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ANDRÉ FELIPE DE OLIVEIRA
DETERMINAÇÃO DE HORMÔNIOS EM ÁGUAS BRUTA E
TRATADA VIA EFS-CL-EM/EM:
EFICIÊNCIAS DE DEGRADAÇÃO COM OZONIZAÇÃO E
CLOROAMONIAÇÃO
LIMEIRA
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Tecnologia - FT
Pós-Graduação da Faculdade de Tecnologia
ANDRÉ FELIPE DE OLIVEIRA
DETERMINAÇÃO DE HORMÔNIOS EM ÁGUAS BRUTA E
TRATADA VIA EFS-CL-EM/EM:
EFICIÊNCIAS DE DEGRADAÇÃO COM OZONIZAÇÃO E
CLOROAMONIAÇÃO
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós Graduação em Tecnologia, da Faculdade de Tecnologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Tecnologia, área de concentração Tecnologia e Inovação.
Orientadora: PROFA. DRA. MARIA APARECIDA CARVALHO DE MEDEIROS
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ANDRÉ FELIPE DE OLIVEIRA, E ORIENTADO PELA PROFA.DRA. MARIA APARECIDA CARVALHO DE MEDEIROS
ASSINATURA DA ORIENTADORA
LIMEIRA
2015
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RESUMO
Há uma preocupação crescente na área de Saneamento Ambiental com relação a qualidade das águas dos corpos hídricos, tendo em vista que pesquisas têm revelado que os sistemas de tratamentos convencionais de esgotos e de água para abastecimento público não possuem eficiências adequadas para remoção de compostos orgânicos classificados como desreguladores endócrinos (DE). Nesta classe de compostos são destacados os estrógenos naturais 17 β-estradiol (E2), estriol (E3), estrona (E1) e o sintético 17 -etinilestradiol (EE2). Os efeitos destes hormônios sexuais, que são compostos extremamente ativos biologicamente, têm sido citados como agentes etiológicos de feminilização em peixes e também de vários tipos de cânceres. Neste sentido, trabalhos aplicando tecnologias avançadas de tratamento destes DE estão sendo desenvolvidos por vários grupos de pesquisas. Apesar de que as Legislações ambientais relacionadas aos parâmetros de lançamento (RESOLUÇÃO CONAMA no. 430 de 2011) e de parâmetros de potabilidade (Portaria no. 2914 de 2011) não contemplarem estes compostos DE, sendo que diversos trabalhos têm sido publicados com quantificação destes compostos em água da ordem de ng L-1. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos: (1) adaptação e validação de metodologia analítica para confirmar e quantificar simultaneamente os hormônios E1, E2, E3 e EE2, nas águas bruta e tratada do rio Atibaia, manancial que abastece o município de Campinas, utilizando a técnica de extração em fase sólida (EFS), juntamente com a técnica de Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (CL-EM/EM), (2) aplicação de tecnologias de degradação destes compostos E1, E2, E3 e EE2 em escala piloto, pelos processos de ozonização e cloroamoniação, visando contribuir com a determinação das dosagens, do tempo de contato e da eficiência de remoção. Os resultados obtidos nas análises via EFS-LC-MS/MS mostraram a ocorrência do hormônio sexual natural E1, na água bruta do rio Atibaia com concentração de 17 ng L-1, sendo que para os demais E2 e E3 os valores obtidos foram inferiores ao limite de quantificação 2 ng L-1 e para o EE2 inferior a 5 ng L-1. As técnicas de oxidação ozonização e cloroamoniação utilizadas nos ensaios demonstraram eficiências de degradação em média, maiores do que 95% dos DE estudados, com exceção de E1, cuja eficiência de remoção ficou entre 87% a 93%, dependendo da faixa de fortificação.
Palavras-chave: Desreguladores Endócrinos, Hormônios, Ozonização, Cloroamoniação, Cromatografia Líquida, Espectrometria de massas.
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ABSTRACT
There is growing concern in the field of Environmental Sanitation regarding the water quality of water bodies, given that research has shown that systems of conventional treatments of sewage and public water supply does not have adequate efficiencies to removal of some organic compounds Endocrine Disruptors (DE). In this class of compounds are included the natural estrogens 17 β-estradiol (E2), estriol (E3), estrone (E1) and the synthetic 17 -ethinylestradiol (EE2). The effects of these sex hormones, which are highly biologically active compounds, have been cited as etiological agents of feminization in fish and various types of cancers. In this regard, several works by applying advanced technologies for treating these DE are being developed by many research groups. Although the environmental legislations related to the parameters of launch (CONAMA RESOLUTION. 430 of 2011) and potability parameters (Ordinance no. 2914 2011) does not address these DE compounds, several studies have been published with quantification of these compounds in the order of ng L-1. In this context, the aimsm of this paper were: (1) adaptation and validation of the analytical methodology to confirm and to quantify simultaneously the E1, E2, E3 and EE2 hormones, raw water and treated in the Atibaia River, a source that supplies the municipality Campinas, using the technique of solid phase extraction (EFS) with the technique of Liquid Chromatography coupled to mass spectrometry in tandem (LC-MS/MS), (2) applying degradation technologies of these compounds E1, E2, E3 and EE2 in pilot scale, by using the processes of ozonation and cloroamoniation, to contribute to the determination of dosage, contact time and degradation efficiencies. The results obtained in this study
via EFS-LC-MS/MS showed the occurrence of natural sex hormone E1 in the
Atibaia River raw water with a concentration of 17 ng L-1, and for the other E2 and
E3 the values were lower the quantification limit of 2 ng L-1 and EE2 less than 5 ng
L-1. The ozonation and chloroamoniation oxidation techniques used for the
degradation tests were with efficiencies on average more than 95% of the studied DE, except E1, the removal efficiency was between 87% to 93% depending on the fortification range, by using ozonation in pre oxidation and cloroamoniation and the disinfection step.
Keywords: Endocrine Disruptors, Hormones, Ozonation, Cloroamoniation, Liquid
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. OBJETIVOS ... 3
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 4
3.1.Desreguladores Endócrinos (DE) ... 4
3.1.1. Estrógenos naturais e sintéticos ... 5
3.1.2. Propriedades Físico-Químicas dos DE... 7
3.1.3. Efeitos Causados Pela Exposição ao Desreguladores Endócrinos ... 10
3.2.Determinação de Desreguladores Endócrinos (DE) ... 12
3.2.1. Amostragem e preservação ... 14
3.2.2. Filtração ... 15
3.2.3. Ajuste de pH ... 15
3.2.4. Extração e Pré-Concentração dos DE ... 16
3.2.5. Eluição ... 18
3.2.6. Secagem ... 18
3.2.7. Ressuspensão do extrato seco com solvente adequado ... 19
3.2.8. Análise ... 19
3.2.8.1. Validação de métodos cromatográficos ... 20
3.3.Ozonização ... 21
3.3.1. Geração de Ozônio ... 22
3.3.2. Degradação de compostos orgânicos por ozonização ... 24
3.3.3. Aplicações do Ozônio ... 28
3.4.Cloroamoniação ... 32
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 35
4.1.Metodologia analítica ... 35
4.1.1. Condições operacionais do Espectrômetro de Massas ... 37
4.1.2. Preparo das soluções dos padrões de hormônios ... 38
4.1.3. Material e método da extração em fase sólida ... 39
4.2.Testes de Ozonização ... 40
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4.2.2. Funcionamento do sistema de geração do ozônio (piloto) ... 41
4.2.3. Testes de degradação dos DE ... 44
4.3.Cloroamoniação ... 45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47
5.1.Resultados obtidos para as análises dos DE, utilizando-se o cromatógrafo líquido da Waters, quadrupolo simples (LC-MS), pertencente à empresa SANASA ... 47
5.2.Resultados obtidos para as análises dos DE, utilizando-se o cromatógrafo líquido acoplado ao detector de massas em tandem (LC-MS/MS) pertencente ao CENA-USP-Piracicaba. ... 50
5.3.Resultados obtidos para as análises dos DE, utilizando-se o cromatógrafo líquido acoplado ao detector de massas em tandem (LC-MS/MS) pertencente à empresa Agrosafety-Piracicaba ... 52
5.4.Eficiências de Degradação dos DE após a ozonização e a cloroamoniação ... 57
6. CONCLUSÕES ... 61
7. CONCIDERAÇÕES FINAIS ... 62
8. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 62
xiii
Dedico a minha esposa Meire, pelo apoio, paciência e companheirismo.
