsiella pneumoniae e
Enterobacter aerogenes PORTADORES DO GENE blaKPC PROVENIENTES
DE HOSPITAIS DE RECIFE-PE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de mestre em Medicina Tropical.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Catarina de Souza Lopes
RECIFE 2016
ATA DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, NO DIA 24 DE FEVEREIRO DE 2016.
Aos 24 (vinte e quatro) dias do mês de fevereiro de dois mil e dezesseis, às 9 horas, na Sala do PPGMEDTROP – Térreo do Hospital das Clínicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco (CCS/UFPE), em sessão pública, teve início a defesa da Dissertação intitulada “PESQUISA DE GENES DE RESISTÊNCIA A AMINOGLICOSÍDEOS EM ISOLADOS DE COLONIZAÇÃO E INFECÇÃO DE Klebsiella pneumoniae e Enterobacter
aerogenes PORTADORES DO GENE blaKPC PROVENIENTES DE HOSPITAIS DE RECIFE-PE”da aluna Elza Ferreira
Firmo, na área de concentração Medicina Tropical, sob a orientação da Profa. Dra. Ana Catarina de Souza Lopes. A mestranda cumpriu todos os demais requisitos regimentais para a obtenção do grau de MESTRA em Medicina Tropical. A
Banca Examinadora foi indicada pelo Colegiado do Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, na sua Reunião ordinária e homologada pela Diretoria de Pós-Graduação, através do Processo Nº 23076.003509/2016-00 em 27/01/2016, composta pelos Membros Doutores: Maria Amélia Vieira Maciel (Presidente da Banca), do Departamento de Medicina Tropical da UFPE; Nilma Cintra Leal, do Departamento de Microbiologia do CPqAM/FIOCRUZ; e Eulália Camelo Pessoa de Azevedo Ximenes, do Departamento de Antibióticos da UFPE. Após cumpridas as formalidades, a candidata foi convidada a discorrer sobre o conteúdo da Dissertação. Concluída a explanação, a candidata foi arguida pela Banca Examinadora que, em seguida, reuniu-se para deliberar e conceder à mesma a menção (Aprovada/Reprovada/Em exigência) Aprovada da referida Dissertação. E, para constar, lavrei a presente Ata que vai por mim assinada, Secretário de Pós-Graduação, e pelos membros da Banca Examinadora.
Recife, 24/02/2016. ________________________________
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Amélia Vieira Maciel
Profa. Dra. Nilma Cintra Leal
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Profº Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Nicodemos Teles Pontes Filho
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL Profª. Valdênia Maria Oliveira de Souza
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL Profª. Vera Magalhães da Silveira
CORPO DOCENTE Profª.Ana Catarina de Souza Lopes Profª.Ana Lúcia Coutinho Domingues Profª. Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Prof. Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto Prof. Fábio André Brayner dos Santos Profª. Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Profª. Maria Amélia Vieira Maciel Profª. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Profª.Marli Tenório Cordeiro Prof. Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Profª.Valdênia Maria Oliveira de Souza Profª. Vera Magalhães da Silveira Profª. Vlaudia Maria de Assis Costa
Dedico, A DEUS. A minha mãe Elza (in memorian), pela vida. Aos meus pais Dade e João e aos irmãos Erika, Humberto e Malaquias,
pelo apoio, incentivo, eterno cuidado, dedicação e amor.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pela minha vida, por me fortalecer nos momentos de fraqueza, por me capacitar nos momentos de necessidade, pelas bênçãos e proteção.
A minha família pelo amor e incentivo.
A minha orientadora Profª. Drª Ana Catarina de Souza Lopes pela paciência, dedicação e ensinamentos tão importantes que seguirão comigo por toda minha vida. Agradeço pela oportunidade, incentivo e confiança no meu trabalho que tanto me estimularam. A você minha eterna gratidão, amizade, respeito e admiração.
As amigas Adriane, Cynthia e Manu pela amizade sincera, apoio e incentivo. Meu eterno agradecimento e amizade.
Aos professores e a todos que fazem o departamento de Microbiologia, pelos ensinamentos e amizade, em especial aos companheiros de pesquisa e a Jussara, pelo apoio.
Aos professores e a todos que fazem o Departamento de Medicina Tropical, pelos ensinamentos e pela contribuição na minha formação; em especial a Walter Leite, por toda prestatividade.
A PROPESQ-UFPE e CAPES, pelo suporte financeiro e a todos que contribuíram para realização deste trabalho.
RESUMO
Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes têm se destacado como importantes agentes de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), causando principalmente infecções de feridas, dos tratos urinário e respiratório, além de sepse. Essas infecções são causadas por linhagens bacterianas geralmente multirresistentes. Genes que codificam as enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs) e metiltransferases 16S RNAr podem estar presentes em isolados de enterobactérias também produtores de Klebsiella pneumoniae carbapapenemase (KPC). Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar genes que codificam resistência aos aminoglicosídeos em 30 isolados de E. aerogenes e em 28 isolados de K. pneumoniae portadores do gene blaKPC resistentes a amicacina, tobramicina e/ou gentamicina,
oriundos de colonização e infecção em pacientes de diferentes hospitais em Recife-PE, Brasil. A investigação dos genes armA, rmtB, rmtD, aac(3)Ia, aac(3)IIa, aac(6´)Ib, ant(2´)Ia e aph(3’)-VI foi realizada através de PCR, seguida de sequenciamento de DNA. Nos isolados de K. pneumoniae observou-se uma maior ocorrência dos genes ant(2´)Ia, seguidos de aac(3)IIa, aph(3’)-VI e aac(6´)Ib. O gene mais encontrado em E. aerogenes foi o aph(3’)-VI, seguidos de aac(3)-IIa e ant(2”)-Ia. Esse é o primeiro relato de aph(3’)-VI em E. aerogenes no Brasil. Os genes aac(3)-Ia, armA, rmtB e rmtD não foram encontrados. Esses achados ressaltam para a gravidade da alta ocorrência de isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores de genes para EMAs e gene blaKPC principalmente colonizando pacientes, visto
que essas bactérias podem atuar na disseminação de mecanismos de resistência dentro da unidade hospitalar e limitar as opções de tratamento.
