6 DISCUSSÃO
6.2 Da Metodologia
A metodologia utilizada neste estudo foi imuno-histoquímica do tipo imunoper oxidase que consiste de uma técnica altamente específica e sensível, cujas etapas devem ser r igor osamente seguidas e os r esultados cautelosamente inter pr etados.
A padr onização da técnica e dos anticor pos a ser em utilizados, a escolha de contr oles positivos e a utilização de contr oles negativos apr opr iados são pr ocedimentos essenciais par a o sucesso da metodologia.
Em nosso estudo, seguimos r igor osamente todas as etapas de padr onização e a utilização, em cada r eação, dos contr oles necessár ios. Os contr oles negativos for am r ealizados tanto pela substituição dos anticor pos policlonais de coelho anti-iNOS humano por PBS-BSA 1%, r evelando possíveis r eações
inespecíficas dos anticor pos secundár ios, bem como pela substituição dos anticor pos anti-iNOS por sor o nor mal de coelho, eliminando assim falsos positivos advindos da incubação com os anticor pos pr imár ios. Tais contr oles gar antem, desta maneir a, a especificidade e fidelidade dos r esultados imuno - histoquímicos apr esentados.
6.3 dos Resultados
Os pr odut os bacter ianos solúveis desempenham papel fundamental na patogênese da doença per iodontal inflamatór ia cr ônica, r esultando em
ativação celular e for mação de um intenso infiltr ado inflamatór io, com pr odução de citocinas pr ó -inflamatór ias dentr e outr os mediador es70,71,97. O
óxido nítr ico tem sido consider ado impor tante molécula sinalizador a em uma gr ande var iedade de tecidos; este gás pode desempenhar r elevante papel
como mediador citotóxico na r esposta imune não específica, podendo apr esentar efeitos benéficos ou destr utivos, nos fenômenos patológicos teciduais40,44,59.
O LPS de bactér ias gr am -negativas juntamente com TNF-α, IL-1 e IFN-γ têm demostr ado ser impor tantes estímulos par a a pr odução de NO em uma var iedade de células humanas e animais, como macr ófagos, neutr ófilos, fibr oblastos, linfócitos T, osteoclastos e osteoblastos 12,23,25,41,53,74,77,83.
Os fenômenos inflamatór ios nos tecidos per iodontais, assim como em outr os tecidos conjuntivos, são acompanhados pela pr odução de NO. A par tir de modelo exper im ental de per iodontite em r atos, LOHINAI et al.52
ver ificar am aumento da pr odução local de NO e pr esença de iNOS em
macr ófagos, linfócitos e polimor fonuclear es, além da íntima r elação entr e a pr esença desta molécula e a pr esença de per da óssea alveolar . MATEJKA et al.5 7, em 1998, obser var am alto conteúdo de L-ar ginina e de L-citr ulina em
tecido gengival de pacientes com moder ada per iodontite e, r ecentemente, KENDALL et al.41, em 2000, demonstr ar am pela pr imeir a vez a pr esença de
iNOS em doença per iodontal humana atr avés de imunomar cação em fibr oblastos, células inflamatór ias e células epiteliais, suger indo assim a pr odução e par ticipação do NO na doença per iodontal humana.
No pr esente tr abalho, analisando amostr as de tecidos gengivais humanos com doença per iodontal, por meio de imuno-histoquímica, notou-se, independente se gengivite ou per iodontite, um significante aumento no númer o de células iNOS+ em r elação ao tecido gengival clinicamente
saudável. Estes r esultados cor r obor am com pr évios estudos, em tecido s humanos, os quais similar mente ver ificar am aumento da expr essão de iNOS em doença per iodontal41,47,38.
O NO tem sido consider ado um mediador multifuncional pr oduzido por , e agindo sobr e, a maior ia das células do cor po. Vár ios estudos in vitr o descr evem o efeito do NO sobr e a atividade de células ósseas22,73,74. Tais
efeitos podem ser estimulador es ou inibidor es, de acor do com difer entes níveis de concentr ação e modelos exper imentais utilizados15,40,53,73. Alguns
estudos obser var am que a pr esença de NO, adjacente a sítios de inflamação cr ônica, aumenta a r eabsor ção óssea alveolar51,52; enquanto outr os
demonstr ar am que a pr odução de NO, estimulada por citocinas inflamatór ias, pode funcionar como um mediador par a contr ole da atividade clástica, evitando excessiva r eabsor ção óssea, pr incipalmente na pr esença de
alta concentr ação local de NO15,53,74. Em vista disto, tor na-se difícil pr edizer se
a pr odução aumentada de NO dur ante a inflamação r epr esenta estímulo par a o aumento da per da óssea ou par a sua inibição15. Infelizmente, não foi
possível examinar as concentr ações de NO em nossas amostr as. Mas,
acr editamos que as células iNOS+ possam desempenhar um papel cr ítico na
pr ogr essão da doenç a per iodontal. Isto ocor r er ia, pr ovavelmente, juntamente com outr os estimulador es da r eabsor ção óssea.