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AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, professora Dra. Maria Aparecida, por toda atenção dedicada, incentivo, ensinamentos, apoio e que com profundo respeito orientou esse
trabalho... meu muito obrigado!
À professora Dra. Isabel Jardim, como examinadora da qualificação desse trabalho.
Ao professor Dr. Valdemar Luiz Tornisielo, por gentilmente prover o equipamento para que pudéssemos realizar as análises e como examinador desse trabalho.
À professora Dra. Eny Maria Vieira, como examinadora desse trabalho.
Aos amigos e funcionários do laboratório central da Sanasa, pelo apoio, incentivo e contribuições.
Ao Dr. Franz, pelo suporte nas análises CLAE-MS-MS.
Ao químico Sidnei, Coordenador de Estação de Tratamento da Sanasa, pelo suporte nos ensaios com a planta piloto de ozonização.
À minha esposa Meire, por sua cumplicidade, companheirismo e paciência em dividir-me por longos períodos com o laboratório e computador.
À minha mãezinha Célia, que me ensinou a nunca desistir.
Às secretarias da pós-graduação, Fátima e Karen, pelo auxilio e paciência comigo.
Ao Dr. Luiz Trevisan, da Agrosafety pelo suporte nas análises CLAE-MS-MS.
Ao meu amigo Audinei, que prontamente me ajudou nas horas mais complicadas.
À professora Dra. Cassiana Raimundo, pelo auxilio nas extrações.
Ao químico Ivânio, Coordenador de Análise e Controle da Sanasa, pelo apoio e incentivo.
A todos os meus parentes e amigos que, mesmo não citados, com apoio e carinho contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
À Sanasa, pelo apoio.
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LISTAS DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura básica dos esteróides. ... 6 Figura 2. Diagrama esquemático para preparação e análise dos disruptores endócrinos. 14 Figura 3. Esquema das etapas do procedimento da extração em fase sólida. ... 18 Figura 4. Esquema genérico da formação de subprodutos da desinfecção quando da aplicação do ozônio como agente oxidante. ... 25 Figura 5. Rotas de Oxidação dos compostos durante o processo de Ozonização. Fonte: (USEPA, 1999) ... 25 Figura 6. Variação das concentrações de compostos de cloro (cloraminas e cloro livre) em função da dosagem de cloro aplicada em água contendo amônia. ... 34 Figura 7. Cromatógrafo à Liquido acoplado ao espectrômetro de massas (LC-MS),
pertence ao Laboratório Central da SANASA. ... 36 Figura 8 Cromatógrafo à líquido acoplado ao espectrômetro de massas em tandem(LC-MS/MS) TSQ Quantum Access da empresa Agrosafety, localizada em Piracicaba-SP. . 36 Figura 9. Sistema de extração em fase sólida (EFS), manifold com capacidade de doze extrações simultâneas. ... 40 Figura 10. Sistema de geração do ozônio (projeto piloto). ... 41 Figura 11. Esquema do projeto-piloto de ozônio instalado no Laboratório de pesquisa das ETA 3 e 4. Fonte: SANASA, 2011... 42 Figura 12. Tanques com volume de 5000 L, contendo soluções padrões dos hormônios (E1, E2, E3 e EE2). Estes tanques estão instalados estão instalados interligados com a linha de ozonização na ETA 3,4 da SANASA, sendo utilizados para verificar a remoção dos estrógenos por meio da ozonização. ... 44 Figura 13. Equipamento de ensaios Jar- Teste instalado no Laboratório de pesquisa das ETA 3 e 4. ... 46 Figura 14. Cromatograma obtido para a mistura dos padrões DE de 500 µg L-1 no sistema CL-MS da empresa SANASA . ... 48 Figura 15. Cromatograma de um padrão de estriol, obtido com cromatógrafo acoplado com detector de massas (CL/EM) da empresa SANASA. ... 48 Figura 16. Curva analítica do padrão Estriol (E3), R2= 0,999993, obtido com cromatógrafo acoplado com detector de massas (CL/EM) da empresa SANASA. ... 49 Figura 17. Curva analítica obtida a partir das injeções com valores de concentrações de
-1, para o composto E1(estrona), dados obtido com o espectrômetro de
massas Triple QuadAgilent. ... 51 Figura 18. Cromatogramas da mistura das soluções dos padrões DE com concentração igual a 100 µg L-1, utilizando-se o modo de aquisição conhecido como Monitoramento Múltiplo de Reações, MRM. ... 53 Figura 19. As duas transições monitoradas para cada um dos compostos E1, E2, E3 e EE1, e as respectivas energias de colisão empregadas, utilizano-se o monitoramento SRM. ... 54 Figura 20. Curva de Analítica do etinilestradiol obtida no LC-MS/MS, modelo TSQ
Quantum Access, da Thermo. ... 55 Figura 21. Curva analítica do estriol obtida no LC-MS/MS, modelo TSQ Quantum Access, da Thermo. ... 55 Figura 22. Curva analítica da estrona obtida no LC-MS/MS, modelo TSQ Quantum
Access, da Thermo. ... 56 Figura 23. Curva analítica do estradiol obtida no LC-MS/MS, modelo TSQ Quantum Access, da Thermo. ... 56
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estruturas químicas dos Desreguladores Endócrinos 17β-estradiol, estrona,
estriol e 17α-etinilestradiol. ... 7
Tabela 2. Propriedades Físico-Químicas dos estrógenos E1 e E2. ... 8
Tabela 3. Propriedades Físico-Químicas dos estrógenos E3 e EE2. ... 9
Tabela 4. Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humano. ... 10
Tabela 5. Vantagens e desvantagens da desinfecção pelo processo de ozonização. ... 29
Tabela 6. Potenciais de oxidação dos agentes oxidantes mais comumente empregados. 30 Tabela 7. Degradação de estrogênios por ozonização. ... 32
Tabela 8. Gradiente de eluição utilizado no cromatógrafo Waters e Agilent ... 37
Tabela 9. Gradiente de eluição empregado no cromatógrafo Thermo ... 37
Tabela 10. Fragmentos da ionização, energia de colisão, fornecedor, pureza, íon precursor e massa molar dos compostos analisados. ... 38
Tabela 11. Dados de vazão de produção de ozônio, com o sistema piloto da SANASA, com a respectiva concentração. ... 43
Tabela 12. Concentrações dos padrões analíticos dos hormônios utilizados nos testes de degradação. ... 45
Tabela 13. Resultados obtidos na preparação de curvas padrões de respostas para interferentes endócrinos no sistema CLAE-MS. ... 47
Tabela 14. Valores utilizados no espectrômetro de massas Triple QuadAgilent para os íons precursores dos DE, os fragmentos e as energias de colisão, aplicando -se a polaridade negativa. ... 50
Tabela 15. Dosagens de produtos aplicados na água bruta, utilizada nos ensaios de degradação dos DE e as propriedades físico-químicas medidas para as amostras de águas bruta utilizadas nos ensaios ... 57
Tabela 16. Resultados obtidos nas análises de carbono orgânico total (TOC) para as amostras que foram realizados os ensaios de degradação em escala piloto. ... 58
Tabela 17. Resultados obtidos após ensaios de degradação para as análises dos DE, via LC-MS/MS modelo TSQ Quantum Access, da Thermo. ... 59
Tabela 18. Eficiências de degradações dos DE, variando-se as estratégia de Pré/Pós oxidação. ... 60
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1. INTRODUÇÃO
A oferta de saneamento básico é fundamental em termos de qualidade de vida, pois sua ausência acarreta poluição dos recursos hídricos, trazendo prejuízo à saúde da população. Segundo a Pesquisa Nacional de Saneamento - PNSB 2008(IBGE, 2010), apenas 28,5% dos municípios brasileiros possuem Estações de Tratamento de Esgotos (ETE) convencionais, o que impacta negativamente na qualidade dos recursos hídricos no Brasil. Estes por sua vez são mananciais importantes para o desenvolvimento sócio-econômico da população e são fontes de captação de água bruta para as Estações de Tratamento de Água (ETA), que são responsáveis pelo abastecimento público.
