SINTASE INDUZÍVEL (iNOS) EM GENGIVITES ASSOCIADAS À
SINTASE INDUZÍVEL (iNOS) EM GENGIVITES ASSOCIADAS À
PLACA DENTOBACTERIANA E PERIODONTITES CRÔNICAS
PLACA DENTOBACTERIANA E PERIODONTITES CRÔNICAS
LOCALIZADAS
LOCALIZADAS
ALINE CARVALHO BATISTA
ALINE CARVALHO BATISTA
Disser tação apr esentada à Faculdade de Odontologia de Baur u, Univer sidade de São Paulo, como par te dos r equisitos par a obtenção do título de Mestr e em Odontologia, ár ea de Patologia Bucal.
(Edição Revisada)
BAURU BAURU
LOCALIZADAS
LOCALIZADAS
ALINE CARVALHO BATISTA
ALINE CARVALHO BATISTA
Disser tação apr esentada à Faculdade de Odontologia de Baur u, Univer sidade de São Paulo, como par te dos r equisitos par a obtenção do título de Mestr e em Odontologia, ár ea de Patologia Bucal.
(Edição Revisada)
Or ientador a:
Pr ofa. Dr a. Vanessa Soar es Lar a
BAURU BAURU
Batista, Aline Carvalho
Batista, Aline Carvalho
Avaliação da expr essão da enzima óxido nítr ico-sintase induzível (iNOS) em gengivites associadas à placa bacter iana e per iodontites cr ônicas localizadas / Aline Car valho Batista - - Baur u, 2001.
90p. : il.; 30cm.
Disser tação (Mestr ado) - - Faculdade de Odontologia de Baur u. USP.
Or ientador a: Pr ofa. Dr a. Vanessa Soar es Lar a B321a
Aut or izo, exclusivamente par a fins acadêmicos e científicos, a r epr odução total ou par cial desta tese, por pr ocessos fotocopiador es e outr os meios eletr ônicos.
Baur u, 26 de novembr o de 2001
Nascimento 12 de setembr o de 1975
1994 - 1997 Cur so de Gr aduação em Odontologia pela Univer sidade do
Sagr ado Cor ação de Baur u – S.P.
1998 - 1999 Cur so de Extensão Univer sitár ia em Cir ur gia e
Tr aumatologia Bucomaxilofacial na Univer sidade do
Sagr ado Cor ação de Baur u – S.P.
2000 - 2001 Mestr ado em Odontologia, Ár ea de Patologia Bucal, na
Faculdade de Odontologia de Baur u – USP.
Associações SOBE – Sociedade Br asileir a de Estomatologia.
A Deus, pela vida e por colocar no meu caminho pessoas sábias, capacitadas,
inteligentes que muito me ensinaram e prepararam, e foram ao mesmo tempo companheiras,
de um adulto e não com a tristeza de uma criança. A prende que verdadeiras amizades continuam a crescer mesmo a longas distâncias. E o que importa não é o que você tem na vida,
mas quem você tem na vida. Descobre que as pessoas com quem você mais se importa na vida são tomadas de você muito depressa, por isso sempre devemos deixar as pessoas que amamos com palavras amorosas, pode ser a última vez que as vejamos. Descobre que se leva muito tempo para tornar-se a pessoa que se quer ser, e que o tempo é curto. A prende que não importa aonde já chegou, mas onde está indo. A prende que heróis são pessoas que fizeram o que era necessário fazer, enfrentando as conseqüências.
A prende que paciência requer muita prática. Descobre que algumas vezes a pessoa que você espera que o chute quando você cai é uma das poucas que o ajuda a levantar-se. A prende que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiência que
V ivemos derrotas, esforços, lutas, desafios, vitórias, méritos e medos que são superados
ou comemorados com as pessoas que estão ao nosso lado.
Gostaria de dividir o que conquistei com pessoas muito especiais que confiaram,
investiram e acreditaram em mim. Deram-me esperança e asas para voar. E assim agradecer
imensamente todos que tive o privilégio de conviver estes anos...
À minha orientadora Professora Doutora V anessa Soares L ara,
Responsável pelo meu crescimento profissional e pelas minhas conquistas. Agradeço a
confiança, o apoio, o incentivo, as oportunidades proporcionadas e a amizade. Nesta convivência
muitas sementes foram espalhadas e muitos frutos ainda serão colhidos. Obrigada por tudo.
Ao Professor Doutor Hugo Nary Filho, exemplo de luta e generosidade, pelo
constante incentivo, apoio e amizade. Obrigado por ter acreditado em mim.
Aos professores da Disciplina de Patologia de Faculdade de Odontologia de Bauru,
Universidade de São Paulo:
Professor Doutor Alberto Consolaro, exemplo de dedicação ao ensino e pesquisa, por
tudo aquilo que tem me ensinado, pela confiança e pelas oportunidades que me proporcionou.
Professor Doutor L uís Antônio de Assis Taveira e Professora Doutora Denise
Tostes de Oliveira pelo estímulo, incentivo e alegre convivência.
Aos funcionários da Disciplina de Patologia de Faculdade de Odontologia de Bauru,
Universidade de São Paulo:
Aos colegas da Pós-graduação em Patologia Bucal Tânia, Simone, Sandra, Braz,
Daniel, Jussara, Telma, L aurindo e Tarcília,
À Simone, pelo carinho e companheirismo,
À Tânia, exemplo de bondade e luta, pelos ensinamentos de vida e pela ajuda e apoio
“nunca” negados,
À Tarcília, pela amizade, apoio, sugestões e contribuições no decorrer do referido
trabalho. Obrigado pelo desprendimento para a realização deste trabalho e pelos valiosos
ensinamentos,
Às coleguinhas Camila e Carol, obrigada por tudo!!!
Aos novos colegas Rosário, Álica, L ídia, Rosa e V aldomiro, que tornaram o
Departamento mais alegre....
Aos verdadeiros amigos, vocês estarão sempre no meu coração. Haverá sempre uma
doce lembrança das dificuldades, lutas, bons e alegres momentos que passamos juntos.
Aos meus irmãos Micheline, Caroline e L uiz Antônio, pela eterna torcida...
Ao meu avô L orico (in memorian), aos meus tios e tias e a minha avó Dica que
mesmo distantes estão sempre vibrando com minhas vitórias...
Ao Otávio Teodoro Martins (in memorian), pelos momentos alegres...
À Dona E dilza por sua luz, pelas orações e constante apoio...
Aos meus grandes amigos Danielinha, Juliane, Alessandra, Daniela Gouveia,
Tatiana, Raquel, L iziane, Carla, E tyenne, Mariana, Izabel Cristina, Ruth, Ana Carla,
Cláudia, Jaqueline e Serginho, irmãos que a vida me deu, e por isso tão valiosos...
USP, aos professores e aos pós graduandos Fábio L uís, Flávio Seabra, Marinelle, Renata
Freitas, Pedro, Daniel, E lonice e L uciana Gentile pela contribuição. Muito obrigado!!!
Ao Professor Doutor José Roberto Pereira L auris do Departamento de
Odontopediatria, Ortodontia e Saúde Coletiva da Faculdade de Odontologia de Bauru,
Universidade de São Paulo, pelo valioso auxílio nas análises estatísticas deste trabalho...
À funcionária Ivânia, do Departamento de Periodontia da Faculdade de Odontologia
de Bauru, Universidade de São Paulo, pelo empenho e colaboração.