Apesar dos estudos in vitro demonstr ar em que altas concentr ações de NO inibem atividade clástica enquanto baixas a moder adas potencializam
a r eabsor ção óssea local, não há evidências in vivo do efeito tempo - dependente das altas concentr ações desta molécula sobr e as células clásticas15,48,53,73. LAURENT et al.48 pr opõem que a gr ande difer ença entr e a
atividade NOS constitutiva, fisiologicamente pr oduzida, e a NOS induzível não está na concentr ação de NO ger ada, mas na dur ação da expr essão da enzima r esponsável e conseqüente síntese de NO.
No pr esente tr abalho, obser vamos aumento da por centagem de células iNOS+ na doença per iodontal quando compar ada com o gr upo
contr ole. Entr etanto, notou-se manutenção da expr essão de iNOS independentemente da pr esença ou não de per da óssea, visto que a
por centagem de células iNOS+, tanto na gengivite quanto na per iodontite, foi
mantida em apr oximadamente 6%. Assim, acr editam os que a per manência da expr essão de iNOS e a conseqüente síntese contínua de NO têm um
impor tante papel na r egulação, possivelmente na ativação, da r eabsor ção óssea alveolar pr esente nos estágios mais tar dios da doença per iodontal. Consider ando que dur ante a r esposta inflamatór ia cr ônica na doença per iodontal existe exposição contínua e por longo per íodo a agentes
bacter ianos, a contínua expr essão de iNOS obser vada em nosso estudo par ece-nos um achado de gr ande coer ência.
Em ambientes de intensa e dur adour a inflamação, como a doença per iodontal, há a pr esença de diver sas citocinas capazes de estimular a r eabsor ção óssea6,96 e simultaneamente induzir o aumento da pr odução de
NO que, por sua vez, em altas concentr ações é capaz de inibir a r eabsor ção
óssea in vitro15,53,73. Infelizmente, não é a inibição da r eabsor ção óssea que
obser vamos dur ante a pr ogr essão da doença per iodontal, embor a a doença apr esente fases de r emissão alter nadas por per íodos de intensa destr uição
tecidual68,91. De qualquer for ma, isso constitui um par adoxo no estudo da
biologia do tecido ósseo e até o pr esente momento per manece sem r esposta. Talvez, o NO par ticipe de um mecanismo de feed-back negativo nos pr ocessos de r eabsor ção óssea, ao atingir altas concentr ações. Ainda, deve- se consider ar a capacidade do NO em se difundir de suas células de or igem a distâncias que var iam em apr oximadamente 0,4mm45, bem como sua br eve
meia-vida de apenas segundos e r ápida r eação com o oxigênio, que impedem
que altas concentr ações sejam atingidas in vivo nas adjacências do sítio de pr odução. Assim acr editamos ocor r er na doença per iodontal, com difusão de NO pelo per iodonto e fluido sulcular , r esultando, por tanto, pr efer encialmente
na ativação de células clásticas à sua inibição, ou ainda na alter nância de ambos os fenômenos de acor do com uma maior ou menor concentr ação de NO pr oduzido. Entr etanto, a r elação pr ecisa entr e a concentr ação de NO e os fenômenos que r egulam o metabolismo do osso alveolar , nas doenças
inflamatór ias, per manece a ser estabelecida.
Em contr apar tida, o NO e seus pr odutos, podem ter outr os efeitos, além da ação sobr e células ósseas, inibindo o cr escimento e causando mor te
de per iodontopatógenos como Fusobacter ium nucleatum , Eikenella cor r odens e Por phyr omonas gingivalis in vitro3, constituindo, assim, como uma
impor tante molécula de defesa pr esente em doenças inflamatór ias cr ônicas. A capacidade de causar inibição enzimática, r esultando em mor te
celular , faz do NO uma molécula envolvida também em fenômenos de destr uição tecidual, uma vez que seus efeitos citotóxicos podem se estender par a as células adjacentes, pr incipalmente sob altas concentr ações e atuação
pr olongada desta molécula14,40,43,44,,61,66. Além destes efeitos citotóxicos
dependentes da sua atuação enzimática, o NO par ticipa tanto da ativação de metalopr oteinases61,66, como da supr essão de pr oteoglicanas e síntese de
colágeno88, e estes podem ser os mecanismos pelos quais o NO contr ibui par a
a per da pr ecoce de colágeno em lesões gengivais66. Além disso, o aumento de
iNOS r esulta na inibição da pr olifer ação de fibr oblastos e indução de apoptose nestas células27, contr ibuindo par a o pr edomínio da destr uição
sobr e o r epar o tecidual que é car acter ística da per iodontite40.