Pesquisas recentes (LARCHER et al., 2012, BOLONG et al., 2009, HARTMANN et al., 2014) têm revelado que os sistemas de tratamento convencionais de esgotos e de água para abastecimento público não possuem eficiências adequadas para remoção de compostos orgânicos classificados como desreguladores endócrinos (DE), que são substâncias que podem provocar alterações no sistema endócrino de animais e de humanos (BILA e DEZOTTI, 2007). Estes DE constituem uma classe de substâncias não definidas pela sua natureza química, mas pelo seu efeito biológico, que pode causar distúrbios no sistema endócrino mesmo em baixas concentrações (ng L-1). Neste sentido, têm sido publicados trabalhos com desenvolvimento de metodologias analíticas aplicando extração em fase sólida (EFS), juntamente com a técnica de Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas (CL/EM) (TRINH et al., 2011; LAFLEUR e SCHUG, 2011).
Visando aumentar a eficiência de remoção destes compostos DE, tem sido aplicada a técnica avançada de tratamento com ozonização (PEREIRA et al., 2011; LARCHER et al., 2012), cabe ressaltar que estes trabalhos revelaram subprodutos de degradação.
A legislação que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade foi revisada [Portaria MS Nº 2.914(BRASIL, 2011)], sendo que apesar de terem sido
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discutidas as ocorrências de compostos denominados desreguladores endócrinos (DE) em águas superficiais e tratadas, tendo sido destacados os estrógenos naturais 17 β-estradiol (E2), estriol (E3), estrona (E1) e o sintético 17 -etinilestradiol (EE2), a portaria de potabilidade vigente não contempla estes parâmetros, porém, a crescente preocupação e os estudos recentes sobre estes compostos têm por objetivo a ampliação dos conhecimentos sobre os efeitos e as concentrações quantificadas destes DE nos corpos hídricos, permitindo subsidiar as revisões futuras das legislações ambientais, contemplando possivelmente estes compostos. Adicionalmente, os estudos sobre eficiências de tecnologias
avançadas de remoção destes compostos são importantes para o
desenvolvimento dos novos projetos ou adequações de ETA e ETE.
Tendo em vista a crescente preocupação dedicada aos DE, inclusive com trabalho publicado por SODRE et al.( 2010) sobre a ocorrência de estrona em duas amostras de água in natura coletadas no rio Atibaia (0,07 mg L-1) e
17β-estradiol (0,10 μg L−1
) em apenas uma vez, o presente trabalho teve como objetivos a adaptação e validação de metodologia analítica que fosse adequada para as análises destes hormônios em águas bruta e tratada, utilizando a extração em fase sólida e a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a espectrometria de massas em tandem (EFS-CL-EM/MS), bem como a aplicação das tecnologias de ozonização e cloroamoniação, em escala piloto, com a quantificação das dosagens, tempos de contato e eficiências de degradação dos quatro DE (E1, E2, E3, EE2), na água bruta do rio Atibaia, manancial que abastece a cidade de Campinas. Este trabalho apoiará o futuro monitoramento destes compostos na bacia do rio Atibaia por parte da empresa SANASA.
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2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivos:
(1) Adaptação e validação de metodologia analítica para identificar e quantificar simultaneamente os hormônios naturais estrona (E1), 17 β-estradiol (E2), estriol (E3), e o sintético 17 -etinilestradiol (EE2), nas águas bruta(in natura, do Rio Atibaia, manancial que abastece o município de Campinas) e tratada conforme as condições aplicadas na ETA 3,4 da empresa SANASA, utilizando a técnica de extração em fase sólida, juntamente com a técnica de Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (EFS-CL-EM/MS),
(2) Aplicação de tecnologias de degradação destes hormônios E1, E2, E3, EE2 em escala piloto, pelos processos de ozonização e cloroamoniação, visando contribuir com a determinação das dosagens, tempos de contato e eficiências de remoção.
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3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Desreguladores Endócrinos (DE)
A agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (“United States Environmental Protection Agency”) (USEPA, 1999) define um Desregulador Endócrino (DE) como um “agente exógeno que interfere com síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo que são
responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou
comportamento dos organismos”.
De acordo com Preziosi (1998), os DE podem ser produtos naturais de animal, de vegetal, como fitoestrógenos produzidos pela própria planta, ser compostos químicos sintéticos, em sua grande maioria organoclorados, com os mais variados usos industriais, comercias e domésticos, desta forma, a exposição aos DE pode ocorrer a partir de uma variedade de fontes, de forma voluntária ou não, inclusive por meio da dieta diária e do consumo de água potável.
Vários trabalhos têm apontado a presença de DE em amostras de águas superficiais, principalmente em função da atividade antrópica (ALDA e BARCELÓ, 2001; LAFLEUR e SCHUG, 2011).
A atividade estrogênica tem sido persistente em ambientes aquáticos, principalmente devido à disposição inadequada de esgoto sanitário e industrial, bem como o uso do lodo ativado de ETE na agricultura (REIS FILHO et al., 2006; BOYD et al., 2003; VULLIET e CREN-OLIVÉ, 2011, ARIS et al., 2014).
Uma série destes DE são solúveis em gorduras, tornando-se assim fácil a sua presença em carne, peixe, ovos e derivados do leite. A contaminação pode vir do fato de que alguns hormônios são aplicados na criação de animais e, consequentemente, ingeridos por humanos na sua alimentação, no entanto, na maioria dos países essa prática está proibida (PETERSON et al., 2000).
Os estrogênios apresentam em sua estrutura um grupo fenólico e em alguns casos um grupo hidroxila alifático, enquanto que nos progestagênios este grupo fenólico é substituído por um grupo cetona. Como estes são os principais
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responsáveis pelo crescimento e pela reprodução de espécies animais, incluindo os seres humanos, seus derivados sintéticos são bastante empregados como contraceptivos (hormônios inibidores do processo de ovulação), ao passo que os estrogênios são também administrados no controle dos sintomas que envolvem a menopausa, distúrbios fisiológicos e no tratamento do câncer de próstata e de mama. Já os progestagênios são empregados nos tratamentos voltados para as causas de infertilidade e descontrole do ciclo menstrual, em geral, são rapidamente absorvidos pelo organismo e, então, metabolizados no fígado (GHISELLI e JARDIM, 2007).
3.1.1. Estrógenos naturais e sintéticos
Os estrogênios naturais fazem parte de um grupo de vários hormônios esteróides lipofílicos produzidos, principalmente nos ovários e nos testículos em humanos e em outros vertebrados, originários do colesterol ou acetil coenzima-A (TAPIERO et al., 2002).
Os hormônios esteróides são produzidos nas glândulas endócrinas e são excretados diretamente na corrente sanguínea, estimulando ou inibindo a atividade metabólica em outros tecidos ou órgãos. Os hormônios sexuais, que controlam a maturação e a reprodução, podem ser classificados em três grupos principais: (1) os hormônios sexuais femininos, tais como, estrogênios e progesteronas, (2) os hormônios sexuais masculinos, como, androgênios e (3) corticosteróides, que são divididos em glicocorticóides e mineralocorticóides (BILA, 2005).
Nos homens os hormônios predominantes são os androgênios e nas mulheres, os estrogênios. Os androgênios são uma classe de hormônios sexuais, produzidos pelas glândulas adrenais e testículos, incluem o androsterona e testosterona, sendo responsáveis pelo desenvolvimento das características secundárias masculinas, tais como voz grave e barba. Os estrogênios são definidos como uma família de hormônios esteróides responsáveis pelo desenvolvimento das características secundárias femininas e funções de reprodução (RAIMUNDO, 2007).
