A seguir, são apresentadas as principais metodologias bem como os reagentes, materiais e equipamentos utilizados na parte experimental desta pesquisa.
3.1 - Obtenção e Preparo da Matéria-Prima
O coco verde foi coletado em ponto de venda de água de coco na praia de Ponta Negra, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil. Foram selecionados o epicarpo e o mesocarpo do coco para utilização como fibra da casca de coco verde. No laboratório, a fibra foi cortada em pequenos pedaços com o auxílio de um facão; lavada com água destilada para remoção de compostos residuais nos materiais; seca a 50 °C por 72 horas em estufa com circulação de ar; moída (moinho Willye, TE – 680, Tecnal); peneirada com granulometria de 48 mesh e armazenada em recipientes plásticos.
3.2 - Pré-Tratamento
3.2.1 - Pré-tratamento Alcalino Diluído com e sem Tensoativo
A fibra de coco foi misturada na razão de 10% (m/v) com uma solução de hidróxido de sódio e submetida à 121 °C em autoclave (McIntosh et al., 2011). Visando analisar a influência do pré-tratamento alcalino diluído com e sem tensoativo na hidrólise enzimática, realizou-se um planejamento experimental 23 com triplicata no ponto central. O maior nível foi escolhido com base nas condições otimizadas para o pré-tratamento alcalino diluído do milho realizado por McIntosh et al. (2011) e com base na concentração do tensoativo Tween 80 referenciada por Qing et al. (2010). As variáveis e os níveis utilizados são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5 – Variáveis codificadas e níveis do planejamento fatorial 23 para o pré-tratamento alcalino diluído Variáveis Variáveis Codificadas Níveis -1 0 1 Concentração de NaOH % (m/v) X1 0 1,0 2,0 Concentração de Tween 80 % (m/m) X2 0 1,5 3,0 Tempo (min) X3 10 20 30
Após cada pré-tratamento, foram efetuadas 12 lavagens do material pré-tratado avaliando se o pH 7,0 era alcançado, em seguida, filtrou-se a fração sólida que foi armazenada para uso em hidrólise enzimática. De acordo com os resultados obtidos na hidrólise enzimática, a condição para o pré-tratamento que apresentou maior concentração de açúcares fermentescíveis (respostas do planejamento experimental) em 96 horas de hidrólise foi selecionada para realizar a caracterização do material e as demais etapas deste trabalho.
3.2.2 - Pré-tratamento Ácido Diluído com e sem Tensoativo
O pré-tratamento foi realizado com uma solução de ácido sulfúrico e a fibra de coco verde com razão de 15% (m/v). Essa mistura foi tratada em autoclave a 121°C (Sindhu et al., 2011). Visando analisar a influência do pré-tratamento ácido com e sem tensoativo na hidrólise enzimática, realizou-se um planejamento experimental 23 com triplicata no ponto central. O maior nível foi escolhido com base nas condições otimizadas para o pré-tratamento ácido diluído do bagaço de cana de açúcar realizado por Sindhu et al. (2011) e com base na concentração do tensoativo Tween 80 referenciada por Qing et al. (2010). As variáveis e níveis dos ensaios realizados são apresentados na Tabela 6.
Tabela 6 – Variáveis codificadas e níveis do planejamento fatorial 23 com o pré-tratamento ácido diluído. Variáveis Variáveis Codificadas Níveis -1 0 1 Concentração de H2SO4 % (m/m) X1 0 1,5 3 Concentração de Tween 80 % (m/m) X2 0 1,5 3 Tempo (min) X3 10 35 60
Após cada pré-tratamento, o material foi lavado 12 vezes verificando se a água de lavagem atingiu pH 7,0. Na sequência, o material foi armazenado à 4 ºC para uso posterior nos ensaios de hidrólise enzimática. De acordo com os resultados obtidos na hidrólise enzimática, a condição para o pré-tratamento que apresentou maior concentração de açúcares fermentescíveis em 96 horas de hidrólise foi selecionada para realizar a caracterização do material e as demais etapas deste trabalho.
3.3 - Lavagens dos materiais lignocelulósicos in natura e pré-tratados
As lavagens da biomassa in natura e após o pré-tratamento ocorreram por 15 minutos, a temperatura ambiente, em béquer que continha água destilada sob agitação de 150 rpm fornecida por agitador mecânico (Tecnal, modelo TE-139). Para cada uma das 12 lavagens, foi utilizado o volume de água de 200 mL para 15,0 g de material inicialmente submetido ao pré- tratamento, verificando se o pH neutro era atingido.