Ao funcionário André, da Disciplina de Microbiologia da Faculdade de Odontologia
de Bauru, Universidade de São Paulo, sempre pronto a ajudar,
Ao Departamento de Bioquímica da Faculdade de Odontologia de Bauru,
Universidade de São Paulo, aos professores e funcionários, pelos inúmeros auxílios prestados,
Aos funcionários da biblioteca Cybele, Rita, Cézar e demais funcionários, pela
paciência e dedicação,
LISTA DE ABREVIATURAS --- xi
RESUMO --- xiv
1 INTRODUÇÃO --- 1
2 REVISÃO DE LITERATURA --- 6
3 PROPOSIÇÃO --- 22
4 MATERIAL E MÉTODOS --- 24
4.1 Seleção e car acter ização da amostr agem --- 25
4.2 Técnica Imuno-histoquímica --- 28
4.3 Análise Subjetiva --- 31
4.4 Análises Quantitativas --- 31
4.4.1 Contagem de Células por mm2 --- 31
4.4.2 Fr eqüência Relativa (Por centagem) --- 32
4.5 Análise Estatística --- 33
5 RESULTADOS --- 34
5.1 Análise Subjetiva --- 35
5.2 Análises Quantitativas --- 53
5.2.1 Contagem de Células por mm2 --- 53
5.2.2 Fr eqüência Relativa (Por centagem) --- 56
6 DISCUSSÃO --- 62
6.1 Do Título do Tr abalho --- 63
ABSTRACT --- 93
APÊNDICE
µµm m Micr ometer Micr ometr o
bFGB ou FGF
bFGB ou FGF--22 Basic fibr oblast gr owth factor
Fator de cr escimento fibr oblástico básico
BSA
BSA Bovine ser um albumine
Soro-albumina bovina
DAB
DAB Diaminobenzidine
Diaminobenzidina
HE
HE Haematoxilin eosin
Hematoxilina e eosina
IFN
IFN Int er f er on
IL
IL Inter leukin
Inter leucina
L
L--NMMANMMA NG-m onometil – L – ar ginina
LPS
LPS Lipopolysacchar ide
Lipopolissacar ídeo
MHC
MHC Major histocompatibility complex
MMP
MMP Matr ix metallopr oteinase
Matr iz metalopr oteinase
mRNA
mRNA messenger Ribonucleic Acid
Ácido r ibonucléico mensageir o
NO
NO Nitr ic oxide
Óxido nítr ico
NO
NO22-- Nitr ite
Nitr ito
NO
NO33-- Nitrate
Nitrate
NOS
NOS Nitr ic oxide sintase
Óxido nítr ico sintase
NOSc ou cNOS
NOSc ou cNOS Nitr ic oxide sintase constitutive Óxido nítr ico sintase constitut ível
NOSi ou iNOS
NOSi ou iNOS Nitr ic oxide sintase inducible Óxido nítr ico sintase induzível
PBS
PBS Phosphate buffer ed saline
ROS
ROS Reactive oxygen species
TNF
TNF Tumor necr osis f act or
Na doença per iodontal associada à placa dentobacter iana, pr odutos
bacter ianos difundem-se atr avés dos tecidos per iodontais, induzindo
mecanismos de defesa não específicos e específicos, com síntese de vár ios
mediador es pr ó-inflamatór ios, incluindo o óxido nítr ico (NO). A enzima
r esponsável pela pr odução de NO, a NO sintase (NOS), foi identificada em
vár ios tipos celular es e possui ação dir eta sobr e o metabolismo ósseo, bem
como sobr e fenômenos destr utivos teciduais e imunopatológicos. Com o
objetivo de analisar a pr esença de NO na doença per iodontal, r ealizamos um
estudo quantitativo ger al e pr opor cional com análise estatística de células
iNOS positivas em amostr as de tecidos gengivais clinicamente saudáveis,
gengivites associadas à placa dentobacter iana e per iodontites cr ônicas
localizadas, atr avés da técnica imuno -histoquímica. Significante aumento do
númer o de células iNOS positivas por mm2 foi obser vado em amostr as de
gengivites e per iodontites, compar adas ao gr upo contr ole. Em todos os
gr upos, a maior ia das células iNOS positivas er am mononuclear es
apr esentado fr aca a moder ada imunor r eatividade. Por outr o lado, as células
polimor fonuclear es iNOS positivas demonstr ar am intensa imunomar cação,
independente do estágio da doença, e apenas a por centagem de células
polimor fonuclear es iNOS positivas apr esentar am significante aumento
compar ada àquela do gr upo contr ole. Nossos r esultados indicam que, nos
tecidos per iodontais, o NO aumenta na pr esença de doença inflamatór ia.
neutr ófilos, que expr essam iNOS significativamente, pr ovavelmente
1 INTROD
1 INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
As doenças per iodontais associadas à placa dentobacter iana são
lesões inflamatór ias cr ônicas que podem afetar apenas o tecido gengival ou
todo o tecido per iodontal de supor te, levando assim a per da do dente. O seu
agente etiológico pr im ár io é a placa dentobacter iana; vár ias espécies
bacter ianas r esidem neste biofilme micr obiano for mado na super fície
dentár ia, dentr e elas: Por phyr omonas gingivalis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Bacter oides for sythus, Pr evotella inter media,
Campylo bacter r ectus, Eubacter ium nodatum, Tr eponema denticola,
Str eptococcus inter media, Pr evot ella nigr escens, Peptostr eptococcus micr os,
Fusobacter ium nucleatum e Eikenella cor r odens24. Os componentes e
pr odutos bacter ianos agr idem o tecido per iodontal adjacente, induzindo a
for mação de um infiltr ado inflamatór io intenso, com pr edominância de
polimor fonuclear es neutr ófilos (PMNs), plasmócitos, linfócitos e macr ófagos,
bem como síntese, secr eção e ativação de uma sér ie de mediador es químicos
pró-inflamatór ios como inter leucina (IL)-1, fator de necr ose tumor al (TNF)-α,
inter fer on (IFN)-γ, fator de cr escimento fibr oblástico básico (bFGF) e óxido
nítr ico (NO)6,10,38,57.
O NO é um r adical livr e pr oduzido a par tir do aminoácido
L-ar ginina atr avés da ação de isoenzimas, globalmente denominadas NO
sintases (NOS). Tr ês difer entes isofor mas são conhecidas: NOS endotelial
(eNOS), NOS neur onal (bNOS) e NOS induzível (iNOS). A eNOS e bNOS são
um cur t o per íodo de tempo. Entr etanto, a iNOS, identificada em vár ios tipos
celular es como macr ófagos e PMNs, é expr essa em r esposta a estímulos
inflamatór ios, tais como IL-1, TNF-α, IFN-γ e lipopolissacar ídeos (LPS), sendo
pr oduzida em altas quantidades e por longo per íodo de tempo40. Quando o
NO é localmente pr oduzido em altas concentr ações, pode agir como molécula
citotóxica ou citotástica contr a células infectadas por fungos, bactér ias,
pr otozoár ios, bem como células tumor ais e células pr óximas à r egião de
pr odução de NO44,46, podendo r esultar em extensa destr uição tecidual40.
O NO possui também impor tante par ticipação na r egulação da
r esposta imune e do metabolismo ósseo, agindo dir etamente sobr e células
clásticas15,22,54,73,74. A pr esença deste gás na doença per iodontal pode r efletir a
par ticipação de um mediador adicional na r egulação da r eabsor ção óssea
r esponsável pela pr ogr essão da doença.
No micr oambiente da doença per iodontal, a pr esença de estímulos
inflamatór ios capazes de induzir a pr odução de NO por células inflamatór ias
é bem estabelecida38,74,96,97. A pr esença de altas quantidades de ar ginina e
L-citr ulina em tecido gengival inflamado in vivo57 e a expr essão de iNOS em
macr ófagos, linfócitos e PMNs em per iodontites induzidas exper imentalmente
em r at os52, bem como em fibr oblastos, células epiteliais41, macr ófagos e
células endoteliais em per iodontite humana47, r evelam a possível par ticipação
do NO na doença per iodontal.