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Quimicamente, os hormônios são proteínas derivadas de aminoácidos ou esteróides. Segundo a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), os esteróides compreendem uma classe de hormônios cuja estrutura básica é formada pelo ciclo[a]fenantreno (Figura 1). Nessa estrutura podem existir ligações duplas, metilas, carbonilas e hidroxilas, dando origem a uma série de hormônios esteroidais.
Figura 1. Estrutura básica dos esteróides.
Os compostos interferentes endócrinos podem agir no sistema endócrino de diversas maneiras, eles podem imitar um hormônio natural e dessa forma se ajustarem aos sítios receptores enviando mensagens aos genes que respondem a elas gerando uma reação de atividades em cadeia, alterando as funções biológicas do organismo; alguns compostos são capazes de incentivar a produção de hormônios e outros podem agir bloqueando a produção deles ao ocuparem os sítios receptores; os interferentes endócrinos podem ainda estimular a excreção dos hormônios deixando o organismo defasado ou causando a constante produção do hormônio eliminado a fim de repor aquele excretado; outro mecanismo de ação é por meio da inativação das enzimas responsáveis pela decomposição dos hormônios para excreção, o que gera um acúmulo deles no organismo e este por sua vez, responde a uma atividade que já deveria ter sido cessada; e por fim, esses compostos podem agir destruindo ou modificando a estrutura de um hormônio natural, impedindo dessa forma que eles se liguem aos sítios receptores no organismo (BIRKETT e LESTER, 2003).
Os estrogênios sintéticos, encontrados em produtos farmacêuticos, são estrogênios que tiveram suas estruturas moleculares alteradas. Eles têm a tendência de serem mais potentes do que os estrogênios do corpo e consequentemente, mais ativos. Hormônios naturais, como 17β-estradiol e progesterona não são adequados para aplicações orais, exceto se forem ingeridos
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em altas concentrações, pois estes são facilmente metabolizados e excretados pelo organismo. Esteróides sintéticos atuam no sistema endócrino e alteram a atividade fisiológica mesmo em baixas concentrações. O estrogênio sintético mais consumido é o 17-etinilestradiol (EE2) utilizado como contraceptivos (RAIMUNDO, 2007).
3.1.2. Propriedades Físico-Químicas dos DE
Na Tabela 1 são apresentadas algumas estruturas dos estrogênios naturais e sintéticos.
Tabela 1. Estruturas químicas dos desreguladores endócrinos 17β-estradiol,
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Nas Tabelas 2 e 3 são apresentadas as principais propriedades físico-químicas dos estrogênios naturais estrona (E1), estriol (E3) e 17β-estradiol(E2)) e do estrogênio sintético 17-etinilestradiol (EE2), obtidas segundo (FENG et al. (2005), YING et al. (2002), LAI et al. (2000)).
Tabela 2. Propriedades Físico-Químicas dos estrógenos E1 e E2.
Parâmetro Estrona (E1) 17β-estradiol (E2) Nome 1,3,5(10)- estratriene-3-ol-17-one 1,3,5(10)- estratriene-3,17β- diol Numero CAS 53-16-7 50-28-2 Formula Molecular C18H22O2 C18H24O2 Massa Molar (g mol-1) 270,4 272,4 Ponto de Ebulição (oC) 258-260 178-179 Massa Específica (20oC) 1,164 1,170 Solubilidade (mg L-1) (a 20°C) 12,42 12,96 Pressão de Vapor (mm Hg) 2,3. 10 -10 2,3. 10-10 logKow (coeficiente de
partição octanol- água) 3,4 3,1 Koc (coeficiente de
sorção) 4882 3300
Meia-Vida (dias) 2 - 3 2 - 3 Fonte: FENG et al. (2005), YING et al. (2002), LAI et al. (2000).
O conhecimento das propriedades físico-químicas destes compostos auxilia na escolha do processo mais adequado para a degradação.
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Tabela 3. Propriedades Físico-Químicas dos estrógenos E3 e EE2.
Parâmetro Estriol (E3) 17α-etinilestradiol (EE2)
Nome 1,3,5(10)- estratriene-3,16α, 17 β-triol 17α-etinil-1,3,5(10)- estratriene-3,17β-diol Numero CAS 50-27-1 57-63-6 Formula Molecular C18H24O3 C20H24O2
Massa Molar (g mol-1) 288,4 296,4
Ponto de Ebulição (oC) 280-282 182-183 Massa Específica (20oC) 1,255 1,210 Solubilidade (mg l-1) (a 20°C) 13,25 4,83 Pressão de Vapor (mm Hg) 6,7.10 -15 4,5.10-11 logKow (coeficiente de
partição octanol- água) 2,5 3,9 Koc (coeficiente de
sorção) 1944 4770
Meia-Vida (dias) Não relatado 4 - 6 Fonte: FENG et al. (2005), YING et al. (2002), LAI et al. (2000).
Pesquisas de Johnson et al. (2000) estimaram as quantidades diárias excretadas por humanos dos estrógenos naturais 17β-estradiol, estrona, estriol e a quantidade de 17-etinilestradiol (Tabela 4).
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Tabela 4. Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humano.
Categoria Estrona 17β-Estradiol Estriol 17 α-etinilestradiol
Homens 3,9 1,6 1,5 - Mulheres menstruando 8 3,5 4,8 - Mulheres na menopausa 4 2,3 1 - Mulheres grávidas 600 259 6000 - Mulheres que tomam contraceptivo - - - 35
Fonte: JOHNSON et al. (2000).
3.1.3. Efeitos Causados Pela Exposição ao Desreguladores Endócrinos
Vários estudos têm apontado resultados com baixas concentrações destes compostos, da ordem de ng L-1, mas estas concentrações são significativas para disruptores endócrinos. Peixes machos expostos a pequenos níveis, de nanogramas por litro desses estrógenos deram respostas estrogênicas como produção de vitelogenina (VTG, é uma lipoproteína que, em circunstâncias normais, somente é detectável no plasma sanguíneo de peixes fêmeas adultos), mudança de sexo e presença de oócisto (NOPPE , 2004).
Trabalhos encontrados na literatura mostram que uma concentração de 0,1 ng L-1 de 17α-etinilestradiol induz a expressão da vitelogenina em peixes (PURDOM et al., 1994), que a faixa de concentração de 0,1 a 15 ng L-1 pode afetar a diferenciação sexual e que a faixa de concentração de 2 a 10 ng L-1 pode afetar negativamente a fecundidade. Uma longa exposição a uma concentração de 5 ng L-1 leva a uma redução significativa na fecundidade dos descendentes (NASH et al., 2004). Dessa forma, a concentração de 17-etinilestradiol
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encontrada no meio ambiente (entre 0,5 e 7 ng L-1, BILA e DEZOTTI, 2003) representa uma significante contribuição para a disfunção no sistema reprodutivo de peixes (FENT et al., 2006).
Estudos in vivo mostraram que a exposição de peixes a concentrações de 1 a 10 ng L-1 de 17β-estradiol e 0,1 ng L-1 de etinilestradiol provocaram feminização de algumas espécies de peixes (ROUTLEDGE, 1998). As fêmeas do peixe Japanese medaka apresentaram menor fecundidade quando expostas a 17β-estradiol. Os estrogênios não induzem efeitos adversos somente em animais, mas também interferem no crescimento e desenvolvimento de plantas (LAI et al., 2002).
A ocorrência de desreguladores endócrinos no ambiente, sua persistência e os danos que podem causar, têm contribuído para aumentar a consciência de que os animais, inclusive o Homo sapiens, podem ser adversamente atingidos por diversas patogenias, desordens do trato reprodutivo, redução do número de espermatozóides e redução da fertilidade e, até mesmo, cânceres (SNYDER et al., 2001), assim como no sistema imunológico (AHMED, 2000).