ABSTRACT
Klebsiella pneumoniae and Enterobacter aerogenes have been highlighted as important agents of healthcare-associated infections (HAIs), primarily causing wound, urinary and respiratory tracts infections, and sepsis. These infections are often caused by multiresistant bacterial strains. Genes encoding aminoglycoside modifying enzymes (AMEs) and 16S RNAr methyltransferases can also be present in Enterobacteriaceae isolates producing Klebsiella pneumoniae carbapapenemase (KPC). Therefore, the aim of this study was to investigate genes encoding resistance to aminoglycosides in 30 isolates of E. aerogenes and 28 K. pneumoniae isolates carrying the blaKPC gene and resistant to amikacin, tobramycin and / or
gentamicin, from colonization and infection in patients from different hospitals in Recife-PE, Brazil. The investigation of the genes armA, rmtB, rmtD, aac(3)Ia, aac(3)IIa, aac(6´)Ib, ant(2´)Ia e aph(3’)-VI was performed by PCR followed DNA sequencing. In K. pneumoniae isolates there was a higher incidence of genes ant(2´)Ia, followed by aac(3)IIa, aph(3’)-VI e aac(6´)Ib. The gene most frequently found in E. aerogenes was aph(3’)-VI, followed by aac(3)-IIa e ant(2”)-Ia .This is the first report of aph (3 ') - VI in E. aerogenes in Brazil. The genes aac(3)-Ia, armA, rmtB e rmtD were not found. These findings points to the seriousness of the high incidence of isolates of K. pneumoniae and E. aerogenes carriers of AMEs and blaKPC gene, mainly colonizing patients, since these bacteria can act in the dissemination of
resistance mechanisms within the hospital and to limit treatment options.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Colônias grandes, rosadas, mucóides, brilhantes, em ágar MacConkey, típicas de
espécies de Klebsiella. ... 21
Figura 2. Colônias de E.aerogenes em ágar nutriente. ... 24
Figura 3. Efeitos dos aminoglicosídeos sobre a síntese de proteínas. ... 31
Figura 4. Representação dos diversos tipos de mecanismos de resistência bacteriana. ... 32
Figura 5. Modificação na molécula de canamicina A promovida pela enzima bacteriana AAC(6’). ... 34
Figura 6. Modificação na molécula de canamicina A promovida pela enzima bacteriana APH (3’). ... 35
Figura 7. Modificação na estrutura de canamicina A promovida pela enzima bacteriana ANT(4’). ... 35
Figura 8. Locais de decodificação na região A do 16S RNAr na subunidade 30S. ... 37
Figura 9. Distribuição mundial das enzimas 16S RMTases. ... 38
Figura 1. Porcentagem de genes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos dos tipos aac(6’)-Ib, aac(3)-IIa, aph(3’)-VI e ant(2”)-Ia...54
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose mostrando os produtos de amplificação por pcr dos genes de emas no isolado de k. Pneumoniae (K3-A2)...55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características dos isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes selecionados para estudo. Continua... ... 48 Tabela 2. Padrões de Interpretação de valores de halo e CIM para Enterobacteriaceae segundo CLSI (2014). ... 49 Tabela 3. Primers utilizados na PCR e sequenciamento de DNA para detecção dos genes codificadores de metiltransferases 16S RNAr e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs). ... 50 Tabela 1. Primers utilizados na PCR e sequenciamento de DNA para detecção dos genes
codificadores de metiltransferases 16S RNAr e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs)...59 Tabela 2. Origem, relação clonal e perfil fenotípico e genotípico da resistência aos
aminoglicosídeos encontrados nos isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC-2...60
Tabela 3. Frequência de genótipos de EMAs e fenótipos de resistência esperado (de acordo com a literatura) e observado em isolados de E. aerogenes...61 Tabela 4. Frequência de genótipos de EMAs e fenótipos de resistência esperado (de acordo com a literatura) e observado em isolados de K. pneumoniae...62
LISTA DE ABREVIATURAS % - Porcentagem µM – Micromolar °C – Graus Celsius μg – Micrograma μL – Microlitro AACs – acetiltransferases AcCoA - acetil-coenzima A ADP – Adenosina Difosfato AMC – Amoxicilina-clavulanato AMI – Amicacina AMO – Amoxicilina AMP – Ampicilina APS –ampicilina/sulbactama ATM– Aztreonam ANTs – Nucletidiltransferases APHs – Fosfotransferases
Arm – “Aminoglycoside resistance methyltransferase” ATCC - “American Type Culture Collection”
ATP – Adenosina Trifosfato CAZ – Ceftazidima
CDC – “Centers for Disease Control and Prevention” CFO – Cefoxitina
CFX – Cefalexina CFZ – Cefazolina
CIM - Concentração Inibitória Mínima CIP - Ciprofloxacino
CLSI - “Clinical and Laboratory Standards Institute” CN – Controle negativo
CoA - coenzima A CP – Controle positivo
CPM – Cefepime CRX – Cefuroxima CTX – Cefotaxima
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dNTP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
EDTA - Ácido etileno-diamino tetracético
EMA- Enzima Modificadora de Aminoglicosídeos
ERIC-PCR - “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR” ESBL - “Extended-spectrum β-lactamase”
ERT - Ertapenem
EUA - Estados Unidos da América
EUCAST - “European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing” GDP - Guanosina Difosfato
GEN - Gentamicina
GTP - Guanosina Trifosfato
IMI – “Imipenem-hydrolyzing β-lactamase” IMP – Imipenem
IRAS - Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde KPC - “Klebsiella pneumoniae carbapenemase” LB- Luria-Bertani
LPS - Lipopolissacarídeo MBLs - Metalo- β-lactamases MDR – Multi Droga Resistente MPM – Meropenem
mg – Miligrama Mg+2 - Magnésio
MgCl2 – Cloreto de Magnésio
mL – Mililitro
NAL – Ácido nalidíxico NaCl – Cloreto de Sódio ng – Nanograma
NpmA – “rRNA adenine N-1-methyltransferase” NOR – Norfloxacino
pb - Pares de bases
PCR - “Polymerase chain reaction” pH - Potencial hidrogeniônico pmol – Picomol
POLB – Polimixina B
PIT - Piperacilina /Tazobactama q.s.p. – quantidade suficiente para Rmt – Ribossomal methyltransferase RNAr - Ácido ribonucleico ribossomal
SENTRY - “Antimicrobial Surveillance Program” Taq – Taq polimerase
TBE - Tris, EDTA, Ácido bórico TE - Tris EDTA
TNs – Transposon TOB - Tobramicina
Tris - Hidroximetilaminometano
TSA - Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos TSB - “Tryptic Soy Broth”
U - Unidade
UTI - Unidade Terapia Intensiva V – Volt
1. INTRODUÇÃO ... 18
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 21
2.1. Klebsiella pneumoniae ... 21
2.2. Enterobacter aerogenes ... 23
2.3. Carbapenemases do tipo KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) ... 25
2.4 Aminoglicosídeos ... 28
2.4.1. Definição e Características ... 28
2.4.2. Mecanismo de ação dos aminoglicosídeos... 29
2.4.3. Resistência aos Aminoglicosídeos ... 31
2.4.3.1. Enzimas Modificadoras de Aminoglicosídeos ... 32
2.4.3.2. Metiltransferases 16S RNAr ... 36 2.5 Infecção e Colonização ... 39 3. OBJETIVOS... 42 3.1. Geral ... 42 3.2. Específicos ... 42 4. MATERIAIS e MÉTODOS ... 44 4.1. Isolados Bacterianos ... 44
4.2. Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos ... 44
4.3. Extração de DNA total ... 45
4.4. Condições da PCR para identificação dos genes ant(2”)-I, aac(6’)-Ib, I, aac(3)-IIa e aph(3’)-VI que codificam EMAs. ... 45
4.5. Condições da PCR para identificação dos genes armA, rmtB e rmtD que codificam metilases. ... 46
4.6. Eletroforese em gel de agarose ... 46
4.7. Sequenciamento dos genes de resistência ... 46
4.8. Considerações Éticas ... 47
5. RESULT\ADOS ... 52
Artigo: Presença dos genes de resistência a aminoglicosídeos ant(2”)-Ia, aph(3’)-VI, aac(3)IIa, aac(6´)-Ib em isolados de colonização e infecção de Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes portadores do gene blaKPC. ... 52
REFERÊNCIAS ... 69 APÊNDICE A ... 85
Presence of aminoglycoside-modifying enzyme genes ant(2”)-Ia, aph(3’)-VI, aac(3)IIa, aac(6´)-Ib in KPC-possessing Klebsiella pneumoniae and Enterobacter aerogenes isolates from colonization and infection ... 85
1. INTRODUÇÃO
As espécies Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes são bacilos gram-negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae comumente encontrados na água, esgoto, solo, plantas e também como saprófitos das mucosas da nasofaringe e trato gastrointestinal de seres humanos e animais (KONEMAN et al, 2008; TRABULSI e ALTERTHUM, 2008). Nos últimos anos, ambas as espécies têm se destacado como importantes agentes de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), que acomete principalmente indivíduos imunossuprimidos ou com infecções, tais como infecções de feridas, intra-abdominais, dos tratos urinário e respiratório, e septicemia (KONEMAN et al, 2008). Na América Latina a espécie K. pneumoniae corresponde a 10,2% de todos os patógenos isolados em infecções pulmonares, seguido de Enterobacter spp. (5,1%) e outras enterobactérias. No Brasil, 12,4% de infecções de corrente sanguínea são causadas por K. pneumoniae, enquanto que 4,9% dos microrganismos isolados correspondem a Enterobacter spp. (ANVISA, 2014).
Em pacientes colonizados ou com infecção, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes podem atuar como um reservatório para a transmissão de genes de resistência. Além disso, a transmissão cruzada entre pacientes é intermediada por mãos de profissionais de saúde e fômites, e favorecida pela capacidade de sobrevivência destas bactérias no ambiente. Tornando-se assim, uma importante causa de surtos tanto por um único como por múltiplos clones dessas espécies. Vários estudos têm mostrado que a colonização intestinal por bacilos gram-negativos multirresistentes, muitas vezes precede o início da infecção (ALVES e BEHAR, 2013; BORGES et al., 2015; RODRIGUES et al., 2015).