Este gás par ece desempenhar um papel benéfico, bem como
destr utivo, na doença per io dontal. Dentr e os efeitos benéficos podemos
lado, podem ocor r er efeitos destr utivos como a ação citotóxica nos tecidos
adjacentes, incluindo osso alveolar40,51. Esta citotoxicidade mediada por NO
pode ocor r er em combinação com a sua capacidade de ativação de
metalopr oteinases liber adas por macr ófagos ativados, PMNs e fibr oblastos
r esidentes40,44,61,66,68.
Apesar de vár ios autor es r essaltar em a impor tância da
par ticipação do NO na do ença per iodontal3,38,41,47,52,57, sua função na
patogênese desta doença, se fundamental na eliminação bacter iana ou se
contr ibui par a a destr uição tecidual ou ambos, per manece desconhecida. Em
tecidos humanos, poucos autor es estudar am NO na doença per iodontal,
entr e eles MATEJKA et al.57 que descr ever am níveis significantemente
elevados de substr atos de NOS, L-ar ginina e L-citr ulina, em amostr as de
tecido gengival inflamado, compar adas com contr oles, e KENDALL et al.41,
LAPPIN et al.47 e HIROSE et al.38 que obser var am maior expr essão de iNOS em
amostr as de per iodontite em r elação à mucosa gengival clinicamente
saudável. Ainda não foi r ealizada uma análise quantitativa das difer entes
células iNOS positivas (iNOS+) nos difer entes estágios da doença per iodontal
humana, consider ando pr incipalmente a pr esença ou não de r eabsor ção
óssea associada.
Neste estudo, nosso objetivo foi identificar e quantificar a
expr essão de iNOS em amostr as de gengivites associadas à placa
dentobacter iana e per iodontites cr ônicas local izadas, atr avés da técnica
imuno-histoquímica do tipo imunoper oxidase, r elacionando esta molécula
pr ogr essão da doença per iodontal, bem como com fenômenos
2 REVISÃO DA LITERATURA
2 REVISÃO DA LITERATURA
A patogenia das doenças per iodontais envolve mecanismos
imunopatológicos e inflamatór ios contr a micr oor ganismos bucais
colonizador es da super fície da placa dentobacter iana, dentr e eles:
Por phyr omonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pr evotella
inter media, Tr eponema denticola, Str eptococcus inter media, Pr evotella
nigr escens, Peptostr eptococcus micr os, Fusobacter ium nucleatum e Eikenella
cor r odens24. Além do fator essencial, ou seja a placa dentobacter iana, é
impor tante a par ticipação de fator es de r isco adquir idos do hospedeir o, como
os hor monais, genéticos ou o fumo, par a a instalação e pr ogr essão da
doença35. Esses fator es de r isco atuam no metabolismo dos tecidos
per iodontais, alter am a função leucocitár ia e a pr odução e atuação dos
anticor pos, deixando o per iodonto mais ou menos vulner ável à ação da placa
dentobacter iana70.
Doença per iodontal associada à placa dentobacter iana, a mais
fr eqüente causa de per da dentár ia em adultos, car acter iza-se por destr uição
do ligamento per iodontal, per da da cr ista óssea alveolar , migr ação apical do
epitélio e for mação de bolsa per iodontal50,67. Embor a a pr esença de
per iodontopatógenos seja um pr é-r equisito, a pr ogr essão da doença é
dependente do tipo de r esposta do hospedeir o contr a estes micr oor ganismos
que colonizam a super fície dentár ia31. Os pr odutos bacter ianos iniciam uma
r esponsáveis pelo r ecr utamento de células inflamatór ias, liber ação de
enzimas pr oteolíticas e ativação dos clastos6,68.
Na doença per iodontal humana, a destr uição tecidual está
r elacionada a mecanismos dependentes e independentes da inflamação,
embor a a maior ia dos micr oor ganismos ger e r eação inflamatór ia. A
colonização e pr olifer ação de micr oor ganismos no inter ior do sulco gengival
r esultam em liber ação de citocinas e outr os mediador es químicos, bem como
em destr uição tecidual devido à liber ação de pr odutos como LPS e enzimas
que atuam dir etamente sobr e popul ações celular es r esidentes e
migr antes10,97. As células-alvo destes mediador es não são apenas células
inflamatór ias como leucócitos PMNs e macr ófagos, mas também fibr oblastos,
células epiteliais juncionais e da bolsa, células endoteliais e possivelmente
osteoblastos que r evestem super fícies ósseas nas ár eas afetadas10.
A gengivite associada à placa dentobacter iana tem sido
consider ada a for ma mais comum de doença per iodontal, sendo
car acter izada por uma inflamação r estr ita ao tecido gengival que pode ter
seu contor no aumentado devido ao edema ou fibr ose, mas possui um possível
papel como pr ecur sor a da per da de inser ção conjuntiva e r eabsor ção
óssea5,55. Micr oscopicamente, a gengivite associada à placa dentobacter iana
car acter iza-se por uma lesão pr ecoce ou estabelecida, onde uma infiltr ação
inicial de neutr ófilos é sucedida por uma gr ande infiltr ação pr ogr essiva de
linfócitos67,71. Segundo PAGE; SCHROEDER71, dur ante a passagem de gengivite
(lesão estabelecida) par a per iodontite (lesão avançada) pode ser obser vado
Além da infiltr ação inflamatór ia, outr os eventos biológicos ocor r em na
gengivite tais como: início da pr olifer ação do epitélio juncional, aumento dos
vasos sangüíneos adjacentes a este epitélio e destr uição das fibr as
colágenas67, 71.
A per iodontite cr ônica, difer entemente da gengivite, car acter iza-se
por per da da inser ção conjuntiva e de osso alveolar , pela pr esença de bolsa
per iodontal instalada e inflamação gengival cr ônica24. A per iodontite cr ônica
é a mais fr eqüente for ma de per iodontite, ocor r e em qualquer idade, mas é
detectada comumente em adultos5. Pode ser classificada, de acor do com sua
extensão, em localizada, quando o númer o de r egiões envolvidas for menor
ou igual a 30%, e gener alizada, quando for maior ou igual a 30%. De acor do
com a sever idade, a per iodontite cr ônica pode ainda ser leve, quando a per da
de inser ção conjuntiva for entr e 1 e 2mm, moder ada, entr e 3 e 4mm, e
sever a, acima ou igual a 5mm24. A destr uição do tecido conjuntivo na doença
per iodontal avançada ocor r e pr incipalmente pela liber ação e secr eção de
citocinas e enzimas pr oteolíticas pelos macr ófagos, linfócitos e PMNs, dentr e
outr as células10,69,71,83.
A pr ogr essão da doença per iodontal está dir etamente r elacionada
com a per sistência da placa dentobacter iana, com o r ecr utamento de células
inflamatór ias, pr odução de citocinas, imunor r egulação, difer enciação de
clastos e conseqüente per da óssea6. ASSUMA et al.6, atr avés de um modelo de
per iodontite ex per imental em pr imatas, obser var am que inicialmente o
númer o de células inflamatór ias no tecido conjuntivo super ficial pr óximo ao
pr óximas ao tecido ósseo, o que é consistente com inflamação cr ônica
tipicamente encontr ada na gengivite. Nas avaliações seguintes, após 2, 4 e 6
semanas, houve um gr ande aumento do númer o de células inflamatór ias
tanto no tecido conjuntivo super ficial, como pr óximo ao osso e ligamento
per iodontal, além da difer enciação de clastos e per da óssea. As pr incipais
células ver ificadas no último per íodo avaliado for am PMNs, macr ófagos,
linfócitos e plasmócitos. Todavia, os tecidos acometidos pela doença
per iodontal também abr igam células r esidentes, como por exemplo os
mastócitos, que possuem um consider ável potencial destr utivo, o qual não se
limita desta maneir a às células migr antes tr adicionalmente pr esentes
dur ante a pr ogr essão desta doença10,33,92.