Vários grupos de pesquisas acreditam que grande parte da população masculina de seres humanos sofre com o decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas, e que isso parece estar relacionado à presença de estradióis nas águas (AUGER, 1995; DAMSTRA et al., 2002).
O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do balanço e das concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos), portanto, uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais como, irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade e ovários policísticos. Alguns fatos demonstram que isso pode realmente ter ocorrido, como o uso de dietilestilbestrol (DES) em mulheres grávidas na década de 70 (DAMSTRA et al.,2002).
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3.2. Determinação de Desreguladores Endócrinos (DE)
Os baixos níveis de contaminação e a complexidade das matrizes ambientais exigem o uso de métodos com alta detectabilidade e seletividade para a análise de resíduos de estrógenos (WANG et al., 2008; VIGLINO et al., 2008; LAFLEUR e SCHUG, 2011).
Nos últimos anos, várias técnicas têm sido desenvolvidas para analisar substâncias estrogênicas naturais e sintéticas em matriz aquosa. A Cromatografia Gasosa ou a Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas são as mais utilizadas e propostas para monitoramento desses estrogênios em água. Ambas técnicas têm permitido quantificar níveis de traços (concentração da ordem de ng L-1), entretanto, observa-se que o limite de detecção da cromatografia líquida é menor do que a gasosa.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica analítica e, dependendo do detector empregado, pode quantificar massas de componentes de 10-9 g a 10-12 g (CIOLA, 2000, JARDIM et al., 2006, LANÇAS, 2009).
A presença desses micropoluentes em outros tipos de amostras ambientais, como, lodo biológico e sedimentos, dita a necessidade do desenvolvimento de técnicas que muitas vezes necessitam de etapas de extração com solvente, purificação (normalmente com sílica gel), cromatografia de permeação em gel e/ou EFS dos componentes antes de serem analisados por técnicas cromatográficas como CG-EM, CG-EM/EM ou CL-EM e CL-MS/MS(JOHNSON et al., 2000; MOL et al., 2000).
Alguns estudos (BILA e DEZOTTI, 2007; FERRERO-DIAZ et al., 1997; TYLER et al.,1999) também relatam o uso de técnicas biológicas na identificação e quantificação de estrogênios naturais e sintéticos, como ensaios de imuno adsorção enzimática (ELISA) e radio imunoensaio (RIA). O ensaio ELISA, que é baseado no uso de antígenos, tem sido descrito como um método altamente sensível e seletivo para análise de estrogênio e outros disruptores endócrinos em ambientes aquáticos. O ensaio ELISA é usado em conjunto com técnicas de extração, como EFS, para aumentar seu limite de detecção. Recentemente, estão
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sendo desenvolvidos outros métodos analíticos baseados em imuno ensaios para monitorar estrogênios e agrotóxicos em amostras de água, tal como um bio-sensor óptico.
Na maioria dos casos, a quantificação dos desreguladores endócrinos nas concentrações ambientais é normalmente feita com espectrômetros de massa, dada à sua elevada especificidade. Outros métodos de análise baseados em técnicas enzimáticas ou bioensaios também têm sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do método tem favorecido o uso das técnicas cromatográficas na análise de perturbadores endócrinos (FARRÉ et al., 2007).
Basicamente, a determinação dos DE em amostras aquosas envolve três etapas: amostragem, preparo de amostra e análise. Para a determinação de perturbadores endócrinos é necessário usar critérios analíticos rigorosos para que as várias etapas, como amostragem, transporte, estocagem e análise, tenham o menor erro possível, tendo em vista a baixa quantidade dos DE (µg L-1 a ng L-1) nas amostras ambientais (LIU et al., 2004). Na Figura 2 é mostrado um diagrama simplificado do protocolo de análise dos DE.
A extração em fase sólida (EFS) seguida da determinação via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas CG-EM ou cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (CL-EM/EM) são métodos muito utilizados devido a detectabilidade e seletividade conseguidas. O detector de massas/massas (EM/EM) é mais seletivo e de melhor detectabilidade, devido a gerar um sinal com menor ruído (CHEN et al., 2007; VIGLINO et al., 2008).
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Figura 2. Diagrama esquemático para preparação e análise dos disruptores
endócrinos.
3.2.1. Amostragem e preservação
A primeira etapa da análise é a amostragem, e a qualidade do processo de amostragem e preparação das análises é um fator determinante para um resultado correto (MOZAZ et al., 2007). Como os DE em amostras de água podem degradar biologicamente durante o transporte e estocagem, é comum adicionar alguns biocidas, como o formaldeído ou metanol, bem como manter as amostras em baixa temperatura (4 ºC) até o procedimento de extração e concentração. O tempo máximo recomendado entre a coleta e a extração é de 48 horas (FOUNTOULAKIS et al., 2005; WANG et al., 2005), sendo a coleta feita em frascos de cor escura, uma vez que alguns estrogênios, como estradiol, podem ser foto-degradados (JEANNOT et al., 2002; WANG et al., 2005).
A quantidade de água coletada pode variar de acordo com as propriedades intrínsecas da água analisada, tipo de composto, método de extração e aparelho utilizado para quantificação. Aparelhos com detectabilidade elevada, águas com nível alto de poluição e alguns métodos de extração como a microextração por
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fase sólida (em inglês solid phase micro extration(SPME)) geralmente necessitam de pouca quantidade de amostra (YANG et al., 2006), contudo, para a maioria dos casos é necessária uma quantidade maior de água, que normalmente varia de 250 a 1000 mL (JEANNOT et al., 2002; WANG et al., 2005). Como exemplo, Lagana et al. (2004) fizeram análise de perturbadores endócrinos em diferentes matrizes, e o volume de amostra variou de 110 mL para esgoto bruto a 1000 mL para água de rio.
3.2.2. Filtração
Após coletada a amostra, a primeira etapa de preparação consiste na sua filtração. A filtração tem a finalidade de retirar os sólidos presentes na água, evitando assim o comprometimento (entupimento e queda na taxa de filtração) da etapa posterior de concentração em cartuchos de extração em fase sólida. Embora a maioria das membranas utilizadas e citadas na literatura seja de acetato de celulose, recomenda-se a utilização de membranas de materiais mais inertes (teflon, fibra de vidro, nylon) para evitar a adsorção de DE durante a etapa de filtração. As membranas mais utilizadas na filtração são de 0,45 µm. Etapas preliminares de filtração, como a utilização de filtros de 8 µm, podem ser necessárias dependendo da quantidade de sólidos presentes na água. Isso é particularmente importante durante a amostragem de água de mananciais superficiais durante períodos chuvosos (MOREIRA, 2008).
3.2.3. Ajuste de pH
O ajuste do pH da amostra é feito com a finalidade de aumentar a afinidade dos DE, principalmente aqueles de caráter ácido como nonilfenol, bisfenol e estrona, pela fase estacionária do cartucho de extração, aumentando assim a sua extração da fase aquosa (RAIMUNDO, 2007). De fato, Liu et al (2004) fizeram um trabalho para avaliar a influência do pH inicial da amostra na eficiência de
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extração, e os resultados obtidos mostraram que a melhor recuperação obtida foi àquela feita em meio mais ácido. À medida que o pH era diminuído, o índice de recuperação aumentava, chegando a 100% para alguns compostos no pH igual a 3. O pH escolhido para as amostras pode variar de acordo com a capacidade máxima que o cartucho de extração suporta, mas a maioria dos trabalhos utilizam o pH variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (GIBSON et al., 2007; WANG et al., 2005). Os ácidos mais utilizados para a correção do pH são o clorídrico (HCl) ou o sulfúrico (H2SO4).
3.2.4. Extração e Pré-Concentração dos DE
Hoje em dia a extração em fase sólida (EFS) é um dos métodos mais poderosos e mais empregados para extração e/ou pré-concentração de analitos presentes em matrizes complexas, permitindo que concentrações muito baixas sejam detectadas. Esta técnica é mais avançada quando comparada com a extração líquido-líquido, principalmente com relação a redução da quantidade de solvente da amostra envolvida em cada extração, e envolve menor risco de erros operacionais. Além disso, muitos analitos polares, como, produtos de degradação de micropoluentes orgânicos não podem ser extraídos. Uma consequência disso é que EFS tem sido utilizada cada vez mais, inclusive em métodos oficiais, como os recomendados pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA, 1997).
