Metodologia analítica

As análises foram realizadas em três cromatógrafos diferentes, no primeiro foi empregado um cromatógrafo à líquido da Waters, modelo Alliance 2695, acoplado a um espectrômetro de massas quadrupolo simples (LC-MS) Waters, modelo ZQ 4000, mostrado na Figura 7, pertencente ao Laboratório Central da SANASA. O segundo sistema utilizado foi um cromatógrafo à liquido da Agilent modelo 1200, acoplado a um espectrômetro de massas triplo quadrupolo (Triple QuadAgilent modelo 6410) pertencente ao laboratório de Ecotoxicologia do CENA-USP e o terceiro sistema utilizado foi um cromatógrafo à liquido da Thermo, acoplado a um espectrômetro de massas da Thermo também triplo quadrupolo, modelo TSQ Quantum Access (Figura 8), pertencente a empresa Agrosafety, localizada em Piracicaba-SP.

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Figura 7. Cromatógrafo à Liquido acoplado ao espectrômetro de massas (LC-MS),

pertence ao Laboratório Central da SANASA.

Figura 8 Cromatógrafo à líquido acoplado ao espectrômetro de massas em

tandem(LC-MS/MS) TSQ Quantum Access da empresa Agrosafety, localizada em Piracicaba-SP.

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Nos três sistemas utilizados, as amostras foram analisadas empregando- se em uma coluna XTerra C18 (Waters, Milford,Ireland) com dimensões de 150 mm de comprimento e 2,1 mm de diâmetro interno, recheada com partículas de 5,0 µm. A coluna analítica foi mantida sob temperatura de 20 oC durante as análises e o volume de injeção foi de 35 µL. A fase móvel (A) consistiu-se de metanol, grau HPLC filtrado em fibra de vidro 0,45 µm e degaseificado, a fase móvel (B) de água ultra pura igualmente filtrada e degaseificada. O gradiente de eluição empregado no primeiro e segundo cromatógrafo, da Waters e Agilent, consta na Tabela 8. O gradiente de eluição empregado no cromatográfo da Thermo consta na Tabela 9.

Tabela 8. Gradiente de eluição utilizado no cromatógrafo Waters e Agilent Tempo (min) Fase Móvel A (%) Fase Móvel B (%)

0 40 60

28 100 0

28.1 40 60

30 40 60

Tabela 9. Gradiente de eluição empregado no cromatógrafo Thermo Tempo (min) Fase Móvel A (%) Fase Móvel B (%)

0 30 70

4 90 10

8.25 90 10

8.35 30 70

10 30 70

4.1.1. Condições operacionais do Espectrômetro de Massas

A fonte de ionização empregada nos três sistemas foi a electrospray (eletronebulização) no modo negativo e os fragmentos dos íons precursores foram otimizados através da infusão de uma solução padrão dos analitos . Nos três espectrômetros de massas a temperatura de 280 oC foi aplicada na

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dessolvatação e na fonte 150 oC, utilizando o nitrogênio como gás para realizar este processo, com uma vazão de 600 L h-1 e no cone 120 L h-1. No primeiro sistema utilizado, o quadrupolo simples da Waters, o capilar do electrospray foi mantido em 3,69 kV, o cone a 54 V, e o extrator a 5 V. Na Tabela 10 são apresentadas as informações sobre os íons precursores, energia de colisão utilizados nos sistemas triplo quadruplo da Agilent e da Thermo, fornecedor dos padrões analíticos, fragmentos da ionização e pureza dos quatro padrões analíticos utilizados no presente trabalho.

Tabela 10. Fragmentos da ionização, energia de colisão, fornecedor, pureza, íon

precursor e massa molar dos compostos analisados. Composto Fragmentos da

ionização m/z

Energia colisão (eV) Fornecedor dos padrões analíticos Pureza dos padrões (%) Íon precursor m/z Agilent Thermo Agilent Thermo

Estrona (E1) 143,0 145,2 143,0 145,2 55 40 55 40 Sigma 99 269,2 17β-estradiol (E2) 143,0 145,3 143,4 145,4 40 31 60 44 Aldrich 97 271,1 Estriol (E3) 145,2 171,0 145,3 171,3 39 37 39 37 Aldrich 98 287,2 17α- etinilestradiol (EE2) 144,9 159,0 145,3 159,2 34 39 44 37 Aldrich 98 295,2

4.1.2. Preparo das soluções dos padrões de hormônios

As soluções dos padrões de hormônios foram preparadas pesando-se 10 mg de cada analito (E1, E2, EE2 e E3) em uma balança analítica de cinco casas decimais de precisão, dissolvendo-se em um balão volumétrico com aproximadamente 20 mL de metanol, e completando-se até 100 mL com o mesmo solvente. A concentração das soluções dos padrões resultantes foi de 100 mg L-1.

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Essa solução, chamada de solução estoque, foi transferida para um frasco individual de vidro âmbar com tampa de teflon. As soluções de trabalho foram obtidas misturando-se 1 mL de solução estoque individual de concentração conhecida (100 mg L-1), fazendo-se diluições sucessivas ate as concentrações desejadas de 10, 20, 50, 75 e 100 µg L-1, em balões de 10 mL.

4.1.3. Material e método da extração em fase sólida

A etapa de extração tem como objetivo concentrar os compostos de interesse (analitos) bem como separá-los das espécies que poderiam interferir na análise. A remoção de compostos orgânicos da fase aquosa foi feita por EFS, adaptando-se a metodologia descrita por Alda e Barceló (2001). Vale salientar que a metodologia utilizada é similar a de outros trabalhos (Ghiselli, 2006; Raimundo, 2007; Wang et al., 2008; Wang et al., 2005), ou seja, pequenas modificações foram feitas para adequar a extração aos compostos analisados e ao equipamento utilizado na quantificação dos mesmos.

A extração em fase sólida utiliza uma coluna contendo um sorvente apropriado para reter o analito que é então eluído com um solvente específico. Nesse trabalho foram utilizados cartuchos C18 (Oasis) contendo 500 mg de fase sólida, que é o cartucho adequado para adsorver os compostos de interesse em meio aquoso (PEREIRA, 2011).

As extrações foram realizadas utilizando-se uma bomba de vácuo (Fanem) por meio da fixação dos cartuchos em um sistema de manifold com capacidade para doze extrações simultâneas (Figura 8). Para a etapa de eluição, balões volumétricos de 10 mL foram utilizados para armazenar o solvente de eluicão contendo os analitos de interesse.

As amostras simples de água bruta e água tratada foram coletadas em frascos âmbar de 1 litros e armazenadas na geladeira por 24 a 36 horas, tempo necessário para se fazer as extrações em fase sólida, As amostras de água bruta foram filtradas em membranas de fibra de vidro 0.45 μm . Os cartuchos do tipo C18 (Oasis), posicionados no sistema de extração foram condicionados com: 7 mL de metanol, 7 mL acetonitrila, 7 mL de água destilada, tomando-se cuidado para

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não secar os cartuchos. Em seguida, as amostras foram percoladas através dos mesmos, a uma vazão média de 5 mL por minuto. A eluição dos analitos dos cartuchos foi feita com 7 mL de metanol e 3 mL de acetonitrila em tubos de ensaio com pequenas alíquotas de 0,5 mL ate atingir o volume de 10 mL. Secou-se as soluções em gás nitrogênio à temperatura ambiente e em seguida dissolveu-se o extrato seco em 1mL de metanol, concentrando-se 1000 vezes a amostra.

Figura 9. Sistema de extração em fase sólida (EFS), manifold com capacidade de

doze extrações simultâneas.