As células imunes e inflamatór ias pr esentes na doença per io dontal
são constantemente estimuladas por componentes micr obianos,
especialmente LPS e, fr ente a estes estímulos, sintetizam diver sas citocinas
pró-inflamatór ias e imunor r egulador as como TNF-α, IL-1 α e β, INF-γ, 2,
IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 e IL-1313,29,30,39,56,68,96. Tais citocinas, associadas ao LPS, são
r esponsáveis pela per petuação do pr ocesso inflamatór io e iniciação,
pr ogr essão e modulação da r esposta imune pr esente na doença per iodontal
humana29.
Em níveis aumentados na doença per iodontal, as citocinas pr ó
-inflamatór ias TNF-α, IL-1α e IL-1β21,58,79 par ticipam na r egulação da imunidade
inata1, no r ecr utamento de células inflamatór ias10,20,54,63, na difer enciação e
pr olifer ação de clastos6,84, bem como atuam efetivamente na patogênese da
Além de citocinas pr ó-inflamatór ias, diver sas citocinas
imunor r egulador as como o IFN-γ, a IL-2, IL-4, IL-10 e IL-13 são sintetizadas,
dur ante a doença per iodontal cr ônica, por linfócitos T, células Natur al Killer
(NK) e macr ófagos; tais citocinas modulam a r esposta imune e contr ibuem
par a a pr ogr essão da per iodontite96.
É bem estabelecido que células T helper tipo 1 (Th1) sintetizam IL-2
e IFN-γ que agem na ativação de células T citotóxicas e macr ófagos que, por
sua vez, atr avés de um mecanismo de f eed-back positivo, estimulam a
pr olifer ação e difer enciação de células Th11,29. Por outr o lado, as células T
helper tipo 2 (Th2) sintetizam IL-4, IL-6, IL-10 e IL-13 que atuam na supr essão
da ativação de macr ófagos, estimulam a pr odução de imunoglobulinas por
plasmócitos (pr incipalmente IgG e IgE) e estimulam a pr olifer ação de células
Th21,29. Na doença per iodontal humana, alguns autor es obser var am o
pr edomínio da r esposta imune Th2 sobr e a r esposta Th129,30,75,98,99, com baixos
níveis de IL-2 e IFN-γ29, e maior expr essão de IL-499, IL-6, IL-10 e IL-1330,38,98,99,
bem como altos níveis de IgG em sítios de per iodontite ativa64,75.
Evidenciou-se, ainda, maior pr opor ção de linfócitos B e plasmócitos em r elação aos
linfócitos T30,65,80,81,99, pr edomínio de linfócitos T helper (CD4+) sobr e os
linfócitos T citotóxicos (CD8+)30,99 e deficiência no r ecr utamento e ativação de
macr óf agos16. Em conjunto, estes dados suger em a ativação e par ticipação
da r esposta imune via célu las Th2 no desenvolvimento e pr ogr essão da
doença per iodontal humana30,80,81,99.
Em contr aste, elevada expr essão de r esposta Th1 com impor tante
quando compar adas com amostr as contr oles de tecido gengival clinicamente
saudável65. Possivelmente, a expr essão de deter minadas citocinas, como o
IFN-γ, var ia nos difer entes estágios e for mas de per iodontite, podendo
r esultar em alter nâncias entr e r esposta imune Th1 e Th2 dur ante a
pr ogr essão desta doença. Embor a extensivamente estudados, os fenômenos
imunor r egulatór ios envolvidos na patogênese da doença per iodontal ainda
não estão completamente elucidados, per manecendo inúmer as diver gências.
No micr oambiente da doença per iodontal, além da pr esença de
diver sas citocinas, tem sido obser vada a pr odução de NO, o qual age
dir etamente na manutenção e pr ogr essão da inflamação, bem como na
destr uição tecidual. As citocinas inflamatór ias, como IL -1α e β, TNF-α, IL-6 e
INF-γ, são potentes estimulador es da pr odução de NO que, por sua vez, atua
sobr e o metabolismo de diver sas células15,53,74,89. A ação sinér gica de citocinas
inflamatór ias com LPS é muito mais potente quanto à estimulação da
pr odução de NO, do que citocinas e LPS atuando isoladamente53,74,86.
O LPS de impor tantes per iodontopatógenos como de
Por phyr omonas gingivalis, de Actinobacillus actinomycetemcomitans e de
Tr eponema denticola são capazes de estimular macr ófagos mur inos a
pr oduzir NO in vitr o12,26,77,83, aumentando a pr odução deste gás em 20 a 30
vezes, compar ativamente ao contr ole26. Adicionalmente, a capacidade dos
PMNs humanos de expr essar iNOS, bem como de sintetizar e secr etar NO, foi
evidenciada in vivo e in vitr o a par tir de amostr as de lesões per iapicais
inflamatór ias cr ônicas e de exsudatos inflamatór ios coletados de sítios com
Por muitos anos, o NO foi consider ado apenas um poluente
ambiental; as pr imeir as evidências da síntese deste gás em mamífer os for am
em 1978 e 1981 por TANNENBAUM et al .87 e GREEN et al.32, r espectivamente.
Estes autor es obser var am que a quantidade de nitr ato e nitr ito, pr esente na
ur ina e outr as secr eções de pacientes saudáveis, foi quatr o vezes maior que
a quantidade inger ida destas moléculas e, assim, suger ir am que nitr ito e
nitr ato er am sintetizados de for ma endógena em humanos32,87. Os achados de
TANNENBAUM87 e GREEN32 for am confir mados em 1985 por STUEHR e
MARLETTA85 que demonstr ar am pr odução, por macr ófagos de r atos, de
nitr ito e nitr ato em r esposta a LPS de Escher ichia coli.
Em seqüência, um estudo r ealizado por HIBBS et al.36, em 1987,
demonstr ou que macr ófagos mur inos ativados sintetizam L-citr ulina e nitr ito
na pr esença de L-ar ginina e, no ano seguinte, estes mesmos autor es
evidenciar am que macr ófagos mur inos ativados por LPS sintetizam NO e que
esta molécula é pr ecur sor a de moléculas estáveis como nitr ito e nitr ato37.
Simultaneamente, PALMER; FERRIGE; MONCADA72 demonstr ar am
exper imentalmente a liber ação de NO por células endoteliais e a par ticipação
desta molécula em atividades biológicas tal como o r elaxamento aór tico de
r atos7 2. O NO foi consider ado “a molécula do ano” em 1992, pela r evista
“Science”17,45 e foi definitivamente r econhecido como um impor tante mediador
biológico, par ticipando de fenômenos inflam atór ios e imunológicos62.
A molécula NO constitui um r adical livr e sintetizado na pr esença de
NOS exist em como tr ês isofor mas difer entes, denominadas NOS endotelial
(eNOS), NOS neur onal (bNOS) e NOS induzível (iNOS). A iNOS é expr essa em
r esposta aos estímulos inflamatór ios como o LPS, IL-1, TNFα, TNFβ e IFNγ,
pr incipalmente por ação sinér gica, pr oduzindo NO por longo per íodo de
tempo15,38,83.