A extração em fase sólida é usualmente empregada com o propósito de isolar um ou mais analitos (substâncias desejadas) presentes em matriz complexa. O formato mais popular em EFS é o cartucho. Uma seringa plástica (usualmente de polipropileno) é empregada, dentro da qual o material de empacotamento (sorbente) fica retido entre dois filtros de polietileno; a parte inferior do cartucho é afunilada e apresenta uma extensão que se encaixa em um dispositivo para efetuar vácuo.
Os materiais utilizados como sorbente em EFS são similares àqueles empregados em cromatografia líquida. Assim, materiais como sílica gel, alumina,
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silicato de magnésio (florisil), carvão ativado, polímeros e fases baseadas em sílica quimicamente ligada como C18, por exemplo, (LANÇAS, 2004; CIOLA, 2000) são amplamente empregadas. A escolha da fase sólida apropriada depende da natureza do analito de interesse e da matriz na qual ele se encontra.
Atualmente, a EFS é amplamente empregada em todo mundo, sendo utilizada principalmente na preparação de amostras para análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e Cromatografia Gasosa. A maioria das aplicações utilizando EFS está na determinação de traços de contaminantes orgânicos em água, análise de efluentes, amostragem de poluentes em águas residuárias (BARONTI et al., 2000; MOL et al., 2000). A ampla gama de aplicações da EFS é possível devido à diversidade e versatilidade dos materiais contidos nos dispositivos de extração, permitindo diferentes modos de operação e diversos mecanismos de separação. Como limitações para a EFS tem-se o custo de dispositivos comerciais (manifolds), o custo dos dispositivos de extração (cartuchos), a impossibilidade de reaproveitamento dos cartuchos quando aplicados a matrizes complexas.
Em geral, os procedimentos para EFS envolvem de 3 a 4 etapas:
1-Ativação do sorvente (fase sólida do cartucho) para deixar os sítios ativos disponíveis e condicionamento do cartucho com solvente adequado (o mesmo que será utilizado para fazer eluição), para ajustar as forças do solvente de eluição com o sorvente;
2-Introdução da amostra, em que ocorre a retenção do analito e, às vezes, de alguns interferentes;
3-Limpeza do cartucho (lavagem com outro solvente), para retirar os interferentes menos retidos que o analito (quando necessário);
4- Eluição e coleta do analito. Na Figura 3 é mostrada esta sequência de etapas de extração.
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Figura 3. Esquema das etapas do procedimento da extração em fase sólida.
Fonte: (LANÇAS, 2004), (CHROMABOND, 2015).
3.2.5. Eluição
A eluição do cartucho, ou seja, a dessorção dos compostos de interesse vai depender do tipo de composto a ser analisado. Trabalhos publicados utilizam geralmente metanol, acetato de etila e acetona, puros ou misturados, como agentes de eluição (ALDA e BARCELÓ, 2001); GIBSON et al., 2007; LAGANÀ et al., 2004; WANG et al., 2005). É importante destacar que a eluição é normalmente feita com um volume maior de solvente (5 a 15 mL) para assegurar a completa dessorção dos analitos de interesse.
3.2.6. Secagem
Para se obter um elevado grau de concentração é preciso secar o extrato orgânico e ressolubilizar o analito em volume adequado de solvente. Além de obter o grau de concentração adequado, a secagem permite ainda adequar o solvente ao método de análise tendo em vista que o solvente utilizado na eluição pode ser incompatível com o equipamento cromatográfico. Um exemplo é o diclorometano, que não é recomendado para análises em cromatografia líquida
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devido a sua alta volatilidade, mas que foi utilizado junto com o metanol em solução 1:1 por Laganà et al. (2004), para a eluição de fitoestrogênios, micoestrogênios, estrogênios e alquilfenóis.
A secagem dos extratos orgânicos é normalmente feita em banho-maria à temperatura pouco maior que a ambiente. Além disso, é comum utilizar fluxo de nitrogênio sobre os extratos orgânicos para acelerar o processo de secagem.
3.2.7. Ressuspensão do extrato seco com solvente adequado
A ressuspensão do extrato seco é feita com o solvente mais apropriado para análise cromatográfica. Para a cromatografia líquida geralmente utiliza-se acetonitrila ou metanol como solventes de reconstituição, ao passo que para cromatografia gasosa é comum o uso de solventes mais voláteis como acetona ou acetato de etila (JEANNOT et al., 2002).
3.2.8. Análise
A cromatografia líquida tem várias vantagens para análise de compostos orgânicos em água, e uma delas refere-se ao fato de os compostos voláteis serem apenas uma pequena fração de poluentes usualmente presentes em água e esgotos. De fato, a maior parte dos perturbadores endócrinos não é volátil, tornando a cromatografia líquida a técnica mais adequada para sua análise. Isto é especialmente verdade para esgotos, os quais contêm muito material húmico e compostos orgânicos polares, como os carboidratos. Vários detectores podem ser acoplados à cromatografia líquida, como, por arranjo de diodos, fluorescência e espectrômetro de massas (ALDA e BARCELÓ, 2001; MAO et al., 2004; MATSUMOTO et al., 2002; RAIMUNDO, 2007; WANG et al., 2008, PÉREZ et al., 2014).
A detecção de disruptores endócrinos por espectrometria de massas (EM) tem sido a técnica preferida pela comunidade científica devido à sua elevada
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detectabilidade, reprodutibilidade, abrangência e robustez. A instrumentação atualmente disponível combina a diminuição dos limites de detecção e excelente reprodutibilidade analítica e elevada seletividade seja no modo de varredura (modo Full-SCAN), ou através do monitoramento de íons selecionado (modo SIR) (HU et al., 2005; LIU et al., 2004; HENRIQUES et al.,2010).
O espectrômetro de massas é um instrumento sofisticado e é constituído basicamente das seguintes partes: introdução da amostra, fonte de ionização, muitas vezes denominada interface, analisador de massas (ou filtro de massas), detecção de íons e aquisição de dados através de processamento de dados (QUEIROZ, 2001).
3.2.8.1. Validação de métodos cromatográficos
Os parâmetros de desempenho analítico geralmente utilizados para validação de métodos de separação, como os métodos cromatográficos, são, de acordo com Ribani et al. (2004), os seguintes:
seletividade: capacidade de avaliar a substância de interesse em amostras complexas com componentes que podem interferir na determinação.
linearidade e faixa de aplicação: capacidade de fornecer resultados proporcionais à concentração da substância de interesse dentro de uma faixa de aplicação, que compreende os valores máximos e mínimos da substância de interesse que atenda os requisitos de precisão e exatidão.
precisão: dispersão dos resultados de ensaios repetidos de uma amostra.
exatidão: grau de concordância entre os resultados de um ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. Pode ser verificada pelo fator de recuperação (R) que é a proporção da quantidade do analito adicionada na amostra em concentração conhecida (fortificação).
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limite de detecção: é a menor concentração da substância que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada.
limite de quantificação: é a menor concentração da substância que pode ser medida por um procedimento experimental.
robustez: mede a sensibilidade do método frente a pequenas modificações (INMETRO, 2007).
Os procedimentos de validação de métodos analíticos são fundamentados em atender as diretrizes da ISO 17025 e da EURACHEM/CITAC, as quais estabelecem requisitos gerenciais e técnicos para implementação de sistemas de gestão de qualidade em laboratórios de análises.
3.3. Ozonização
O físico holandês van Marum descobriu o ozônio em 1785 (KINMAM, 1972) e foi batizado pelo químico suíço Christian Friedrich Schönbein em 1840 (PONTIUS, 1990). A palavra “ozônio” origina-se do grego “ozein” que significa “cheiro”, em função do seu cheiro característico. Em 1845 de la Rive e Marignac obtiveram ozônio submetendo a passagem de um arco elétrico em ambiente de oxigênio puro (TAMURA e IWAKURA, 1982). Posteriormente, investigações realizadas por Hunt sobre as propriedades oxidantes do ozônio permitiram ao autor postular que a molécula do ozônio é constituída por três átomos de oxigênio (SILVA et al., 2003).