As infecções nosocomiais por K. pneumoniae e E. aerogenes geralmente são causadas por linhagens multirresistentes, principalmente produtoras de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), enzimas que além de hidrolisar os carbapenêmicos, inativam também penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos. (NORDMAN e POIREL, 2002; QUEENAN e BUSH, 2007). Além disso, cepas produtoras de KPC frequentemente apresentam resistência a outros antimicrobianos, como os aminoglicosídeos, o que pode ser justificado pela presença do gene blaKPC associado a genes codificadores de metilases e de enzimas modificadoras de
aminoglicosídeos (EMAs) em um mesmo plasmídeo (BUENO et al., 2013; BREMMER et al., 2014). Este cenário dificulta o tratamento e resulta em altos índices de morbidade e mortalidade (SPANU, 2012; GARBATI e AL GODHAIR, 2013; TSAI et al., 2014).
A resistência aos aminoglicosídeos também vem ganhando destaque mundialmente, visto que, esses antimicrobianos são muitas vezes utilizados em associação com carbapenêmicos contra microrganismos produtores de KPC. O principal mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos comumente encontrado em enterobactérias é a inativação enzimática, que é mediada por três classes de enzimas, as acetiltransferases (AACs), as nucleotidiltransferases (ANTs) e as fosfotransferases (APHs) (DOI e ARAKAWA, 2007). Outro mecanismo descrito inclui a modificação do sítio alvo por mutação do gene 16S RNAr (GALIMAND et al., 2005), resultando numa baixa afinidade do fármaco ao ribossomo bacteriano e a metilação do RNAr 16S, um mecanismo encontrado na maioria dos organismos produtores de aminoglicosídeos e em isolados clínicos (GALIMAND et al., 2005; DOI e ARAKAWA, 2007; RAMIREZ e TOLMASKY, 2010; WACHINO e ARAKAWA, 2012).
No presente estudo, K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC, isolados
de pacientes provenientes de hospitais do Recife-PE, foram investigados para determinação do perfil de resistência aos principais aminoglicosídeos utilizados como opções terapêutica e para identificação de mecanismos de resistência a esses antimicrobianos, através da pesquisa dos genes aac(6’)-Ib, aac(3)-Ia, aac(3)-Iia, aph(3’)- VI, ant (2”)-Ia, armA, rmtB e rmtD. As informações geradas por este estudo serão úteis para o conhecimento dos tipos de genes de resistência aos aminoglicosídeos presentes em K. pneumoniae e E. aerogenes produtoras de KPC, podendo orientar a antibioticoterapia empírica e os protocolos de prevenção, que resultam na melhoria do prognóstico dos pacientes.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.
REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae é um bacilo gram-negativo, que mede cerca de 2 µm por 0,5 µm. É anaeróbio facultativo, não esporulado e imóvel, pertencente à família Enterobacteriaceae. As características bioquímicas comuns à espécie são reação de oxidase, indol e ornitina negativas, lisina positiva, fermentação da lactose, utilização do citrato como fonte de carbono e hidrólise da uréia (KONEMAN et al., 2008).
Em meios de isolamento, como ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) e ágar MacConkey (Figura 1), K. pneumoniae exibem colônias grandes, brilhantes, quase sempre de aspecto mucóide devido à presença de cápsula, constituída por polissacarídeos, e coloração rosada (TRABULSI e ALTERTHUM, 2008). A superfície celular normalmente expressa dois tipos de antígenos, o antígeno O (lipopolissacarídeo) e o antígeno K (polissacarídeo capsular), que contribuem para a sua patogenicidade. Existem cerca de 77 antígenos K e 8 antígenos O, cuja variabilidade estrutural, constitui a base para a classificação em diferentes sorotipos (UMEH e BERKOWITZ, 2009).
Figura 1. Colônias de Klebsiella em ágar MacConkey.
Fonte: https://sobomicroscopio.wordpress.com/2013/03/25/culturas-de-vigilancia-parte-ii/; acesso 21/01/2015.
O gênero Klebsiella foi descrito pela primeira vez pelo microbiologista alemão Edwin Klebs no final do século XIX (UMEH e BERKOWITZ, 2009). Inicialmente, a classificação
das espécies de Klebsiella baseava-se em sua origem ou em características de patogenicidade. Posteriormente, as espécies foram classificadas de acordo com características bioquímicas, baseadas na utilização de determinados substratos e atividades das enzimas. Porém, com o advento das técnicas moleculares, tornou-se possível a identificação de novas espécies e reclassificação das pré-existentes. Assim, houve alteração da taxonomia do gênero, definido pelas técnicas de sequenciamento e hibrização de DNA, permitindo a identificação de seis espécies: K. oxytoca; K. planticola; K. terrigena, K. mobilis; Klebsiella ornithinolytica e K. pneumoniae (KRIEG et al., 1984; KONEMAN et al., 2001; MARTÍNEZ et al., 2004; UMEH e BERKOWITZ, 2009).
K. terrigena e K. planticola eram consideradas restritas a ambientes aquáticos e de solo, porém estas espécies tem sido isolados de infecções respiratórias humanas (PODSCHUM e ULLMANN, 1998). K. ozaenae foi isolada do nariz em casos de ozena (atrofia fétida das mucosas) e K. rhinoscleromatis foi isolada de lesões granulomatosas destrutivas do rinoscleroma (TRABULSI et al., 2008).
A maior parte dos isolados de Klebsiella spp. estão relacionados com infecções nosocomiais, principalmente decorrentes da colonização de pacientes hospitalizados, podendo ser isolada de nasofaringe, mãos e fezes com uma frequência de 20%, 42% e 77% respectivamente (PODSCHUN e ULLMAN, 1998). Tanto K. pneumoniae, quanto K. oxytoca são as principais espécies do gênero responsáveis por essas infecções hospitalares, sendo a K. pneumoniae a espécie clinicamente mais importante, devido à associação com altas taxas de mortalidade (HARYANI et al., 2007).
A espécie K. pneumoniae é conhecida primariamente como patógeno que causa graves pneumonias e bacteremias adquiridas na comunidade, principalmente em etilistas, com desfechos fatais quando não tratados. Como microrganismo oportunista ataca indivíduos imunocomprometidos, hospitalizados e que apresentam sérias doenças de base, como diabetes (KONEMAN et al., 2008). Pode colonizar a pele, faringe, bexiga e trato gastrointestinal, podendo causar pneumonia associada à ventilação mecânica (PAWAR et al., 2003), bacteremia, septicemia, infecções do trato urinário, infecções de pele e tecidos moles (SOUZA LOPES et al., 2005; GALES et al., 2012), doença pulmonar crônica e diarreia (VELASCO et al., 2009; ZHAO et al., 2010).
Muitos surtos causados pela K. pneumoniae têm sido descritos na literatura, acometendo principalmente pacientes internados não só em áreas de alto risco (como as unidades de terapia intensiva), mas também em áreas de menor risco como as cirúrgicas, clínicas e até mesmo em asilos (PATERSON e BONOMO, 2005; VELASCO et al., 2009).
Em ambientes clínicos, o trato gastrointestinal dos pacientes e as mãos dos profissionais de saúde são os mais importantes reservatórios para a transmissão (SCHJORRING et al., 2008).
Nos Estados Unidos e no Canadá, K. pneumoniae está entre os principais patógenos que causam bacteremias. Na América Latina foi o terceiro patógeno mais prevalente isolado do trato respiratório de pacientes hospitalizados com pneumonia (MARRA et al., 2011). Em infecções de pele e tecidos moles foi a quarta (10,4%) espécie mais isolada, enquanto que em infecções da corrente sanguínea a K. pneumoniae foi encontrada em 12,3% dos casos (GALES et.al., 2012; ANVISA, 2014)
O alto envolvimento desta espécie em infecções graves está relacionado principalmente à facilidade na aquisição de plasmídeos de multirresistência, os quais podem possibilitar resistência a diferentes classes de antimicrobianos, incluindo carbapenêmicos, quinolonas e aminoglicosídeos (TRABULSI et al., 2008).