O NO pode ser inibido por L-NG ar ginina monometil (NMMA),
L-metil ar ginina (L-NAME) e aminoguanidina e, em meio aer óbio,
espontaneamente sofr e oxidação conver tendo -se em moléculas estáveis como
o nitrato (NO3-) e nitr ito (NO 2
-). Estes metabólitos são obser vados em fluidos
biológicos como plasma, ur ina e fluido sinovial22,32,43. Por ém, o NO pode r eagir
com moléculas de oxigênio ou com outr as biomoléculas, or iginando
compostos citotóxicos como o per oxinitr ito (ONOO-), o qual tem sido
consider ado mais tóxico do que seu pr ecur sor NO40,44,66.
A síntese de NO tem sido obser vada em macr ófagos12,26,49,83, bem
como em outr as células como neutr ófilos23,66,86,93, linfócitos T helper89,
fibr oblastos41,27, células epiteliais4,78, osteoclast os25, ost eoblast os25,53,
condr ócitos11,53, células de Langer hans78, células endoteliais47,76 e,
r ecentemente, em mastócitos9,42, podendo ter vár ios efeitos dependendo do
tipo de célula que pr oduz, do sítio de liber ação e da concentr ação
pr oduzida59, 60.
Todavia, a detecção de NO por macr ófagos humanos não está
completamente estabelecida, demonstr ando discr etos níveis de NO por estas
células estimuladas com citocinas in vitro quando compar adas com
O NO é um gás capaz de per cor r er livr emente dentr o da célula,
atr avés da membr ana celular e entr e as células, estando envolvido na
comunicação intr acelular e inter celular , sendo capaz de se difundir
mantendo seu potencial de ação40,45. Ao contr ár io de outr os mensageir os
inter celular es, o NO não se liga a r eceptor es e sua meia-vida cor r esponde a
segundos, sendo que seus efeitos são tr ansitór ios e locais40. No entanto,
estudo in vitr o obser vou a pr odução de NO em cultur a de osteoblastos, bem
como de macr ófagos de r atos, estimulados por citocinas e LPS, por até 72
hor as após a estimulação26,53.
Dentr e as funções do NO, obser va-se a manutenção da homeostasia
tecidual, incluindo vasodilatação, neur otr ansmissão e inibição da agr egação
e adesão plaquetár ias40. O NO também apr esenta impor tante função na
r esposta de defesa, podendo atuar como molécula citotóxica fr ente a fungos,
bactér ias, pr otozoár ios, bem como células tumor ais e células pr óximas do
sítio de pr odução60. Esta função deve-se à sua capacidade de inibição da
atividade enzimática intr acelular , como por exemplo enzimas envolvidas com
a r espir ação mitocondr ial e síntese de DNA37,40,43,44. Tais efeitos do NO
par ecem ser devido à sua ligação com gr upamentos fer r o-sulfur das
enzimas37,44. Além disso, o NO é capaz de mediar dano no DNA e mor te
celular via apoptose, induzindo fr agmentação de DNA11.
Adicionalmente, o NO atua sobr e células ósseas possuindo
significante efeito na modulação da r eabsor ção óssea22. Em condições
patológicas, incluindo a doença per iodontal, o NO atua sobr e células das
e autócr ino na modulação do metabolismo ósseo, com efeitos bifásicos de sua
pr odução sobr e a r eabsor ção óssea22,15,74. Estudos in vitr o demonstr ar am que
IL-1, TNF-α e INF-γ são po tentes estimulador es da pr odução de NO e altas
concentr ações desta molécula inibem o metabolismo ósseo local, supr imindo
a r eabsor ção óssea; em contr aposição, NO em baixas a moder adas
concentr ações potencializa a atividade clástica e conseqüente r eabsor ção
óssea local15,22,53,74.
A ger ação de r adicais livr es der ivados do oxigênio (ROS),
par ticular mente super óxido (O2-), está associada com a for mação de novos
osteoclastos e com o aumento da r eabsor ção óssea in vitr o e in vivo28. O
super óxido em combinação com NO or iginar á um composto altamente tóxico
denominado per oxinitr ito, o qual está associado com o aumento da
r eabsor ção óssea alveolar em modelo exper imental de per iodontite em
r atos5 2.
O NO é um impor tante mediador citotóxico no micr oambiente ósseo
e, ju ntamente com citocinas e fator es de cr escimento, pode ser r esponsável
pela deficiente for mação óssea obser vada em sítios inflamatór ios cr ônicos,
visto que concentr ações elevadas de NO possuem um efeito citotóxico
significante sobr e células da linhagem osteoblást ica18
Dessa for ma, fica clar o que o NO apr esenta uma função
impor tante no metabolismo ósseo, modulando a atividade blástica e clástica
de acor do com sua concentr ação. Por outr o lado, o NO também apr esenta
impor tante papel imunor r egulador , sendo pr oduzido pelas e atuando sobr e
pr odução de NO por células T helper e sua par ticipação na modulação da
r esposta imune celular per manecem contr over tidas. Estudo in vitr o
demonst r ou pr odução de NO por células Th1, mas não por células Th2; além
disso, o NO inibiu a secr eção de IL-2 e INF-γ por células Th1 e não causou
nenhum efeito na pr odução de IL-4 por células Th28 9. De acor do com
TAYLOR-ROBINSON et al.89, o NO pr oduzido por células Th1 par ticipa de um
mecanismo de f eed-back negativo inibindo a pr odução de IL-2 e INF-γ,
pr evenindo, assim, a pr olifer ação de células Th1, de células CD8+ e de
macr ófagos; adicionalmente, as células Th2 pr olifer am na pr esença da
citocina IL-4, cuja pr odução não foi afetada por NO. De acor do com estes
achados, as células Th1 e Th2 podem ser distinguidas por difer entes padr ões
de citocinas pr oduzidas e difer ente susceptibilidade ao NO.
Em doenças inflamatór ias cr ônicas, como a inflamação asmática,
altas concentr ações de NO, mediada por iNOS, leva a uma inibição da
pr olifer ação de células Th1 com decr éscimo da pr odução de IL-2 e INF-γ,
r esultando em aumento do númer o de células Th2 com conseqüente elevação
da pr odução de IL-4, IL-5 e IL-107. Em adição, IL-4 pr oduzida por linfócitos
Th2, dentr e outr as funções, inibe a atividade da NOS e a síntese de NO por
macr ófagos mur inos ativados por INF-γ e LPS49.
Pode-se suger ir que a supr essão de células Th1 e de suas citocinas
IL-2 e INF-γ, por NO, r esultar á em uma maior susceptibilidade à infecção por
LPS; uma vez demonstr ado que r atos deficientes de iNOS apr esentar am
intensa r esposta Th1 com maior expr essão de INF-γ e menor de IL-4, o que
f oi demonstr ada inibição, mediada por NO, da pr olifer ação de ambos os
subtipos de linfócitos T helper90, bem como da secr eção de citocinas
associadas tanto com a r esposta Th1 (IL-2 e INF-γ) como Th2 (5, 10 e
IL-4) in vitr o8.
O NO também contr ibui par a a supr essão da r esposta imune
gr aças à inibição da expr essão pelos macr ófagos de moléculas classe II do
complexo maior de histocompatibilidade (MHC), pr ejudicando a apr esentação
ant igênica82. Esta imunossupr essão tem sido obser vada em amostr as de
per iodontite avançada humana16.
O óxido nítr ico é uma molécula mensageir a multifuncional
envolvida na r egulação da r esposta inflamatór ia com efeitos sobr e o
metabolismo ósseo e sobr e as r espostas imunes adaptativa e inata40 e, assim,
é capaz de contr ibuir com a destr uição tecidual pr esente em doenças
inflamatór ias cr ônicas. Esta citotoxicidade mediada por NO poder á ocor r er
em combinação com a sua capacidade de ativar metalopr oteinases, incluindo
colagenases e gelatinases, liber adas por macr ófagos ativados, PMNs e
f ibr oblastos r esidentes40,44,61,66,68. As metalopr oteinases (MMPs) são sintetizadas
e secr etadas na for ma inativa (pr oMMPs) e poster ior mente ativadas pelas
citocinas IL-1 e TNF-α, pelas endotoxinas bacter ianas, e pelo NO e seus
r eativos nitr ito e per oxinitr ito (ONOO-)61,66.