Adicionalmente, o NO pode ainda ativar o r ecr utamento de fagócitos40 e, por outr o lado, modular o gr au de inflamação e atuar na
r egulação dos fenômenos imunopatológicos, induzindo específica inibição da pr olifer ação de células Th190 e conseqüente amplificação e per petuação da
r esposta mediada por células Th27,89 ,94. Desta for ma, o NO pode ser
consider ado uma molécula imunossupr essor a da r esposta Th1.
Os linfócitos B e plasmócitos par ecem desempenhar um papel mais impor tante do que os linfócitos T em lesões pr ogr essivas inflamatór ias cr ônicas, como a doença per iodont al30,80,81. Todavia, há evidências da
par ticipação de linfócitos T helper na doença per iodontal humana98,99, com
maior pr olifer ação e par ticipação de linfócitos Th2 do que Th1 e aumento da expr essão de IL-6, IL-10, IL-1398 e IL-499.
Baseado na atuação do NO nas células do sistema imune e na
maior par ticipação e pr edomínio das células Th2 na pr ogr essão da doença per iodontal, suger imos ainda que o NO pr esente nesta doença pode estar par ticipando dos fenômenos de supr essão de células Th189,90,94, com
concomitante r edução dos níveis de IFN-γ e IL-2, levando a uma maior pr olifer ação de células Th289,94 e maior pr odução de IL-10, IL-4 e IL-13. Estas
citocinas são r esponsáveis pela supr essão de linfócitos Th1 e macr ófagos, estimulação da pr olifer ação de células Th2 e plasmócitos, e ativação de linfócitos B1,29,49, que têm sido consider ados os fenômenos imunes mais
impor tantes par a a pr ogr essão da doença per iodontal. Assim, o NO, juntamente com outr os fator es, pode contr ibuir par a a pr ogr essão da doença per iodontal atr avés da r egulação da r esposta imune mediada por células T.
Entr etanto, apesar das evidências que indicam a par ticipação de NO na patogênese da doença per iodontal humana, r esultados conflitantes a r espeito da função desta molécula nesta doença têm sido r elatados.
Quanto às células pr odutor as de NO na doença per iodontal, nossos dados demonstr am que as células iNOS+ for am pr edominantemente PMNs, os
quais demonstr ar am intensa positividade e, sur pr eendentemente, houve
aumento na pr opor ção de PMNs iNOS+:iNOS- dur ante a pr ogr essão da doença.
As células MNs apr esentavam -se fr acamente mar cadas, entr etanto quando
nor mal de coelho, o padr ão de mar cação mantinha-se nas células MNs, bem como nas células endoteliais, epiteliais e fibr oblastos, r evelando a pr esença de falsos positivos. Assim, apenas consider amos como imunomar cações ver dadeir as àquelas obser vadas nos PMNs. Obser vou-se ainda aumento da
por centagem dos PMNs iNOS+ nas doenças per iodontais em compar ação ao
gr upo contr ole. Esses r esultados demonstr am, desta maneir a, uma impor tante par ticipação dos PMNs, quanto à pr odução de NO em r esposta a
estímulos inflamatór ios per iodontais, quando compar ados aos MNs, podendo tr atar -se de uma maior r esponsividade dos PMNs.
Os pr esentes r esultados são conflitantes com pr évias obser vações r ealizadas por LAPPIN et al.4 7, cujos dados demonstr ar am que as células que
mais expr essam iNOS, na doença per iodontal humana, são os macr ófagos e células endoteliais, enquanto que a maior ia dos PMNs, linfócitos e células epiteliais não apr esentar am expr essão da enzima iNOS. No pr esente
tr abalho, de for ma difer ente, nós não obser vamos imunomar cação em células mononuclear es, fibr oblastos, células endoteliais e células epit eliais, o que acr editamos ter ocor r ido em função da utilização de anticor pos de
difer entes or igens, possivelmente ger ando var iável especificidade.