2.2. Enterobacter aerogenes
Enterobacter spp. são bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, pertencentes à família Enterobacteriaceae, geralmente encontradas na pele humana e plantas, bem como no solo, água, esgoto, trato intestinal, urinário e respiratório de humanos e animais e alguns produtos lácteos (KONEMAN et al., 2008). Entre as nove espécies (E. aerogenes, E. cloacae, E. agglomerans, E. sakazakii, E. taylorae, E. gergoviae, E. asburiae, E. amnigenus e E. intermedium) reconhecidas como membros do gênero Enterobacter, E. aerogenes e E. cloacae assumiram significado clínico como bactérias oportunistas e emergiram como patógenos hospitalares de pacientes de terapia intensiva, especialmente para aqueles que estão em ventilação mecânica (MEZZATESTA et al., 2012).
A espécie E. aerogenes foi originalmente chamado Aerobacter aerogenes, mais tarde foi incluída no gênero Enterobacter. Em 1971, foi proposto que esta espécie fosse renomeada para Klebsiella mobilis devido à sua mobilidade conferida por flagelos perítriquios e seu parentesco genético com o gênero Klebsiella, recentemente uma nova reclassificação foi proposta sob o nome de K. aeromobilis (DIENE et al., 2013). O gênero Enterobacter pode ser facilmente distinguido do gênero Klebsiella, pois, suas espécies são móveis, positivas para a presença de ornitina descarboxilase e urease negativa em E. aerogenes (FARMER et al., 1985). Macroscopicamente apresentam-se como colônias grandes e esbranquiçadas quando cultivadas em ágar nutriente (AN) (Figura 2). Em meios seletivos, como EMB ou
MacConkey, formam colônias grandes, mucóides, de coloração rosa a avermelhadas (KONEMAN et al., 2008).
Figura 2. Colônias de E.aerogenes em ágar nutriente.
Fonte: A autora.
E. aerogenes está associada a várias infecções oportunistas, particularmente entre pacientes hospitalizados, afetando o trato urinário, o trato respiratório inferior, a pele, tecidos moles e feridas. Ocasionalmente, causam septicemia e meningite (LEE et al., 2010; PEREZ et al., 2012). Em pessoas saudáveis, a maioria das espécies se encontra como comensais no trato digestório, mas em pacientes imunossuprimidos podem colonizar outras mucosas, de modo que seu isolamento em cultivo artificial não permite diferenciar uma colonização de uma infecção. Crianças, idosos e pacientes com doenças de base ou imunossupressão estão sujeitos a tais infecções (JANDA e ABBOTT, 2006).
Nos últimos anos, surtos hospitalares com estirpes multirresistentes de Enterobacter spp. estão se tornando cada vez mais frequentes (PEREZ et al., 2012) com destaque para E. aerogenes. A prevalência desta espécie bacteriana aumentou consideravelmente desde a introdução das cefalosporinas de espectro estendido na prática clínica (BIENDO et. al., 2008). A consequência desta antibioticoterapia é o surgimento de isolados resistentes aos antibióticos de última linha, como os carbapenêmicos e também a colistina, para o qual não há nenhuma opção terapêutica disponível (CHEVALIER et al., 1999; THIOLAS et al., 2005; DIENE et al., 2013).
A origem da infecção por Enterobacter está relacionada à translocação bacteriana do trato intestinal, o habitat deste patógeno (TUON et al., 2010). Enterobacter spp. Estão entre
as causas mais comuns de infecções por bactérias gram-negativas, causando 8% dos casos de bacteremia nosocomial e são a segunda causa mais comum de gram-negativos que causam pneumonia em pacientes internados em unidades de terapia intensiva. Além disso, nos últimos anos, são uma causa crescente de infecções adquiridas na comunidade (MARCHAIM et al., 2008). Nos EUA, uma pesquisa realizada entre 2009 e 2010 pela “National Healthcare Safety Network” (NHSN), do “Centers for Disease Control and Prevention” (CDC), revelou que cinco gêneros de Enterobacteriaceae estavam entre os 10 microrganismos mais frequentemente isolados de infecções hospitalares. Dentre eles a Klebsiella spp. foi o sexto mais isolado (8%) e o Enterobacter spp. encontrava-se em oitavo lugar (4,7%) (SIEVERT et. al., 2013).
Na América Latina, um estudo associado ao sistema de vigilância SENTRY (“SENTRY Antimicrobial Surveillance Program”) avaliou a prevalência de bactérias causadoras de infecções em hospitais da Argentina, Brasil, Chile e México. Dados revelaram que a espécie K. pneumoniae foi o quarto microrganismo mais isolado (10,2%) em infecções pulmonares, seguido de Enterobacter spp. (5,1%) e outras enterobactérias. Em 2012, dados obtidos da Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde (Rede RM) revelaram que dos pacientes internados, com infecções primárias da corrente sanguínea, em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) de 908 hospitais no Brasil, 12,4% eram causadas por K. pneumoniae, enquanto que 4,9% dos microrganismos isolados correspondiam a Enterobacter spp. (ANVISA, 2014).
Estudos realizados por Tuon et al. 2010, em um Hospital universitário de Curitiba, revelaram que a espécie mais comumente isolada dentre 58 pacientes com bacteremia por Enterobacter spp. foi de E. aerogenes (71%), seguida de E. gergoviae (17%) e E. cloacae (12%). Ainda de acordo com este autor, Enterobacter é um microrganismo associadon com resistência a cefalosporinas de 3a geração devido ao gene cromossômico AmpC. No entanto, tem-se observado uma diminuição progressiva da susceptibilidade à cefalosporinas de 4a geração, sugerindo o aumento de isolados produtores de ESBL além da eminente resistência aos carbapenêmicos, devido à produção de diversas carbapenemases.
2.3. Carbapenemases do tipo KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase)
As carbapenemases do tipo KPC são serino-carbapenemases da classe A de Ambler e grupo funcional 2f, codificadas por variantes do gene blaKPC-2, contido em uma região de 879
pb. São proteínas de 293 aminoácidos, capazes de hidrolizar os carbapenêmicos, penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos e são inibidas por inibidores das β-lactamases tais como o ácido clavulânico, sulbactama e tazobactama (YIGIT et al., 2001; QUEENAN e BUSH, 2007; PAPP-WALLACE et al., 2010; SHANMUGAM et al., 2013; DU et al., 2014).
Foram descritas pela primeira vez, através de um projeto de vigilância (ICARE- “Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology”), em uma amostra de K. pneumoniae proveniente da Carolina do Norte em 1996. Essa amostra era resistente a todos os beta-lactâmicos testados, mas na presença de ácido clavulânico observou-se uma redução da concentração inibitória mínima (CIM) dos carbapenemicos (imipenem e meropenem) avaliados. A enzima foi chamada KPC-1 (YIGIT et al., 2001).
Dois anos depois, Yigit e colaboradores reportaram, a partir do mesmo projeto de vigilância (ICARE), uma amostra de K. oxytoca KPC- positiva, mas foi constatado que havia a diferença de um aminoácido com relação à KPC-1. Assim, esta enzima foi chamada KPC-2 (YIGIT et al., 2003). Porém, uma correção da sequência nucleotídica de KPC-1 indicou que os genes blaKPC-1 e blaKPC-2 foram idênticos, por isso desde então, a designação KPC-1 deixou
de ser utilizada (YIGIT et al., 2001; PATEL et al., 2009). Uma variação de um único aminoácido da KPC-2, designada KPC-3, foi reportada em um surto de K. pneumoniae em um centro médico de Nova Iorque (WOODFORD et al., 2004). A KPC-4 também vem de uma mutação da KPC-2, assim como a KPC-5, descrita em uma amostra de Pseudomonas aeruginosa (WOLTER et al., 2009). De acordo com o site http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1, foram detectados 22 variantes do gene blaKPC., sendo as enzimas KPC-2 e KPC-3 as mais prevalentes no mundo (NORDMANN et
al., 2009; ANDRADE et al., 2011; CHEN et al., 2012 ).