Para cada lavagem, amostras da água de lavagem foram coletadas para análises usando- se Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para quantificar os açúcares (glicose, xilose, arabinose), ácidos (acético e fórmico) e outros compostos inibitórios (furfural e HMF) liberados. Ao final, o material foi filtrado e a fração sólida, armazenada em geladeira a 4°C para uso em hidrólise enzimática.
Para os ensaios realizados nas seções 3.2.1 e 3.2.2, a lavagem foi total, ou seja, o substrato foi lavado 12 vezes com água e mantido úmido para uso na hidrólise enzimática. Adicionalmente, para os substratos que apresentaram os melhores resultados de hidrólise enzimática nos planejamentos, a lavagem foi realizada de forma fracionada para avaliar a etapa de lavagem no pós-tratamento. Nessa etapa, a cada três lavagens os mesmos foram separados para uso na etapa de hidrólise enzimática conforme ilustrado na Figura 9.
A cada três lavagens, a perda de massa durante o pré-tratamento e lavagem foi calculada em relação à massa inicial do material antes do pré-tratamento, conforme a Equação (1).
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 (%) = (𝑀𝑓𝑝
𝑀𝑖𝑝) 𝑥 100 (1)
Sendo:
Rendimento (%) = percentual do rendimento mássico do pré-tratamento; Mip (g) = massa inicial em base seca antes do pré-tratamento;
Figura 9 – Fluxograma da lavagem fracionada
3.4 - Caracterização química e física dos materiais lignocelulósicos in natura
e pré-tratados
De acordo com os resultados obtidos nas seções 3.2.1 e 3.2.2, foram selecionados os substratos para serem caracterizados. De maneira geral, foram caracterizados os materiais:
(1) In natura;
(2) Pré-tratado com ácido diluído e tensoativo (Ensaio 7); (3) Pré-tratado com ácido diluído sem tensoativo (Ensaio 5); (4) Pré-tratado com alcalino diluído e tensoativo (Ensaio 4); (5) Pré-tratado com alcalino diluído sem tensoativo (Ensaio 2).
3.4.1 - Determinação de Sólidos Totais
A metodologia usada foi a de Sluiter et al. (2008): NREL - Determination of Total Solids
in Biomass. Cerca de 2,0 g de fibra foram pesadas em uma cápsula de porcelana previamente
esse período, o material foi mantido em dessecador e pesado novamente. A umidade foi determinada em triplicata e calculada conforme a Equação (2):
𝑼𝒎𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 (%) = (1 − 𝑀𝑠𝑒𝑐𝑎
𝑀ú𝑚𝑖𝑑𝑎) 𝑥 100
(2)
Sendo:
Umidade (%) = percentual de umidade
Mseca (g) = massa seca do material constante obtida pela diferença entre a massa do conjunto depois da estufa e a massa da cápsula;
Múmida (g) = massa úmida obtida pela diferença entre a massa do conjunto antes de ser levado para estufa e a massa da cápsula.
3.4.2 - Determinação de extraíveis
Para a determinação de extraíveis utilizou-se o método adaptado de NREL -
Determination of Extractives in Biomass (Sluiter et al., 2005a). 2,0 g de material foram
submetidos a um tratamento em um aparelho de Soxhlet, utilizando os reagentes água deionizada e álcool etílico 95% em temperaturas de 120 e 80 °C, respectivamente, durante 24 horas. Para ambos, o volume dos reagentes utilizados foi de 70,0 mL.
Após o processo extrativo, o tubo contendo o material foi mantido em estufa à 105 °C durante 24 horas e, em seguida, pesado. A porcentagem de extraíveis foi calculada com base na diferença de massa, conforme a Equação (3):
𝑬𝒙𝒕𝒓𝒂í𝒗𝒆𝒊𝒔 (%) = (𝑀𝑡𝑢𝑏𝑜+𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑣𝑒𝑖𝑠− 𝑀𝑡𝑢𝑏𝑜
𝑀𝑠𝑒𝑐𝑎 ) 𝑥 100 (3)
Sendo:
Extraíveis (%) = percentual de extraíveis;
Mtubo+extraíveis (g) = massa do tubo Soxhlet com extraíveis após a extração; Mtubo (g) = massa do tubo Soxhlet antes da extração;
3.4.3 - Determinação de polissacarídeos
3.4.3.1 - Hidrólise com H2SO4 (72%)
Utilizou-se o método da NREL- Determination of Structural Carbohydrates and Lignin
Biomass (Sluiter et al., 2008a) para determinar os polissacarídeos dos materiais
lignocelulósicos. Dessa forma, 0,3 g de material isento de extraíveis foi transferido para um Erlenmeyer de 125 mL e tratada com 3,0 mL de H2SO4 72% em banho-maria a 30 ± 3°C durante 1h, usando um bastão de vidro para agitar a mistura a cada 10 min. A reação foi interrompida com adição de 84,0 g de água deionizada, agitando-se cuidadosamente a mistura. Em seguida, a solução foi autoclavada a 121°C e 1,0 atm durante 1h. Os ensaios foram realizados em quintuplicata.