O ozônio é um gás incolor a temperatura ambiente com fórmula molecular O3
(numero CAS [10028-15-6]) e massa molar de 48 g mol-1, seu ponto de ebulição a 1 atm é de -111,9 ºC, temperatura crítica Tc -12 ºC. É um forte agente oxidante, atacando praticamente todos os compostos orgânicos, sendo sua ação muito rápida. Em altas concentrações é um gás tóxico, sofre decomposição rápida em altas temperaturas e tem um odor peculiar similar ao do cloro. É instável em água, possuindo uma meia-vida de minutos, devendo, portanto, ser produzido in-situ (no local e no momento a ser consumido) (AZEVEDO, 2003; HARRISON, 2000; EVANS, 1972).
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O ozônio é gás instável de alto poder oxidante. Essas duas características o tornam atrativo para desinfecção de esgotos sanitário. A instabilidade desse gás é algo desejável porque quando o efluente é lançado no meio ambiente não haverá residual do oxidante que possa ser danoso à biótica aquática. O alto poder oxidante é desejável porque diminui as concentrações aplicadas e o tempo necessário para a desinfecção (SILVA, 2008).
Os primeiros experimentos sobre desinfecção com ozônio foram realizados na França por De Meritens em 1886 (CAMEL & BERMOND, 1998). Em 1893 e em 1900 passou a ser utilizado para tratamento de águas de abastecimento na Holanda (USEPA, 1986) e na França (METCALF & EDDY, 2002), respectivamente. Seu uso se espalhou pela Europa Ocidental, bem antes de atingir a América do Norte.
A primeira unidade de ozonização para desinfecção de água de abastecimento foi implantada em Nice na França, em 1906.
O ozônio é usado para o tratamento de água potável e para os seguintes propósitos (RICE, 1981):
desintoxicação de efluentes e melhoria da biodegradabilidade;
desinfecção bacteriana, desodorização, descoloração;
inativação de vírus;
oxidação de ferro e/ou manganês;
remoção de cor (Oxidação) e algas;
oxidação de compostos orgânicos;
oxidação de Inorgânicos como Sulfeto, Cianeto e Nitrato;
turbidez.
3.3.1. Geração de Ozônio
O fato do ozônio ser altamente instável requer sua produção no local de consumo, e por ser altamente tóxico quando presente na fase gasosa, cuidados especiais são necessários na concepção de sistemas de ozonização, o ozônio não
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pode ser armazenado ou transportado como outros gases, uma vez que, quando acondicionado em recipientes, ele decai continuamente até que reste somente o oxigênio. Portanto, ele só pode ser produzido no local e no momento a ser consumido, a partir do oxigênio puro ou de misturas gasosas que contenham oxigênio, como o ar (DI BERNARDO e DANTAS, 2005).
As três técnicas de geração de ozônio mais importantes são: descarga elétrica, eletrólise e radiação química. A descarga elétrica e a eletrólise fornecem maiores concentrações de ozônio, sendo a descarga elétrica à técnica mais difundida por ser a única viável em larga escala, devido ao fato de se obter maior taxa de conversão do oxigênio em ozônio (BALAKRISHNAN et al., 2002; GOTTSCHA et al., 2002). A descarga elétrica ou processo corona baseia-se na aplicação de uma voltagem alternada entre dois eletrodos separados por um fluxo de oxigênio puro seco ou ar. O campo elétrico aplicado fornece energia suficiente aos elétrons para que estes rompam as duplas ligações da molécula de O2 para
formar as moléculas de O3 (SILVA, 2008).
O sistema de ozonização é dividido normalmente em quatro componentes básicos, a saber (FERGUSON et al., 1991):
sistemas de preparação e secagem do gás de alimentação que será utilizado na produção de ozônio, normalmente ar atmosférico;
equipamento gerador de ozônio e sistema de aplicação com placas difusoras, tubulações, etc.;
reatores de contato do ozônio gasoso com transferência para a fase líquida e
unidades auxiliares de destruição de ozônio residual na fase gasosa coletados por efluente do reator de contato.
De um modo geral, a frequência de alimentação do gerador de ozônio pode ser agrupada em três diferentes categorias, a saber (FERREIRA FILHO et al., 2005):
geradores de baixa frequência (50 ou 60 Hz);
geradores de média frequência (60 a 1000 Hz) e
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Os equipamentos de geração de ozônio com capacidade de trabalho em diferentes frequências permitem, uma vez mantida constante a vazão de gás de entrada, variar a concentração de ozônio produzido na fase gasosa e, consequentemente, também variar as dosagens de ozônio aplicadas na fase líquida.
O tratamento do gás residual de ozônio efluente dos reatores de contato é necessário devido à sua baixa solubilidade e incompleta transferência à fase líquida e a toxicidade a saúde dos técnicos que trabalham nas instalações.
3.3.2. Degradação de compostos orgânicos por ozonização
Invariavelmente, a utilização de agentes oxidantes gera subprodutos na sua aplicação. A formação desses subprodutos depende principalmente da dosagem aplicada e da concentração de seu residual; natureza da matéria orgânica presente no manancial e sua concentração (substâncias húmicas); presença de íon brometo; temperatura; concentração de nitrogênio orgânico e de nitrato; tempo de contato do agente e pH da mistura (DI BERNARDO e DANTAS, 2005).
Entre os subprodutos mais significativos formados quando da aplicação do ozônio no tratamento de águas de abastecimento estão: aldeídos, cetonas e bromato (JACANGELO et al., 1989).
Na Figura 4 pode-se observar o esquema genérico da formação de subprodutos quando da aplicação do ozônio como agente oxidante.
A aplicação de ozônio na degradação de desreguladores endócrinos também tem sido estudada (KIM et al., 2004; BROSÉUS et al., 2009, SARKAR et al., 2014), sendo que mais recentemente também foram estudados os subprodutos formados (PEREIRA, 2011, PEREIRA et al., 2011, LARCHER et al., 2012).
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Figura 4. Esquema genérico da formação de subprodutos da desinfecção quando
da aplicação do ozônio como agente oxidante (Fonte: FERREIRA FILHO, 2009).
O ozônio na água se decompõe rapidamente e espontaneamente por um mecanismo complexo, envolvendo a geração de radicais hidroxilas, que é considerado um agente poderoso de oxidação. Todavia, a meia vida dos radicais hidroxilas é da ordem de microssegundos. Na Figura 5 são apresentadas as duas rotas de oxidação de compostos durante o processo de ozonização (USEPA, 1999).
Figura 5. Rotas de Oxidação dos compostos durante o processo de Ozonização.
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A oxidação direta com ozônio molecular é relativamente lenta, por outro lado, a reação com os radicais hidroxilas é rápida, mas com concentração relativamente mais baixa em relação ao ozônio molecular. Os fatores que intervêm na eficiência do processo de desinfecção por ozônio estão associados às características físico-químicas da amostra, que intervêm sobre a sua concentração, especiação e grau de contato com os organismos alvo, ou às características de resistência biológica dos microrganismos ao ozônio. Pode ocorrer ainda uma combinação entre ambos os fatores (USEPA, 1999).