Como o próprio nome diz, essa enzima é mais frequentemente isolada em amostras de K. pneumoniae e dados do SENTRY mostram que a KPC é a carbapenemase mais associada a amostras de K. pneumoniae nas Américas do Norte e do Sul, mas também existem relatos de K. pneumoniae produtoras de KPC na Europa e na Ásia (CUZON et al., 2010; NAVON-VENEZIA et al., 2005; VILLEGAS et al., 2006; WEI et al., 2007; WOODFORD et al., 2008;). Contudo esta enzima tem sido identificada em outras bactérias de importância clínica da família Enterobacteriaceae como as espécies de Enterobacter spp., Salmonella spp., K. oxytoca, E. coli, Citrobacter freundii e Serratia spp. (ANDERSON et al., 2007; BRATU et al., 2005; DEL PELOSO et al., 2010; MARCHAIM et al., 2008; MIRIAGOU et al., 2003; PETRELLA et al., 2008; QUEENAN e BUSH, 2007; RODRIGUEZ et al., 2014; TUON, et al., 2015; YIGIT et al., 2003; ZAVASCKI et al., 2009; ZHANG et al., 2007) e também em
não fermentadoras como a P. aeruginosa e A. baumannii (VILLEGAS et al., 2007; ROBLEDO et al., 2011; JÁCOME et al., 2012; ALMEIDA et al., 2012).
No Brasil, o primeiro relato de cepas de K. pneumoniae produtoras de KPC-2 foi em 2006, e foram isoladas de quatro pacientes hospitalizados em uma unidade de cuidados intensivos de um hospital em Recife (MONTEIRO et al., 2009). Logo após houve relatos no Rio de Janeiro (PEIRANO et al., 2009) e em São Paulo (PAVEZ et al., 2009). Desde então isolados produtores desta enzima foram descritos nas cinco regiões brasileiras, sendo detectados, até o momento, apenas o alelo blaKPC-2 (ALMEIDA et al., 2012ª; CABRAL et al.,
2012; CABRAL et al., 2014; CHANG et al., 2013; FEHLBERG et al., 2012; MELO et al., 2014; PEREIRA et al., 2012; RIBEIRO, et al., 2013). Em 2010, foram relatados surtos de K. pneumoniae produtoras de KPC-2 em vários estados brasileiros, causando grande apreensão na comunidade médica e científica. Assim, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) divulgou, através de uma nota técnica, medidas para o controle da disseminação de bactérias multirresistentes incluindo enterobactérias produtoras de KPC (ANVISA, 2010).
O que torna a KPC mais importante do que as outras enzimas da classe A é o fato do gene blaKPC ser encontrado principalmente em elementos móveis, o que garante a sua
dispersão não só entre as espécies de Klebsiella, mas entre outros gêneros. Muitos trabalhos têm relatado que o gene blaKPC é carreado pelo transposon Tn4401, um transposon do tipo
Tn3 com aproximadamente 10 kb inserido em uma variedade de plasmídios transferíveis, que possui uma elevada taxa de transposição replicativa (CHEN et al., 2012; CUZÓN et al., 2010; NASS et al., 2012), o que facilita a transferência do gene inter-espécies e, consequentemente, acentua o seu potencial de disseminação (PATEL et al., 2009; QUEENAN e BUSH, 2007). Esse fato, aliado à capacidade de conferirem resistência aos carbapenêmicos fez com que a KPC se disseminasse mundialmente e se tornasse um problema de saúde pública em diversos países, devido às restrições terapêuticas limitadas disponíveis para o tratamento de infecções graves (CHEN et al., 2012). Além disso, isolados produtores de KPC são normalmente MDR, o que gera perfis de resistência variados a outros antimicrobianos, como fluorquinolonas, aminoglicosídeos e sulfametoxazol-trimetroprim, devido à presença de outros genes de resistência nestes isolados (ANDRADE et al., 2014; BROLUND et al., 2014; BUENO et al., 2013; CHEN, 2012; CUZÓN et al., 2010; ENDIMIANI et al., 2008; NAAS et al., 2008; PATERSON, 2006; SHEN et al., 2009; SHENG et al., 2012; SPANU et al., 2012; WANG, et al., 2012; ZACHARCZUK et al., 2011). Esta realidade é preocupante, pois o tratamento é restrito ao uso de polimixinas, tigeciclina e aminoglicosídeos, associadas ou não ao imipenem (CARVALHAES et al., 2013; PATEL e BONOMO, 2011).
2.4 Aminoglicosídeos
2.4.1. Definição e Características
A maior parte dos aminoglicosídeos é de origem natural, produzida por micro-organismos pertencentes à família das Actinobacteria, derivados de Streptomyces spp. (estreptomicina, neomicina e tobramicina) ou Micromonospora spp. (gentamicina). Naturais ou obtidos por semi-síntese, os aminoglicosídeos são antimicrobianos que apresentam ampla atividade in vitro contra diferentes bacilos e cocos gram-negativos aeróbios, como Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp., Morganella spp., Serratia spp., Citrobacterspp., Haemophilus spp.,Acinetobacter spp. e cepas de Pseudomonas aeruginosa. Apresentam também atividade contra alguns cocos gram-positivos, como Staphylococcus aureus e alguns Streptococcus spp., Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis e Nocardia asteroides, além de serem ativas contra micobactérias (ANVISA, 2007; DURANTE-MANGONI et al., 2009; VAKULENKO e MOBASHERY, 2003). São ineficazes para bactérias anaeróbias estritas, porque não são transportados através da membrana citoplasmática para o interior da bactéria (TRABULSI, 2008). Esses antimicrobianos pertencem a uma das classes de antibióticos mais antigos, sendo a estreptomicina a primeira a ser descoberta, em 1944. Seguida pelo lançamento de outra série de substâncias similares, como neomicina, canamicina, gentamicina e tobramicina. A partir de 1970, os antibióticos semissintéticos, amicacina, dibecacina, sisomicina e netilmicina foram introduzidos na terapêutica com o objetivo de contornar problemas de desenvolvimento da resistência bacteriana (CHAMBERS e SANDE, 1996).
Os aminoglicosídeos são antibióticos bactericidas concentração dependentes, ou seja, quanto maior a concentração do antibiótico, maior é o efeito bactericida e a persistência de sua ação depende do efeito pós-antibiótico, que se caracteriza como a supressão do crescimento bacteriano que persiste depois de curtas exposições ao antimicrobiano. Estes dois aspectos fundamentam a terapia de dose diária única, utilizada para os aminoglicosídeos, sem perda da eficácia (DAMASO et al, 1984).
Os aminoglicosídeos são compostos policatiônicos, constituídos por um anel aminociclitol ligado a um aminoaçúcar, contendo grupos hidroxila livres e pelo menos dois grupos amino. Na maioria dos compostos com utilidade clínica, o grupo aminociclitol é a 2-desoxi-estreptamina, que pode ser dissubstituída na posição 4 e 5 ou 4 e 6. Esse conceito permite classificar os aminoglicosídeos em 3 classes estruturais : a 4,6- 2-desoxi-estreptamina
(4,6-DOS), composta pela canamicina, gentamicina, tobramicina e amicacina; a (4,5-DOS), que compreende a neomicina e paromomicina e em um último grupo composto por aminoglicosídeos que não se enquadram em nenhuma das classes mencionadas, como a apramicina e a estreptomicina (SAVIC et al, 2009).
Na prática clínica, as moléculas mais frequentemente prescritas são gentamicina, tobramicina e amicacina (DURANTE-MANGONI et al., 2009). A amicacina é indicada para o tratamento de bacilos gram-negativos não fermentadores (principalmente Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp.), enquanto que a gentamicina é largamente utilizada em associação com outra droga, em infecções causadas por Enterococcus spp. (OLIVEIRA et al., 2006). O uso dos aminoglicosídeos foi preconizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) como alternativa para a terapia empírica no tratamento de infecções por enterobactérias multirresistentes, especialmente as produtoras de KPC (ANVISA, 2013). No tratamento de infecções graves, como infecções urinárias associadas à sepse ou ainda, infecções de corrente sanguínea e pneumonia associada à ventilação mecânica, estes antibióticos são utilizados preferencialmente em terapia combinada com a polimixina (B ou E), com ou sem carbapenêmico (imipenem ou meropenem), ou tigeciclina (HIRSCH et al., 2010; ANVISA, 2013). Em hospitais é frequente a resistência adquirida das enterobactérias e outros bacilos gram-negativos a diferentes aminoglicosídeos. Nesse sentido, amicacina e gentamicina são os que apresentam atividade sobre maior número destas cepas (TRABULSI, 2008).