Após o tratamento térmico, o material hidrolisado foi filtrado utilizando-se papel filtro seco e previamente tarado. O hidrolisado foi armazenado em tubos Eppendorfs e estocados em geladeira, para a realização das análises por CLAE. A fração sólida contida no papel filtro foi lavada com 100,0 mL de água deionizada e seca a 105°C por 24 horas para uso na determinação de lignina insolúvel presente no material (seção 3.4.4).
3.4.4 - Determinação de Lignina Insolúvel
Para determinar o teor de lignina insolúvel do material retido no papel de filtro após a hidrólise ácida 72% (seção 3.4.3.1), transferiu-se o resíduo com o papel de filtro para um cadinho de porcelana previamente tarado e calcinou-se a amostra. A temperatura de calcinação foi elevada lentamente até 300°C para evitar a expansão do material no interior da mufla e, posteriormente, mantida a 800°C por mais duas horas. Após esse período, o cadinho foi transferido cuidadosamente para um dessecador, onde foi mantido até atingir a temperatura ambiente. Então, quantificou-se a massa do cadinho juntamente com o material calcinado (Sluiter et al., 2008a). Em seguida, calculou-se o teor de lignina na amostra de acordo com a Equação (5).
𝑳𝒊𝒈𝒏𝒊𝒏𝒂 (%) = [(𝑀𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠+𝑝𝑝𝑓−𝑀𝑝𝑝𝑓)−(𝑀𝑐𝑎𝑑+𝑐𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠−𝑀𝑐𝑎𝑑)
𝑀𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 ] 𝑥 100 (5)
Sendo:
Msólidos+ppf (g) = massa dos sólidos com papel filtro (seca) após lavagem (seção 3.4.3.1); Mppf (g) = massa do papel filtro tarado para filtragem (seção 3.4.3.1);
Mcad+cinzas (g) = massa do cadinho com cinzas após a calcinação; Mcad (g) = massa do cadinho tarado antes da calcinação;
Mmaterialinicial (g) = massa da fibra (seca) utilizada para fazer hidrólise ácida 72% (seção 3.4.2).
3.4.5 - Determinação do Teor de Cinzas Totais
Para a determinação das cinzas totais foi aplicada a metodologia da NREL -
Determination of Ash in Biomass (Sluiter et al., 2005b), na qual foram adicionados 2,0 g da
fibra de coco em cadinho de porcelana previamente tarado. O material foi gradativamente aquecido em mufla à 300 °C e calcinado à 800 °C por duas horas. Por diferença de massa, o teor de cinzas totais foi determinado de acordo com a Equação (4).
𝐂𝐢𝐧𝐳𝐚𝐬 (%) = (𝑀𝑐𝑎𝑑𝑖𝑛ℎ𝑜+𝑐𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠−𝑀𝑐𝑎𝑑𝑖𝑛ℎ𝑜
𝑀𝑎 ) 𝑥 100 (4)
Sendo:
Cinzas (%)= percentual em massa de cinzas;
Mcadinho (g) = massa do cadinho antes da calcinação da amostra; Mcadinho+cinzas (g) = massa do cadinho com as cinzas após a calcinação; Ma (g) = massa da amostra seca (base seca) antes da calcinação.
3.4.6 - Análise do Hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A CLAE foi usada para identificação dos carboidratos e ácidos orgânicos presentes no hidrolisado, usando-se o cromatógrafo (Acela, Thermo Scientific) e a coluna Shim-Pack SCR- 101H (Shimadzu Co., Japan) que operou a uma temperatura de 65 °C. A fase móvel consistiu de uma solução de ácido sulfúrico 5,0 mM com uma vazão de 0,6 mL/min. Um volume de 20,0 µL da amostra foi injetado na coluna. As amostras foram previamente filtradas em membranas de 0,22 µm para remoção de partículas no hidrolisado.
Para obtenção das concentrações dos componentes monoméricos foram utilizadas curvas de calibração pré-definidas para cada componente analisado. Os fatores de conversão
Tabela 7 - Componentes presentes no hidrolisados e seus respectivos fatores de conversão.