Polimor fonuclear es neutr ófilos sintetizam uma metalopr oteinase
denominada matr iz metalopr oteinase-8 (pr oMMP-8) ou pr ocolagenase
neutr ofílica humana, a qual desempenha um impor tante papel na
sintetizam NO, a par tir da enzima iNOS, estimulados por mediador es
inflamatór ios e LPS23,66,86,93. Assim, sob condições patológicas, o NO e seus
inter mediár ios NO2- e per oxinitr ito, sintetizados por PMNs, par ticipam da
ativação da MMP-8 pr eviamente secr etada por estas pr ópr ias células na sua
for ma inativa66.
Vár ios estudos suger em que a per iodontite apr esenta um
compor tamento cíclico, car acter izado por per íodos de exar cebação dur ante o
qual obser va-se pr ogr essiva per da óssea e destr u ição tecidual, seguida por
per íodos de r emissão68,91. Per íodos de pr ogr essiva destr uição tecidual
envolvem significante atividade pr oteolítica, com síntese, secr eção e ativação
de enzimas pr oteolíticas tais como MMP-1 ou colagenase inter sticial, MMP-8
ou colagenase neutr ofílica, MMP-3 e gelatinase 68,91. O aumento da expr essão
de MMPs está associado com a pr ogr essão da doença per iodontal68,91; todavia,
as vias de ativação das MMPs ainda não for am completamente esclar ecidas.
Adicionalmente, o NO e seus r eativos nitr ito e per oxinitr ito também
podem contr ibuir com a destr uição tecidual par ticipando da supr essão da
síntese de matr iz extr acelular88, da inibição da pr olifer ação fibr oblástica e
indução de apoptose nestas células in vitro2 7.
Na doença per iodontal, LOHINAI et al.5 2, em 1998, for am os
pr imeir os a estudar NO e obser var am a pr esença de iNOS em macr ófagos,
linfócitos e PMNs em per iodontites induzidas exper imentalmente em r atos;
demonstr ar am, ainda, que r atos tr atados com inibidor seletivo de iNOS
apr esentar am menor per da óssea adjacente à doença, quando se compar ava
pr esença de altos níveis de L-ar ginina e de L-citr ulina em tecido gengival de
pacientes com moder ada per iodontite, suger indo a pr odução e par ticipação
do NO na doença per iodontal humana.
Em lesões per iodontais humanas, a pr esença de iNOS foi
pr imeir amente demonstr ada por KENDALL et al.41, em 2000, com maior
expr essividade desta enzima em fibr oblastos, células inflamatór ias e células
epiteliais basais. Neste mesmo ano, LAPPIN et al.47 obser var am o aumento da
expr essão de iNOS em amostr as de per iodontites quando compar adas ao
gr upo contr ole de tecido gengival clinicamente saudável; neste estudo, os
autor es ver ificar am que as pr i ncipais fontes de iNOS nos tecidos per iodontais
er am os macr ófagos e células endoteliais, não obser vando imunomar cação
no epitélio, em linfócitos e PMNs.
Em adição, HIROSE et al.38, em r ecente estudo, obser var am
significante aumento da expr essão de IL-6 e iNOS em amostr as obtidas de
pacientes com per iodontite.
Em r esumo, o NO atua no metabolismo ósseo, estimulando
r eabsor ção óssea de acor do com sua concentr ação15,22,53,74, estimula a
pr odução e ativação de citocinas imunor r egulador as e de células T helper ,
par ticipando na modulação da r esposta imune adaptativa8,82,89,90,94, bem como
ativa metalopr oteinases e inibe a pr olifer ação de fibr oblastos27,61,66. Estes
fenômenos, nos quais o NO está envolvido, são também obser vados na
doença per iodontal cr ônica avanç ada; a r eabsor ção óssea, fenômenos
imunor r egulatór ios e degr adação de matr iz de colágeno estão dir etamente
há evidências da par ticipação deste gás na destr uição tecidual incluindo
r eabsor ção óssea, e em fenômenos imunopatológicos, sua função na doença
per iodontal não está completamente esclar ecida. Desta for ma, objetivamos
pesquisar as células que pr oduzem NO, assim como compar ativamente
obser var a expr essão de iNOS em difer entes estágios da doença per iodontal,
3 PROPOSIÇÃO
3 PROPOSIÇÃO
Consider ando a pr ovável par ticipação do NO na patogênese da
doença per iodontal humana, pr opusemo-nos, por meio da utilização de
imuno-histoquímica, identificar e quantificar :
Ø A expr essão da enzima óxido nítr ico sintase induzível (iNOS), em
gengivites associadas à placa bacter iana e per iodontites cr ônicas
4 MATERIAL E MÉTODO
4 MATERIAL E MÉTODOS
S
4.1 Seleção e caracterização da amostragem
4.1 Seleção e caracterização da amostragem
Par a este estudo, for am selecionadas 13 amostr as de tecido
gengival clinicamente saudável, pr ovenientes de plastia gengival após
exodontia de pr é-molar es com indicação or todôntica e de ter ceir os molar es
incluso s; 19 de Gengivite associada à placa dentobacter iana, or iundas de
gengivoplastias, sendo uma das amostr as pr oveniente de peça cir úr gica
r etir ada devido a pr esença de tumor odontogênico (selecionando mar gens
livr es do tumor ) e 19 de Per iodontite cr ônica localizada, or iundas de
cur etagem e/ ou excisão de bolsas per iodontais. Os casos r efer em-se a
espécimes enviados ao Ser viço de Anatomia Patológica do Depar tamento de
Estomatologia, Ár ea Patologia, da Faculdade de Odontologia de Baur u, da
Univer sidade de São Paulo, nos últimos dois anos. O diagnóstico final,
r ealizado pr eviamente, foi baseado nos aspectos micr oscópicos, seguindo a
classificação de PAGE; SCHROEDER71, consider ando -se também as
infor mações clínicas r elatadas pelo pr ofissional r equisitante como
localização e pr esença ou não de per da óssea (infor mações clínicas iniciais).
Com o objetivo de melhor car acter izar e classificar a amostr a,
for am obtidas infor mações clínicas adicionais mais detalhadas como: 1)
pr esença ou não de placa dentobacter iana em asso ciação ao tecido gengival;
2) aumento do contor no, consistência e color ação gengivais; 3) pr esença ou
(caso tal infor mação não tivesse sido pr eviamente r elatada); 5) br eve histór ia
médica e, 6) númer o de r egiões afetadas pela doença per iodontal.
A pr esença de per da óssea e placa dentobacter iana associada a um
quadr o micr oscópico e, ger almente, a um laudo já emitido de Doença
per iodontal em fase avançada de Page, ou seja, a pr esença de tecido
gengival intensamente infiltr ado por plasmócitos e linfócitos focalmente
distr ibuído e separ ado por tr avas de tecido conjuntivo fibr oso, em adição a
pr esença de pr ojeções epiteliais hiper plásicas com intensa exocitose,
per mitiu-nos consider ar tr atar -se de per iodontite cr ônica. For am
selecionadas as amostr as cor r espondentes a lesões localizadas, onde
apr oximadamente 4 a 10 sítios estavam afetados pela doença (<30%). Assim,
as amostr as selecionadas for am car acter izadas como per iodontites cr ônicas
localizadas.