2.4.2. Mecanismo de ação dos aminoglicosídeos
Todos os aminoglicosídeos agem pelo mesmo mecanismo de ação. Essas drogas inibem a síntese proteica após atravessarem à membrana bacteriana através das porinas e interagirem com alvos específicos localizados no ribossomo (ROSSI, 2005). O ribossomo é um grande complexo formado por três moléculas de RNA e mais de 50 proteínas. Ele é responsável pela síntese de cadeias polipeptídicas, baseadas em informações contidas no RNA mensageiro (RNAm) (SETNY e TRYLSKA, 2009). Esses ribossomos são compostos por duas subunidades que apresentam diferentes coeficientes de sedimentação. A subunidade maior (50S) é composta pelas moléculas de RNA 5S e 23S e mais 33 proteínas, enquanto a subunidade menor (30S) é composta pelo RNA 16S e cerca de 20 proteínas (VAKULENKO e MOBASHERY, 2003).
Embora conhecido o mecanismo de ação dos aminoglicosídeos, ainda não se sabe ao certo quais são os mecanismos necessários para que haja a passagem do fármaco do espaço periplasmático para o citoplasma (TAMMA et al., 2012). Até o momento, especula-se que esse processo de entrada seja constituído de três etapas. Na primeira etapa, ocorre a adsorção do aminoglicosídeo na superfície bacteriana, através de interações eletrostáticas com o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS). O que possibilita sua difusão em pequenas quantidades de maneira passiva e sem gasto de energia.
A próxima etapa ocorre quando o aminoglicosídeo se liga a estruturas carregadas negativamente na parede celular. Ele competitivamente desloca íons de Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, que mantêm a união entre as células, formando “buracos” na parede celular e alterando a permeabilidade da mesma. Por esse motivo, os aminoglicosídeos são comumente utilizados em associação com antimicrobianos β-lactâmicos, principalmente os carbapenêmicos, visto que por alterarem a permeabilidade da membrana, podem agir como moduladores da resposta dos carbapenêmicos (TAMMA et al., 2012).
O transporte dos aminoglicosídeos através da membrana celular é dependente de energia, e essa energia utilizada é gerada pelo transporte de elétrons para manter o potencial transmembrana (OLIVEIRA et al, 2006). Desta forma o oxigênio é essencial para a entrada dos aminoglicosídeos na célula bacteriana, visto que moléculas de O₂ são aceptores de elétrons no fim da cadeia respiratória em microrganismos aeróbios (PINSETTA, 2010).
No citoplasma, os aminoglicosídeos ligam-se ao sítio A da região decodificadora na porção 16S da subunidade 30S do RNA ribossômico bacteriano. Essa ligação impede a translocação do RNA transportador ao seu anti-códon específico impedindo desta forma a correta leitura da fita de RNA mensageiro. Em consequência, ocorre falha na tradução e seleção de aminoácidos incorretos, formando proteínas aberrantes (Figura 3). Estas proteínas “não naturais” são utilizadas na formação da membrana bacteriana e sua presença compromete a semipermeabilidade levando à morte do microrganismo (MITSCHER, 2002; VAKULENKO e MOBASHERY, 2003).
Figura 3. Efeitos dos aminoglicosídeos sobre a síntese de proteínas.
Fonte: Adaptado de Goodman e Gilman, 12ed.
2.4.3. Resistência aos Aminoglicosídeos
A resistência aos aminoglicosídeos pode ser natural ou adquirida. Uma forma de resistência natural é a que se apresenta em bactérias anaeróbias estritas, visto que, como citado anteriormente, à entrada do aminoglicosídeo na célula é um processo ativo que necessita oxigênio. Também se observa que as bactérias facultativas são muito mais resistentes quando se proliferam em meios anaeróbios.
A resistência adquirida aos aminoglicosídeospode ser atribuída a vários mecanismos que podem coexistir na mesma célula, como por exemplo, diminuição da entrada e permanência do antimicrobiano na célula bacteriana (alterações ou perda de porinas e bombas de efluxo); diminuição da afinidade do antimicrobiano pelo ribossomo bacteriano e inativação do fármaco por enzimas microbianas (VAKULENKO e MOBASHERY, 2003; MAGNET e BLANCHARD, 2005; ALEKSHUN e LEVY, 2007; HOUGHTON et al., 2010). A figura abaixo ilustra os diferentes tipos de mecanismos de resistência bacteriana (Figura 4).
O mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos comumente encontrado em enterobactérias é a inativação enzimática, que é mediada por três classes de enzimas, as acetiltransferases (AACs), as nucleotidiltransferases (ANTs) e as fosfotransferases (APHs) (DOI e ARAKAWA, 2007). Outro mecanismo descrito inclui a modificação do sítio alvo por mutação do gene 16S RNAr (GALIMAND et al., 2005), resultando numa baixa afinidade do fármaco ao ribossomo bacteriano e a metilação do 16S RNAr, um mecanismo encontrado na
maioria dos organismos produtores de aminoglicosídeos e em isolados clínicos (GALIMAND et al., 2005; DOI e ARAKAWA, 2007; RAMIREZ e TOLMASKY, 2010; WACHINO e ARAKAWA, 2012).
Figura 4. Representação dos diversos tipos de mecanismos de resistência bacteriana.
Fonte:http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/modulo3/pop_me canismo.htm. Acesso em 25/01/2015.
2.4.3.1. Enzimas Modificadoras de Aminoglicosídeos
Diferentemente das β-lactamases, as enzimas que conferem resistência aos aminoglicosídeos agem modificando a estrutura química do antibiótico, impedindo que este se ligue ao seu alvo, essas enzimas são conhecidas como Enzimas Modificadoras de Aminoglicosídeos (EMAs) e sua presença em bactérias gram-positivas e gram-negativas elevam os valores das CIM em mais de 10 vezes, principalmente para a gentamicina (DURANTE-MAGONI et al., 2009; RAMIREZ e TOLMASKY, 2010; WACHINO e ARAKAWA, 2012). A modificação enzimática pode afetar tanto grupos aminas como hidroxilas mediante processos de fosforilação ou adenilação por fosfotransferases e nucleotidiltransferases ou mediante um processo de N-acetilação por acetiltransferases (DOI et al., 2007) (Figura 5). Os antimicrobianos ao serem modificados por essas enzimas passam
apresentar baixa afinidade ao ribossomo bacteriano, ocasionando dessa forma a resistência a estas drogas (VAKULENKO e MOBASHERY, 2003).
Além de serem subclassificadas de acordo com as alterações que provocam na molécula de antimicrobiano, as EMAs também são subdivididas levando em consideração a posição onde provocam esta alteração no antimicrobiano e no fenótipo conferido pela mesma (VAKULENKO e MOBASHERY, 2003; YAMANE et al., 2005). Por este motivo, são usados diferentes sistemas de nomenclatura para essas enzimas. O primeiro deles refere-se à ação enzimática e consiste em três letras (AAC, APH, ANT), em seguida um número entre parênteses identifica o local onde houve a modificação e, logo após, um numeral romano designa a subclasse, por exemplo, AAC(3)-Iia (DOI et al., 2007). Para o gene codificante também se utiliza três letras, agora minúsculas e em itálico para designar cada tipo de atividade (aac, ant, aph), uma letra maiúscula para identificar o local da modificação e um número para o subtipo do gene. A designação aph(3”)-Ib, por exemplo, refere-se ao tipo de modificação (aph para aminoglicosídeo fosfotransferase), a posição onde a modificação é introduzida (3”) e também lista o subtipo do gene (Ib) (BECKER e COOPER, 2013).
Segundo alguns autores as EMAs são derivadas ou dos organismos que produzem aminoglicosídeos, ou de mutação de genes que codificam enzimas relacionadas com a respiração celular (CUNDLIFFE, 1989; SHAW et al., 1993). Essas enzimas são produzidas constitutivamente, o seu peso molecular é de cerca de 23.000 a 63.000 Da, e necessitam da presença de cátions bivalentes para atuar. Normalmente conferem resistência de alto nível, embora isso dependa de múltiplos fatores como o microrganismo, a cepa individual, o nível de enzima produzido e sua atividade catalítica (VAKULENKO e MOBASHERY, 2003). Os genes codificadores dessas enzimas estão localizados em elementos genéticos móveis, muitas vezes coexistindo com outros determinantes de resistência, como beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e carbapenemases, resultando em isolados multirresistentes e com alta capacidade de disseminação (GUIMARÃES et al., 2013; RAMIREZ e TOLMASKY, 2010).