Componente Fator de Conversão
Celobiose 0,95 Glicose 0,90 Xilose 0,88 Arabinose 0,90 Ácido Acético 0,72 HMF 1,20 Furfural 1,37 Fonte: Pitarelo (2007).
Para o cálculo dos teores de celulose e hemicelulose, contabilizou-se uma soma ponderada entre as concentrações de cada componente multiplicado pelo seu fator de conversão conforme a Equação (6).
𝐶𝑓 = ∑ 𝑓𝑖 𝑖 𝑥 𝐶𝑖 (6)
Sendo:
Cf (mg/mL) = concentração final de celulose ou hemicelulose; fi = fator de conversão do componente i;
Ci (mg/mL) = concentração do componente i.
3.4.7 - Análise de Difração de Raios-X e Cristalinidade
Análise de difração de raios-X foi realizada nos materiais lignocelulósicos in natura e pré-tratados utilizando o difratômetro de raios-X (modelo XRD-6000, Shimadzu, Japão) pertencente ao Departamento de Engenharia de Materiais localizado na UFRN. A análise foi realizada com radiação Kα de cobre, voltagem de 40 kV, corrente elétrica de 30 mA e velocidade de 2,0 graus por minuto utilizando varredura contínua de ângulo 2θ de 10,0 a 80,0, conforme procedimento adotado por Gonçalves (2014).
O índice de cristalinidade (ICr) foi determinado de acordo com a Equação (7) (Gabhane et al., 2011).
𝑰𝑪𝒓(%) = (𝐼002−𝐼𝑎𝑚
Sendo:
ICr (%) = percentual do índice de cristalinidade;
I002 = intensidade do pico no plano cristalográfico 002 (2θ, ~22,6°);
Iam = intensidade do vale entre os picos dos planos cristalográficos 002 e 001 (2θ, ~18,7°).
3.4.8 - Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A superfície dos materiais lignocelulósicos in natura e pré-tratados foi analisada no microscópio Hitachi (modelo TM3000) localizado no Departamento de Engenharia de Materiais da UFRN. Foram capturadas imagens das regiões de degradação da fibra do material, principalmente, para fins comparativos entre amostras in natura e as amostras que foram pré- tratadas.
3.4.9 - Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
Os espectros de FTIR dos materiais lignocelulósicos in natura e pré-tratados foram medidos num espectrômetro FTIR (FTLA 2000 series, ABB Bomem Inc., Canadá). As condições de análise foram em resolução 4 cm-1, na região de 400-4000 cm-1.
3.5 - Determinação da atividade enzimática
As atividades enzimáticas são expressas em UI (µmol de produto liberado por minuto) conforme a Equação (8) a seguir.
𝑼𝑰 =𝐷𝑖 𝑥 𝛥𝐴𝑏𝑠 𝑥 𝐹𝑎𝑡 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑇
𝑡 (8)
Sendo:
UI (µmol/min) = a atividade enzimática da enzima;
Di = diluição da solução de enzima, somente se necessária;
ΔAbs = variação de absorbância entre a absorbância da amostra e do tempo zero; Fat (µmol/mL) = fator obtido da curva padrão;
VolT (mL) = volume total da mistura reacional; t (min) = tempo da reação.
A concentração da atividade enzimática é expressa em UI/mL, conforme a Equação (9):
[𝑬𝒏𝒛] =𝑉𝑜𝑙𝑆𝑈𝐼 (9)
Sendo:
[Enz] (UI/mL) = a concentração da atividade enzimática; UI (µmol/min) = a atividade enzimática;
VolS (mL) = o volume do sobrenadante.
3.5.1 - Atividade enzimática utilizando papel de filtro como substrato (FPase)
A concentração de atividade enzimática do complexo enzimático celulolítico de
Trichoderma reesi (Cellulase from Trichoderma reesi ATCC 26921) foi expressa em unidades
de papel filtro (FPU) por mL segundo Ghose (1987).