As por centagens de PMNs iNOS+ na doença per iodontal, em nosso
estudo, aumentar am significativamente em r elação ao gr upo contr ole. Por ém, quando se compar ava os gr upos II (gengivite) e III (per iodontite),
obser vamos um sutil aumento da por centagem de PMNs iNOS+ e uma
diminuição da por centagem de PMNs iNOS-. Nossos dados suger em uma
da sever idade da doença per iodontal. Este aumento pode estar associado como o menor r ecr utamento e par ticipação dos macr ófagos na doença per iodontal, como r ealçado pr eviamente por CHAPPLE; SRIVASTAVA; HUNTER16, em 1998. Esta suposta deficiência macr ofágica na doença
per iodontal, fr eqüentemente discutida na liter atur a, pode r esultar da supr essão da r esposta Th1 causada pelo NO, dentr e outr os fator es89,90,94.
Consider ando isto uma ver dade, o NO, além de par ticipar dos fenômenos
pr eviamente discutidos, ser ia ainda um dos r esponsáveis pela maior par ticipação dos PMNs na sua pr ópr ia pr odução.
Apesar de em menor númer o do que os MNs, nós acr editamos que os PMNs são mais impor tantes quanto à pr odução e compar timentalizaç ão de NO na doença per iodontal. Sendo assim, suger imos que o NO pr oveniente dos PMNs, em conjunto com vár ias enzimas destr utivas, constitui um dos r esponsáveis pela destr uição per iodontal, além da atuação na r egulação da
r eabsor ção óssea e de fenômenos imunopatológicos e antimicr obianos. Não podemos descar tar a possibilidade da expr essão de iNOS, identificada neste estudo, r epr esentar apenas um sinal de ativação celular em r esposta a
estímulos bacter ianos e de citocinas.
O NO pr oveniente dos PMNs tem sido r elacionado ainda com a ativação de metalopr oteinases, especialmente a pr ocolagenase neutr ofílica humana (MMP-8)6 6 que, pr ovavelmente, atua como fator adicional na
degr adação de fibr as colágenas e pr ogr essão da doença per iodontal40,66.
Assim, os PMNs, atr avés da síntese de NO, podem par ticipar , em um pr imeir o momento, da eliminação de micr oor ganismos patogênicos e, com a
per sistência de estímulos inflamatór ios, estas células par ticipar iam de fenômenos destr utivos por meio também da ativação excessiva de meta lopr oteinases.
Em r esumo, nossos r esultados clar amente demonstr am que o
númer o de células iNOS+ é mais elevado na doença per iodontal do que no
tecido gengival clinicamente saudável, e que a pr odução de NO par ece ser contínua nos difer entes estágios da doença per iodontal. Assim, as células
inflamatór ias apr esentam uma via adicional de ativação na doença per iodontal, com ênfase aos PMNs que expr essar am iNOS significativamente, pr ovavelmente r epr esentando uma impor tante fonte de óxido nítr ico nesta doença.
As células pr odutor as de NO e seus possíveis efeitos na doença per iodontal estão r epr esentados no esquema hipotético na Figur a 14.
FIGURA 14 – Repr esentação esquemática das células inflamatór ias r esponsáveis pela síntese de NO quando estimuladas por pr odutos bacter ianos, bem como a possível ação deste gás na patogênese da doença per iodontal. Pr ovavelmente, o NO, na doença per iodontal, par ticipa de fenômenos imunor r egulatór ios e destr utivos, atuando especialmente na supr essão de células Th1 e macr ófagos, na r egulação da r eabsor ção óssea e na degr adação de fibr as colágenas.
Placa Bacteriana Placa Bacteriana
Polimor fonuclear neutr ófilo
7 CONCLUSÕES
7 CONCLUSÕES
De acor do com os r esultados obtidos nesse tr abalho, podemos concluir que:
1. o númer o total de células iNOS positivas é mais elevado na doença per iodontal do que no tecido gengival clinicamente saudável,
2. o númer o total de células iNOS positivas não apr esenta difer ença significante entr e os gr upos Gengivite e Per iodontite,
3. na doença per iodontal, a por centagem de células iNOS positivas é maior quando compar ada com o gr upo contr ole. Entr etanto, não houve
difer ença significante entr e os gr upos II e III quanto às por centagens de células iNOS positivas. Assim, o aumento da expr essão de iNOS foi pr opor cional à amplificação do infiltr ado inflamatór io,
4. apenas os PMNs apr esentar am intensa imunomar cação par a a iNOS, 5. os PMNs iNOS positivos aumentar am par alelamente com a pr ogr essão da
doença per iodontal.
A par tir de nossas conclusões, podemos suger ir que:
1. as células polimor fonuclear es apr esentam um a via adicional de ativação na doença per iodontal. O NO pr oduzido pode estar envolvido na patogênese da doença per iodontal, atuando em fenômenos imunor r egulador es, antimicr obianos ou destr utivos.
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