Existem mais de 50 tipos diferentes de EMAs, que podem agrupar-se em três tipos segundo a reação que catalisam (VAKULENKO e MOBASHERY, 2003). As acetiltransferases (AAC) catalisam um processo de N-acetilação dependente de acetil-coenzima A (AcCoA), e a modificação ocorre após a transferência de um grupo acetil da AcCoA para um grupo amino do aminoglicosídeo (Figura 5), produzindo acetilaminoglicosídeo e coenzima A (CoASH) (CALDWELL e BERGHUIS, 2012). Essas enzimas catalisam a acetilação das posições 1 [AAC(1)], 3 [AAC(3)-I], 2’ [AAC(2’)] ou 6’ [AAC(6’)], resultando em quatro classes (RAMIREZ e TOLMASKY, 2010). As AAC(6’) são
as EMAs mais frequentes e importantes. Os genes que as codificam já foram descritos em plasmídeos e transposons, e estão disseminados entre patógenos negativos e gram-positivos. Entre elas, as enzimas AAC(6’)-I são as mais comumente encontradas e conferem resistência à amicacina, tobramicina, netilmicina, canamicina, entre outros. Até o presente, pelo menos 24 genes que codificam variantes de AAC(6’)-I foram descritos. As enzimas AAC(3) constituem o segundo grupo mais comum de acetiltransferases e modificam gentamicina, sisomicina e fotimicina (BECKER e COOPER, 2013).
Figura 5. Modificação na molécula de canamicina A promovida pela enzima bacteriana AAC(6’).
Fonte: Pinseta, 2010.
As fosfotransferases (APH) catalisam reações de O-fosforilação e transferem um grupo fosfato do GTP ou ATP, na presença de Mg2+, para um grupo hidroxila do aminoglicosídeo, resultando em fosfoaminoglicosídeo e ADP ou GDP (Figura 6) (WRIGHT e THOMPSON, 1999). As classes e subclasses de fosfotransferases já descritas são: APH(2’’)I a IV, APH(3’)-I a VII, APH(3’’)-I, APH(4)-I, APH(6’)-I, APH(7’’)-I, e APH(9’)-I (RAMIREZ e TOMALSKY, 2010). A maior classe, em número de enzimas, é a das [APH(3’)], que modificam os grupos hidroxila dos aminoglicosídeos na posição 3. Dentre essas, a subclasse mais prevalente em gram-negativos é a das enzimas APH(3′)-I, que conferem resistência a canamicina, neomicina, paramomicina, ribostamicina e lividomicina. Outra importante subclasse destas enzimas é APH(3’)-VI, codificadas pelo gene aph(3′)-VI que confere resistência à amicacina, isepamicina, canamicina, neomicina, entre outros (BECKER e COOPER, 2013; RAMIREZ e TOMALSKY, 2010).
Figura 6. Modificação na molécula de canamicina A promovida pela enzima bacteriana APH (3’).
Fonte: Pinseta, 2010.
As nucleotidiltransferases (ANT) catalisam reações de O-adenilação, também dependentes de ATP, e transferem um grupo adenilato do ATP ao grupo hidroxila (Figura 7), resultando em adenililaminoglicosídeo e pirofosfato. São classificadas em cinco classes ANT(2’’), ANT(3’’), ANT(4’), ANT(6), ANT(9) (RAMIREZ e TOLMASKY, 2010). Apesar de ser a menor família de EMAs em número, possuem significante importância clínica, pois ANT(2’’) confere resistência à amicacina, tobramicina e gentamicina, que são os aminoglicosídeos mais frequentemente prescritos (AVENT et al., 2011). O gene ant(2″)-Ia é amplamente distribuído, sendo localizado em plasmídeos e transposons encontrados tanto em patógenos da família Enterobacteriaceae quanto em bacilos gram-negativos não-fermentadores (RAMIREZ e TOLMASKY, 2010).
Figura 7. Modificação na estrutura de canamicina A promovida pela enzima bacteriana ANT(4’).
Fonte: Pinseta, 2010.
Em K. pneumoniae e E. aerogenes a enzima AAC(6’)-Ib e sua variação AAC(6’)-Ib-cr tem sido as mais relatadas entre essas espécies, mas também há relatos de AAC(3)-II, ANT(2”)-Ia, ANT(3”)-Ia, APH(3’)-Ia, entre outras (PARK et al., 2006; KIM et al., 2009; ANTUNEZ et al., 2011; MIRÓ et al., 2013; ALMAGHRABI et al., 2014; LIANG et al., 2015; DIAS-GONÇALVES et al., 2015; RIZI et al., 2015).
Apesar da maior prevalência das EMAs em bactérias Gram negativas, nos últimos anos outro mecanismo de resistência que ganhou importância é a produção das metiltransferases 16S RNAr. Estas enzimas conferem níveis extremamente altos de resistência aos aminoglicosídeos, por metilação sítio-específico do RNA ribossômico 16S, as quais têm sido relatadas entre espécies de Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. (YOKOYAMA et al., 2003). Em bactérias produtoras de metiltransferases 16S RNAr, são observados valores de MIC ≥ 256 µg/ml para a amicacina, tobramicina e gentamicina (DOI et al., 2007).
2.4.3.2. Metiltransferases 16S RNAr
Em 1989, Cundliffe observou que os actinomicetos produtores de aminoglicosídeos abrigavam genes 16S RNAr específicos, para proteger a bactéria do antibiótico produzido (DOI e ARAKAWA, 2007). Acreditava-se que este mecanismo de resistência estava restrito a esses microrganismos produtores, porém em 2002, o primeiro gene responsável por codificar uma metiltransferase foi descrito na Polônia em um isolado de Citrobacter freundii e designado de armA (GOLOBIEWSKI et al., 2007). No ano seguinte, na França (GALIMAND et al., 2003) e no Japão (YOKOYAMA et al., 2003), foram relatados outros casos de isolados de espécies clínicas relevantes (K. pneumoniae e P. aeruginosa) produtoras de metiltransferases 16S RNAr. Foi visto que, estas enzimas adicionavam grupamentos químicos (grupamentos metila) ao ribossomo bacteriano, mostrando-se capazes de conferir um nível elevado de resistência a aminoglicosídeos utilizados clinicamente (DOI e ARAKAWA, 2007; WACHINO e ARAKAWA, 2012).
Os genes 16S RNAr implicados na resistência aos aminoglicosídeos são classificados em dois subgrupos, dependendo da posição do nucleotídeo para ser modificada no sítio A do 16S RNAr (BEAUCLERK e CUNDLIFFE, 1987) (Figura 8). A 16S-RMTase N7-G1405 sofre uma metilação pós-transcricional no nitrogênio na posição 7 do resíduo G1405 o que confere uma resistência exclusivamente a aminoglicosídeos 4,6- DOS, tais como amicacina e gentamicina (DEMYDCHUK et al., 1998). A N1-A1408 16S RNAr sofre uma modificação no nitrogênio na posição 1 do resíduo A1408, o que confere uma elevada resistência aos aminoglicosídeos (4,6-DOS), assim como aos (4,5-DOS), tais como neomicina (OHTA e HASEGANA, 1993ª). Essa metilação impede a ligação do aminoglicosídeo com a subunidade menor do ribossomo. Dessa forma, o fármaco não reconhece seu sítio alvo, não se liga ao ribossomo e não impede a tradução pelo RNA mensageiro, garantindo o alto nível de
resistência conferido por esse mecanismo (DURANTE-MANGONI et al., 2009; WACHINO e ARAKAWA, 2012).
Figura 8. Locais de decodificação na região A do 16S RNAr na subunidade 30S.
Fonte: Wachino e Arakawa, 2012.
Até o presente, foram descritos dez tipos de metiltransferase 16S RNAr: Uma delas, denominada ArmA (aminoglycoside resistance methyltransferase), descrita por Galimand et al. (2005) em K. pneumoniae. Outros oito tipos descritos são variantes de Rmt (ribossomal methyltransferases) como RmtA (YOKOYAMA et al., 2003), RmtB (DOI et al., 2004), RmtC (WACHINO et al., 2006), RmtD (DOI et al., 2007), RmtE (DAVIS et al., 2010), RmtF (GALIMAND et al, 2012), RmtG (BUENO et al., 2013) e RmtH (O’HARA et al., 2013). Outro tipo de metiltransferase 16S rRNA é NpmA (WACHINO et al., 2007).