Os quadr os micr oscópicos compatíveis com Doença per iodontal em
fase pr ecoce e fase estabelecida de Page, ou seja, a pr esença de tecido
gengival intensamente infiltr ado por linfócitos e plasmócitos or a em focos
separ ados por tr avas de tecido conjuntivo fibr oso, or a difusamente
distr ibuído na r egião subepitelial, puder am ser associados com a infor mação
clínica obtida poster ior mente quanto à pr esença de placa e ausência de
per da óssea, caso tal infor mação não tivesse sido r elatada na ficha clínica
inicial enviada com a peça cir úr gica. Assim, esta associação per mitiu a
Rar os casos apr esentavam incompatibilidade entr e os aspectos
micr oscópicos e a infor mação clínica quanto à per da óssea; os m esmos
for am r etir ados de nossa amostr agem.
Assim, com base nas infor mações clínicas iniciais e ou adicionais e
car acter ísticas micr oscópicas, as lâminas for am divididas em tr ês difer entes
gr upos exper imentais, denominados como gr upos I (Tecido gengival
clinicamente saudável - contr ole), II (Gengivite associada à placa
dentobacter iana) e III (Per iodontite cr ônica localizada). As amostr as de cada
gr upo for am analisadas, a par tir das r espectivas fichas clínicas, quanto a
aspectos ger ais do paciente como gêner o, idade e r aça, bem como a
pr ocedência das mesmas.
As amostr as consistir am de 13 casos de tecido gengival
clinicamente saudável (Gr upo I), 19 casos de gengivite associada à placa
bacter iana (Gr upo II) e 19 casos de per iodontite cr ônica localizada; houve
m aior pr evalência do gêner o feminino nos gr upos avaliados, sendo que a
pr opor ção foi de 7:6 no gr upo I, 14:5 no gr upo II e 15:4 no gr upo III.
Quanto à idade dos pacientes no momento do tr atamento,
obser vou-se que no gr upo I a idade var iou de 15 a 72 anos de idade, no
gr upo II a var iação ficou entr e 16 e 54 anos e no gr upo III apr esentou-se
entr e 19 e 74 anos. No que diz r espeito à r aça, houve gr ande pr evalência da
r aça br anca sobr e as demais r aças em todos os gr upos avaliados. E quanto à
pr ocedência das peças cir úr gicas, apr oximadamente 41% dos espécimes
for am enviados por docentes da Disciplina de Cir ur gia e Tr aumatologia
enviados por docentes e pós-gr aduandos do Depar tamento de Per iodontia da
Faculdade de Odontologia de Baur u, da Univer sidade de São Paulo (FOB-USP),
30% for am enviados por pr ofissionais de clínicas par ticular es e o r estante foi
enviado por pr ofissionais do Hospital de Reabilitação de Anomalias
Cr âniofaciais (HRAC - USP), bem como de outr as instituições. Estas
infor mações estão r epr esentadas no Quadr o 3 (Apêndice).
4.2 Técnica imuno
4.2 Técnica imuno--histoquímica
histoquímica
A par tir dos casos selecionados, emblocados em par afina,
r ealizar am-se cor tes ser iados com apr oximadamente 3 µm de espessur a, em
m icr ótomo (Leica); em seguida, estes for am estir ados em água e montados
em lâminas silanizadas (DAKO, S3003, Glostr up-Denmar k). Os cor tes sobr e
as lâminas silanizadas for am submetidos à técnica imuno -histoquímica do
tipo Imunoper oxidase (Avidina-Biotina-Peroxidase) par a identificação da
expr essão da enzima iNOS, cujos passos for am os seguintes:
Parte I
Parte I
1- Despar afinização e hidr atação dos cor tes, obedecendo à
seqüência:
a- xilol- 5 minutos
b- álcool absoluto I- 2 minutos
c- álcool absoluto II- 2 minutos
e- álcool etílico 95%- 2 minutos
f - lavagem em tampão fosfato (PBS) (Quadr o 1 – Apêndice)- 3
vezes.
2- Incubação em solução de per óxido de hidr ogênio (MERCK) a 3%
em PBS, por 40 minutos, par a o bloqueio da per oxidase
endógena.
3- Lavagem em PBS- 3 vezes.
4- Incubação, por 20 minutos, em tampão citr ato, pH 6,0 (SIGMA,
P4809, Saint Louis - USA) aquecido pr eviamente a 95oC, com
auxílio de Steammer Cuisine 700 HL-SPEED (T-FAL), par a
exposição antigênica.
5- Resfr iamento pr ogr essivo à temper atur a ambiente por
apr oximadamente 20 minutos.
6- Lavagem em PBS- 3 vezes.
7- Incubação em sor o de leite a 3% em água destilada (leite
desnatado Molico), por 20 minutos, par a o bloqueio das ligações
pr otéicas inespecíficas.
8- Incubação com os anticor pos policlonais de coelho anti-iNOS
humano (Santa Cr uz Biotechnology, SC-651, Califór nia – USA), a
uma diluição de 1:500 em PBS adicionado a sor o de albumina
bovino (PBS-BSA) a 1%, em câmar a úmida, a uma temper atur a
de 4oC, por no mínimo 18 hor as.
1- Lavagem r igor osa em PBS- 3 vezes.
2- Incubação com os anticor pos biotinilados de cabr a (1:100 em
PBS-BSA 1%) anti -IgG de camundongo/ coelho (DAKO, K0492,
Glostr up-Denmar k), por 1 hor a, à temper atur a ambiente.
3- Lavagem em PBS- 3 vezes.
4- Incubação com complexo avidina-biotina-per oxidase (DAKO,
K0492, Glostr up -Denmar k), por 45 minutos, à temper atur a
ambiente.
5- Lavagem em PBS- 3 vezes.
6- Revelação da r eação, utilizando 1 pastilha de 3.3’ – DAB
(diaminobenzidina) e 1 de ur éia de per óxido de hidr ogênio
(SIGMA - FAST, D4293, Saint Louis – USA) diluídas em solução de
10 ml de PBS, r esultando em 0,7 mg/ ml de DAB e 0,2 mg/ ml de
H2O2, por 5 minutos, à temper atur a ambiente e pr otegida da
luz.
7- Inter r upção da r evelação com incubação em água destilada (3
vezes).
8- Contr a-color ação com Hematoxilina de Mayer , por 5 a 7
m inutos, à temper atur a ambiente.
9 Lavagem, por 5 minutos, em água cor r ente.
10-Incubação, por 1 segundo, em água amoniacal (difer enciador ).
11-Lavagem imediata em água cor r ente, por 10 minutos.
12-Incubação em álcool 95%.
14-Incubação em xilol (4 vezes).
15-Montagem das lâminas, utilizando meio de montagem não
aquoso Per mount.
O contr ole negativo das r eações foi obtido pela substituição dos
anticor pos pr imár ios por PBS-BSA 1% ou por sor o nor mal de coelho (Dako,
K0902, Glostr up-Denmar k) a 1:500 em PBS-BSA 1%.
4.3 Análise Subjetiva
4.3 Análise Subjetiva
As lâminas submetidas à imuno-histoquímica for am avaliadas com
auxílio de um micr oscópio (CARL ZEISS, Ger many), quanto à intensidade do
infiltr ado inflamatór io, bem como às células inflamatór ias pr edominant es e
sua distr ibuição. Obser vou-se, também, a pr esença de células iNOS+, sua
localização, distr ibuição e intensidade de mar cação.