Segundo Langlais et al. (1991) as principais características físico-químicas que influem no processo de desinfecção por ozônio são as seguintes:
Turbidez: Os microrganismos, geralmente aparecem em meio aquático agregados a partículas sólidas de origem mineral ou orgânica que podem protegê-los do contato direto com o agente desinfetante. Pode ocorrer ainda que bactérias e vírus permaneçam protegidos do desinfetante por serem ingeridos por nematóides ou outros macro invertebrados (BITTON, 2005). A turbidez, no entanto, não é um bom parâmetro para avaliar a demanda de ozônio residual necessário para a desinfecção. O efeito de inibição está mais associado à composição das partículas do que ao seu tamanho ou concentração na fase líquida. Assim, partículas de natureza mineral, ou seja, de difícil oxidação, têm mostrado pouco efeito de inibição sobre a taxa de decaimento dos microrganismos, ao passo que partículas orgânicas, mesmo em baixas concentrações, têm sido bem mais efetivas em reduzir esta taxa. Experimentos realizados por Foster et al. (1980) demonstraram redução na taxa de decaimento por ação do ozônio para poliovirus 1, quando estes se encontraram associados a coliformes fecais em uma solução que possuía apenas 5 NTU de turbidez. Em outro experimento, a taxa de decaimento do poliovírus 1 não foi significativamente afetada, por uma solução de bentonita que tinha os mesmos 5 NTU de turbidez.
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COT: A quantidade de carbono orgânico total na fase líquida é um dos parâmetros mais importantes para a determinação da concentração de ozônio a ser aplicada, uma vez que a matéria orgânica provoca o consumo de oxidante que de outra forma estaria disponível para reagir com os microrganismos. A magnitude desse consumo é muito significativa. Por exemplo, a dose aplicada para a desinfecção em água filtrada em uma ETA convencional é cerca de duas vezes menor que a necessária para desinfetar esgotos tratados de uma ETE de lodos ativados por aeração prolongada (SILVA, 2008).
pH: A decomposição pode ser acelerada pela alteração do pH. A oxidação de compostos orgânicos durante a ozonização pode ocorrer via ozônio molecular (reação direta - predominante em meio ácido) ou radical hidroxila (reação indireta - predominante em meio básico). Em pH neutro, ambos oxidantes podem estar atuando. (ALMEIDA et al., 2004).
Temperatura: A taxa de decaimento dos microrganismos aumenta com o aumento da temperatura do líquido. De acordo com a teoria de van’t Hoff Arrehenius a temperatura determina em parte a taxa de difusão do desinfetante através das membranas do microrganismo e também sua taxa de reação com o substrato. Geralmente um acréscimo de 10 ºC aumenta por um fator de 2 ou 3 à taxa de reação com o substrato. No entanto, quando ocorre um aumento de temperatura, o ozônio torna-se menos solúvel e menos estável em água, embora a taxa de reação com o substrato orgânico dos microrganismos aumente. Segundo dados da USEPA (1989), ocorre um aumento da taxa de decaimento de cistos com o aumento da temperatura. Um grande número de experimentos tem mostrado que para uma faixa de temperatura compreendida entre 0 e 30 ºC o efeito da instabilidade do ozônio em água é amplamente compensado pelo aumento da sua reatividade com o substrato orgânico dos microrganismos (ROY, 1981).
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3.3.3.
Aplicações do Ozônio
A primeira aplicação do ozônio no tratamento de água foi em 1893, para tratamento de água da cidade de Oudshoorn, na Holanda. Em 1970, foi utilizado para tratamento de água de torres de resfriamento. Hoje, é aplicado em diversas atividades como no tratamento de água, no tratamento de efluente, para redução de lodo biológico, no controle de odor nas plantas de tratamento de esgoto, em indústrias no processamento de alimentos, entre outras (MAYES e RUISINGER, 1998; GLAZE, 1987).
No tratamento de água, o ozônio pode ser usado em várias etapas do processo com o objetivo de aumentar a biodegradabilidade, remover ferro e manganês, degradar micropoluentes e remover sabor e odor. É importantíssimo na desinfecção de água potável, pois é efetivo na remoção de bactérias e vírus (BALAKRISHNAN et al., 2002; PARASKEVA, 2002; HARRISON, 2000). Porém, como o seu tempo de meia vida é curto, há a necessidade do uso do cloro para distribuição da água.
O ozônio apresenta vantagens no tratamento de águas de abastecimento e residuárias, conforme apresentado na Tabela 5.
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Tabela 5. Vantagens e desvantagens da desinfecção pelo processo de
ozonização.
Vantagens Desvantagens
O ozônio é mais eficiente que o cloro, cloraminas e dióxido de cloro para inativação de vírus, Cryptosporidium e Giardia
Baixas dosagens de ozônio podem não ser efetivas na inativação de alguns vírus, esporos e cistos
Na ausência do bromo, substâncias halogenadas não são formadas, não existindo residuais prejudiciais que devam ser removidos depois da ozonização, devido a sua rápida decomposição
Não é econômico para águas residuárias com altos níveis de sólidos em suspensão, alta demanda bioquímica de oxigênio, alta demanda química de oxigênio, ou altos teores de carbono orgânico total
Na decomposição o único residual é o oxigênio dissolvido A geração de ozônio requer muita energia devendo ser gerado no local de uso
Depois da ozônização não existe o reaparecimento dos microrganismos, exceto para aqueles protegidos por partículas presentes na água residuária
O ozônio é altamente corrosivo e reativo, portanto requer materiais resistentes à corrosão, tais como: aço inoxidável
Por ser gerado no local, existem poucos problemas associados à segurança do transporte e manuseio
O ozônio é extremamente irritante e possivelmente tóxico, portanto o gás não utilizado deve ser destruído para prevenir a exposição dos trabalhadores
Eleva a concentração de oxigênio dissolvido no efluente, podendo assim eliminar a necessidade de reaeração e também a necessidade de se elevar à concentração de oxigênio dissolvido no corpo receptor
Tecnologia mais complexa de desinfecção quando comparada ao cloro e a radiação ultravioleta, requerendo complicados equipamentos e eficientes sistemas de contato
Tratamento de água com ozônio não conduz a uma elevação dos sólidos totais dissolvidos
Decai rapidamente em altos valores de pH e temperaturas Oxida ferro e manganês Deficiência dos métodos de injeção de ozônio
Auxilia no processo de clarificação e turbidez Necessita-se de dispositivo para exaustão do ozônio do reator para prevenir toxicidade
Controla cor, sabor e odor
Não mantém residual para água de abastecimento Pequenos tempos de tratamento (aproximadamente 10
minutos para ozônio comparado com 30 a 45 minutos do cloro).
Subprodutos orgânicos halogenados são formados particularmente na presença de bromo e matéria orgânica
Fonte: Adaptado de VIGNESWARAN E VISVANATHAN, 1995; USEPA 1999b.
A USEPA (1999b) afirma que o êxito da aplicação está no controle da dose, da mistura e do tempo de contato. Um sistema de ozonização deve fornecer
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máxima transferência de ozônio para a água e a concentração de ozônio deve atender a demanda das rápidas reações de oxidação das espécies orgânicas e inorgânicas, bem como as reações com os vários microrganismos presentes.
Chiang et al. (1999) comprovaram que para se aumentar a eficiência de absorção, o gás contendo ozônio deve ser introduzido na água sob a forma de pequenas bolhas, para permitir melhor contato entre o ar ozonizado e as substâncias dissolvidas no líquido. A produção de ozônio, a partir de oxigênio puro é mais eficiente que a partir de ar, com rendimento até quatro vezes maior que o obtido com ar.
Na Tabela 6 são apresentados os principais agentes utilizados em engenharia sanitária e ambiental (AWWA, 1999), e o respectivo potencial de óxido-redução, entre os quais o do ozônio.
Tabela 6. Potenciais de oxidação dos agentes oxidantes mais comumente
empregados.
Agente Oxidante Potencial (V)
Ácido hipocloroso 1,49
Íon hipoclorito 0,90
Monocloramina, em meio ácido 1,40
Monocloramina, em meio básico 0,75
Ozônio, em meio ácido 2,07
Ozônio, em meio básico 1,24
Dióxido de cloro 1,71
Oxigênio, em meio ácido 1,23
Oxigênio, em meio básico 0,40
Íon ferrato 2,20
Permanganato, em meio ácido 1,68
Permanganato, em meio básico 0,60
Fonte: AWWA,1999; FERREIRA FILHO et al. 2005.
Materiais orgânicos de diferentes origens reagem diferentemente com o ozônio. Geralmente, o ozônio degrada as substâncias orgânicas levando a