As enzimas ArmA (GOLEBIEWSKI et al., 2007) e RmtA (YOKOYAMA et al., 2003) revelaram o surgimento das metiltransferases adquiridas exogenamente. Em 2002, na Polônia, um gene que codificava a ArmA, foi depositado como parte da sequência de um plasmídeo de Citrobacter freundii. Em 2003, uma cepa resistente a aminoglicosídeos de Pseudomonas aeruginosa foi isolada no Japão e descrita como produtora de RmtA. Esta nova enzima mostrava uma semelhança em 35% com metiltransferases de vários actinomicetos, sugerindo que esses genes são adquiridos horizontalmente de microrganismos não patogênicos (DOI, 2006). Ainda no Japão, DOI et al., em 2004 identificou a enzima RmtB em Serratia marcescens, muito relacionada a RmtA, compartilhando 82% dos aminoácidos. Desde então, já foi encontrado em diversos países, como China (CAO et al., 2014), Índia (HIDALGO et al., 2013), Arábia Saudita (AL SHEIKH et al., 2014), EUA, México, Brasil (FRITSCHE et al., 2008) e Bélgica (BOGAERTS et al., 2011).
As enzimas ArmA e RmtB são predominantes no mundo, com relatos de ocorrência no Leste da Ásia, Europa, América do Norte e do Sul e Oceania (TIAN et al., 2011; POIREL et
al., 2010; WU et al., 2009; FRITSCHE et al., 2008; KANG et al., 2008; BOGAERTS et al., 2007, YAMANE et al., 2008b, 2007 b). O gene rmtB tem sido descrito como prevalente em membros da família Enterobacteriaceae (POIREL et al., 2014).
Em 2006, WACHINO et al., identificou a RmtC, isoladas de cepas de Proteus mirabilis. Esta enzima também foi detectada em isolados de S. 38ntérica do Reino Unido e dos Estados Unidos, K. pneumoniae do Quênia e da Índia, E.coli do Reino Unido e da Alemanha e Providencia stuartii da Índia (LIVERMORE et al., 2011; POIREL et al., 2011c,d; HOPKINS et al., 2010; FOLSTER et al., 2009).
As enzimas RmtD e RmtD2 foram encontradas distribuídas em países da America do Sul como Argentina e Chile (FRITSCHE et al., 2008; TIJET et al., 2011; YAMANE et al., 2008ª). No Brasil, a enzima RmtD foi encontrada em uma amostra clínica de P. aeruginosa (DOI et al., 2007b). Recentemente, um novo gene codificador de metiltransferase (rmtG) foi detectado em isolados de K. pneumoniae produtores de KPC-2 no estado de São Paulo (BUENO et al., 2013).
Outras metiltransferases foram encontradas esporadicamente como a RmtE e a NpmA detectadas em E. coli dos Estados Unidos e no Japão (WACHINO et al., 2007). As enzimas RmtF e RmtH foram identificadas em isolados clínicos de K. pneumoniae (O’HARA et al., 2013, GALIMAND et al., 2012). O mapa a seguir (Figura 9) mostra à distribuição mundial das enzimas que conferem as bactérias a resistência aos aminoglicosídeos.
Figura 9. Distribuição mundial das metiltransferases 16S RNAr.
Grande parte destes genes está associada com elementos genéticos móveis, como integrons e transposons inseridos em plasmídeos, denotando a sua capacidade de disseminação horizontal intra e inter espécies (DOI e ARAKAWA, 2007; DOI et al., 2007ª; DOI et al., 2007b; YAMANE et al., 2007; WACHINO e ARAKAWA, 2012).
Em diversos estudos têm sido evidenciada a presença de isolados carreando genes de metiltransferases 16S RNAr coexistindo com outros genes de resistência, especialmente blaKPC-2 (BUENO et al., 2013; DOI et al., 2007; GALANI et al., 2012; HABEEB et al., 2014;
HUANG et al., 2012; MEZZATESTA et al., 2013; ZACHARCZUK et al., 2014). Na China, Jiang et al. (2010) demonstraram, em K. pneumoniae, a presença de um plasmídeo carreando simultaneamente os genes blaKPC-2 e armA, mais tarde, Li et al. (2012) e Sheng et al. (2012)
descreveram a co-existência de rmtB e blaKPC-2 em isolados de K. pneumoniae. Achados
semelhantes também foram notificados na Grécia (GALANI et al., 2012). Em outro estudo, conduzido por Hidalgo et al. (2013) na Índia, o gene rmtB foi descrito em isolados que carreavam simultaneamente genes que codificam as enzimas NDM, CTX-M e RmtF, sendo esta descrita pela primeira vez. A co-existência de genes rmtB, blaNDM-1 e blaCTX-M-15 foi descrita em outro estudo conduzido na Bélgica (BOGAERTS et al., 2011). A presença simultânea de genes de metiltransferases 16S RNA e EMAs também foi previamente descrita. Hu et al. (2013), na China, relataram a detecção de aac(3)-Ib e aac(6’)-Ib, aph(3’)-VI e ant(3’’)-I em K. pneumoniae que carreavam simultaneamente os genes armA e rmtB. Ainda na China, Liang et al. (2015) observaram isolados de K. pneumoniae carreando os genes aac(3)-II, aac(6’)-Ib, ant(3”)-I, ant(2”)-I, armA e rmtB, simultaneamente.
2.5 Infecção e Colonização
Todo paciente acometido por enterobactérias produtora de carbapenemase como a KPC podem ser classificados como: paciente colonizado, paciente infectado ou paciente contactante. O paciente colonizado é aquele que porta o microrganismo na pele e/ou superfícies mucosas sem nenhum sinal e/ou sintoma de infecção. Enquanto que o paciente infectado é aquele que desenvolve síndrome infecciosa de qualquer topografia (pneumonia, infecção de trato urinário, infecção de corrente sanguínea, meningite, etc), com verificação do microrganismo em cultura de líquido estéril (sangue, LCR, urina, etc) ou em cultura de secreção não estéreis que preencham critérios qualiquantitavos de infecção (lavado bronco-alveolar, cultura quantitativa de aspirado traqueal) segundo os critérios nacionais/ANVISA.
Nestes casos, o tratamento é feito com antibióticos específicos para o tipo de bactéria identificada. O paciente contactante é aquele que compartilhou o quarto com paciente com suspeita ou confirmação de colonização ou infecção por enterobactérias produtoras de KPC (ANVISA, 2010).
A colonização e/ou infecção de pacientes por mais de uma espécie bacteriana com perfil de resistência aos antimicrobianos, constitui um meio adequado para a transferência de genes codificadores para resistência entre patógenos, favorecendo a multirresistência (SNYDER et al., 2011). A rápida detecção de pacientes colonizados por bactérias resistentes, acrescida da adesão às medidas de controle, com destaque para as precauções de contato, pode reduzir a disseminação destes patógenos e impactar as taxas de infecções, morbi-mortalidade e, consequentemente, nos custos hospitalares (LANDELLE et al., 2013).
3.
OBJETIVOS
3.1. Geral
Identificar a presença de genes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs) e de metiltransferases 16S RNAr em isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes portadores do gene blaKPC, provenientes de
hospitais de Recife-PE.
3.2. Específicos
Determinar o perfil de susceptibilidade aos aminoglicosídeos amicacina, gentamicina e tobramicina nos isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC.
Descrever o perfil das amostras (colonização ou infecção) nas quais foram isoladas K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC e resistente a aminoglicosídeos.
Investigar a presença dos genes de EMAs: acetiltransferases aac(6’)-Ib; aac(3)-Ia, fosfotransferases aph(3’)- VI e nucletidiltransferases ant(2”)-Ia em isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC.
Investigar a presença dos genes metiltransferases 16S RNAr: armA, rmtB, rmtD em isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores do gene blaKPC.
Comparar a presença dos genes encontrados com o perfil fenotípico de resistência aos aminoglicosídeos dos isolados bacterianos estudados.
Comparar os isolados de Klebsiella pneumoniae e de Enterobacter aerogenes com relação ao perfil fenotípico e genotípico encontrado.
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