4.4 Análises Quantitativas
4.4 Análises Quantitativas
4.4.1 Contagem de células por mm
4.4.1 Contagem de células por mm
22O númer o de células iNOS+, assim como o númer o total de cé lulas
inflamatór ias, for am quantificados por meio de análise mor fométr ica,
utilizando micr oscópico óptico ao qual foi adaptado uma ocular Kpl (8x),
contendo um r etículo de integr ação (CARL ZEISS, Ger many). Utilizou-se uma
objetiva de 100x, r esultando em um aumento final de 800x. O diâmetr o (d)
cor r espondia a 0,15mm. Deter minou-se a ár ea do r etículo (A), pela expr essão
matemática: A= (π.d2)/ 4, consider ando π= 3,14; o que r esultou em A=
0,0176625mm2.
Par a cada amostr a, for am analisados 10 campos micr oscópicos
consecutivos (ár ea total = 0,176625mm2), pr ior izando os focos de infiltr ado
inflamatór io, com exceção do gr upo contr ole. Registr ou-se o númer o total de
células inflamatór ias e o númer o de células iNOS+ encontr ados na ár ea total
per cor r ida e dividiu-se este númer o por 0,176625mm2, obtendo-se o númer o
de células por milímetr o quadr ado (mm2).
4.4.2 Freqüência Relativa (Porcentagem)
4.4.2 Freqüência Relativa (Porcentagem)
As lâminas submetidas à imuno-histoquímica for am também
avaliadas quanto às por centagens de células iNOS+ em r elação ao infiltr ado
inflamatór io total, bem como de células mononuclear es (MNs) iNOS+ e PMNs
iNOS+. Utilizou-se par a esta análise o r etículo de integr ação de 25 pontos
(CARL ZEISS, Ger many), consider ando-se apenas as células coincidentes a
estes pontos. As pr opor ções for am expr essas em por centagens (médias e
desvios padr ão). Adicionalmente, for am obtidas as pr opor ções das
por centagens de PMNs:MNs iNOS+ e PMNs iNOS+:iNOS-.
Todas as contagens for am feitas por dois examinador es. As médias
4.5 Análise Estatística
4.5 Análise Estatística
As médias dos númer os de células iNOS+ por mm2 e r espectivos
desvios padr ão, obser vados em cada gr upo, for am analisados e tr abalhados
estatisticamente, por meio de Análise de Var iância (ANOVA) seguida pelo
teste de Tukey. As por centagens de MNs iNOS+, PMNs iNOS+ e total de células
iNOS+ for am analisadas e tr abalhadas estatisticamente, por meio do teste
Kr uskal Wallis seguido por teste de Dunn. O valor de p foi consider ado
5 RESULTADOS
5 RESULTADOS
Os r esultados ser ão demonstr ados de for ma descr itiva, bem como
por meio de Quadr os, Tabelas, Figur as e Gr áficos.
5.1 Análise Subjetiva
5.1 Análise Subjetiva
Grupo I
Grupo I-- Controle
Controle
Todos os cor tes micr oscópicos do gr upo contr ole demonstr ar am
mucosa bucal constituída por epitélio pavimentoso estr atificado
par aquer atinizado, algumas vezes hiper plásico. Subjacente, o tecido
conjuntivo fibr oso apr esentava-se discr etamente infiltr ado por células
inflamatór ias pr edominantemente mononuclear es, com distr ibuição difusa.
Obser vou-se, dentr e as células inflamatór ias, escassos polimor fonuclear es
neutr ófilos iNOS+, alguns deles no inter ior dos vasos sangüíneos (Figur as 1 e
2).
Grupo II
Grupo II-- Gengivite associada à placa bacteriana
Gengivite associada à placa bacteriana
Os cor tes micr oscópicos r efer entes aos casos de Gengivite
associada à placa bacter iana r evelar am mucosa bucal constituída por
epitélio pavimentoso estr atificado par aquer atinizado hiper plásico,
apr esentando na r egião do epitélio juncional pequenas pr ojeções e infiltr ação
epilélio, nota-se moder ado a intenso infiltr ado inflamatór io mononuclear e
polimor fonuclear distr ibuído or a aleator iamente, or a em focos separ ados por
tr avas de tecido conjuntivo fibr oso. As células iNOS+ estavam pr esentes no
infiltr ado inflamatór io pr incipalmente na r egião subepitelial, no inter ior do
epitélio sulcular (Figur a 4) e de vasos sangü íneos, e em íntimo contato com
biofilmes micr obianos. A imunomar cação par ecia ser quantitativamente
menor nos planos mais pr ofundos, distante dos focos de infiltr ado
inflamatór io, quando se compar ava com as ár eas mais pr óximas ao epitélio.
As células inflamatór ias polimor fonuclear es iNOS+ apr esentavam intensa
imunomar cação (Figur a 3 e 4). Per ifer icamente, notou-se a pr esença de
fr agmentos de biofilmes micr obianos em apr oximadamente 60% dos casos.
Grupo III
Grupo III -- Periodontite crônica localizada
Periodontite crônica localizada
Os cor tes micr oscópicos deste gr upo r evelar am mucosa bucal
constituída por epitélio pavimentoso estr atificado par aquer atinizado
hiper plásico com ár eas de intensa exocitose e desor ganização; na r egião do
epitélio da bolsa per iodontal notar am -se inúmer as pr ojeções epiteliais (Figur a
5A). Subjacente, no tecido conjuntivo fibr oso, foi obser vado um intenso
infiltr ado inflamatór io pr edominantemente linfoplasmocitár io subepitelial
(Figur a 5B) e distr ibuído em focos separ ados por tr avas de tecido conjuntivo
fibr oso (Figur a 6A). As células iNOS+ par eciam mais numer osas, em r elação
ao gr upo II, e estavam pr esentes difusamente nos focos de infiltr ado
inflamatór io, no inter ior de vasos sangüíneos, invadindo o epitélio da bolsa
com os biofilmes micr obianos. As células polimor fonuclear es iNOS+
apr esentavam intensa imunomar cação (Figur as 6B e 7). Não se obser vando
imunomar cação em células endoteliais, fusifor mes, epiteliais e
mononuclear es (Figur a 6B e 7). Per ifer icamente, obser vou-se a pr esença de
fr agmentos de biofilmes micr obianos (Figur a 8) e pequenos fr agmentos de
cemento nos casos examinados.
As pr incipais car acter ísticas micr oscópicas obser vadas nos tr ês
difer entes gr upos estão r epr esentados esquematicamente nas Figur as 9, 10 e
Fotomicr ogr afias de Tecido Gengival Clinicamente
FIGURA 1 – Amostr a de tecido gengival clinicamente saudável com discr eto infiltr ado inflamatór io pr edominantemente MN (A e B: Imuno-histoquímica, aumento or iginal = x100).
A
FIGURA 2 – Pr esença de escassas células PMNs iNOS+, no inter ior de
vasos sangüíneos (seta) (A e B: Imuno-histoquímica, aumento or iginal = x100).
A
Fotomicr ogr afias de Gengivite Associada à Placa
FIGURA 3 – Epitélio juncional com pequenas pr ojeções (setas) e moder ado infiltr ado inflamatór io pr edominantemente mononuclear . Obser vam -se ainda, dentina (**) e cemento (*). Em C, maior aumento do epitélio sulcular e células inflamatór ias pr esente s em B. (A, B e C: H.E., aumento or iginal = x12.5, x25 e x100, r espectivamente). Em D, obser va-se intensa mar cação par a iNOS em PMNs disper sos no infiltr ado inflamatór io (Imuno-histoquímica, aumento or iginal = x250).
FIGURA 4 – PMNs iNOS+ intensamente imunomar cados, pr esentes na
r egião subepitelial (A e C), na super fície do epitélio juncional (C e D), bem como no seu inter ior (B). Em C, maior aumento da fotomicr ogr afia D (Imuno-histoquímica, aumento or iginal = x250 – A, B e C, e x100 – D).