Tiras de aproximadamente 1,0 x 6,0 cm de papel de filtro Whatman nº1, enroladas em forma espiral, foram imersas em tubos de ensaio contendo previamente 1,0 mL de solução de tampão citrato de sódio (50 mM, pH 4,8). Os tubos foram colocados em banho-maria a 50 ºC por 1,0 min, antes da adição do sobrenadante (solução do complexo enzimático) para equilíbrio da temperatura. Em seguida, 0,5 mL da solução do complexo celulolítico foi adicionado, em cada tubo, ocorrendo à reação a 50 ºC por 60 min. Após o tempo de incubação e imersão em banho de gelo, 0,5 mL da mistura reacional foi transferida para tubos contendo 0,5 mL do reagente DNS. Após agitação no vórtex, a mesma foi mantida em água fervente por 5 minutos e, em seguida, resfriada a temperatura ambiente, completando-se o volume para 5,0 mL com água destilada em cada tubo (Miller, 1959). A absorbância da solução foi medida em comprimento de onda 540 nm e a concentração de açúcares redutores foi determinada, usando uma curva de calibração onde glicose foi utilizada como padrão. Esses ensaios foram realizados em duplicata. O tempo zero para determinação da concentração inicial de açúcares redutores no sobrenadante consistiu em se adicionar 0,5 mL da solução de enzimas em tubos contendo 1,0 mL da solução de tampão citrato de sódio (50 mM, pH 4,8)e, após agitação, transferiu-se 0,5 mL dessa solução obtida para tubos contendo 0,5 mL do reagente DNS. Então, foi repetido o mesmo procedimento para determinação de açúcares citado anteriormente. O branco, utilizado para zerar o espectofotômetro, consistiu da mistura de 0,5 mL de tampão citrato (50 mM, pH 4,8)e 0,5 mL de DNS.
3.5.2 - Atividade enzimática da β-glicosidase
A determinação da concentração de atividade enzimática da β-glicosidase foi realizada reagindo 1,0 mL da solução do complexo celulolítico com 1,0 mL de solução de celobiose 15,0 mM, preparada em tampão citrato de sódio (50 mM, pH 4,8) em banho-maria a 50 ºC por 30 min. Decorrido o tempo reacional, os tubos de ensaio foram mantidos por 5 minutos em água fervente e, em seguida, resfriados em banho de água fria.
A concentração de glicose foi feita usando um kit de análise de concentração de glicose baseado na reação das enzimas glicose oxidase-peroxidase. Assim, 10,0 μL da mistura reacional foram pipetados em tubos de ensaio contendo 1,0 mL do reagente de glicose oxidase-peroxidase (BioSystems®). Os tubos foram incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente (25°C), tempo no qual ocorre a reação enzimática. A coloração formada foi analisada no espectrofotômetro a 500 nm.
Para se determinar a concentração inicial de glicose na solução de enzimas, tomou-se se o tempo zero que consistiu em adicionar 1,0 mL do sobrenadante em tubos contendo 1,0 mL de tampão citrato de sódio (50 mM, pH 4,8). Em seguida, pipetaram-se 10,0 µL dessa mistura em 1,0 mL do reagente de glicose oxidase-peroxidase para posterior leitura da absorbância. Para zerar o equipamento, 1,0 mL do reagente de glicose foi utilizado.
3.5.3 - Atividade enzimática da xilanase
A determinação da concentração de atividade enzimática da xilanase realizou-se utilizando uma solução de xilana (1,0%) em solução de tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,0). O ensaio enzimático foi realizado misturando-se 0,5 mL do sobrenadante contendo a xilanase com 1,0 mL da solução de xilana (previamente incubada a 50 °C por 5 min). A reação ocorreu durante 5 min em uma temperatura de 50 °C. Em seguida, 0,5 mL dessa mistura reacional foi transferido para tubos contendo 0,5 mL de DNS. Os tubos foram imersos em água fervente por 10 min e, após o resfriamento, o volume foi completado para 5,0 mL com água destilada. Analisaram-se as leituras de absorbâncias a 540 nm (Miller, 1959).
Uma mistura de 0,5 mL do sobrenadante e 0,5 mL do tampão de acetato de sódio foi realizada para determinação do tempo zero. Posteriormente, 0,5 mL dessa mistura foi transferido para tubos contendo 0,5 mL de DNS e seguiu-se o procedimento de determinação de açúcares redutores segundo o método DNS.
Para o branco do espectrofotômetro usou-se uma mistura de 0,5 mL da solução de xilana 1% e 0,5 mL de reagente DNS.
3.6 - Hidrólise enzimática
As hidrólises enzimáticas da fibra de coco pré-tratada e in natura foram realizadas segundo Yang et al. (2014). O extrato enzimático comercial Celulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 foi utilizado para a hidrólise. A carga de sólidos da hidrólise enzimática foi de 5% (m/v). Em Erlenmeyers de 250 mL juntamente com os sólidos, adicionaram-se o tampão citrato de sódio (50 mM, pH 4,8) e uma solução de azida de sódio à 0,01% (m/v) (Chang et al., 2011) para prevenir crescimento microbiano durante a hidrólise. As cargas enzimáticas foram de 20,0 FPU/g de fibra, 20,0 CBU/g de fibra e 10,0 FXU/g de fibra. Realizaram-se os ensaios em incubador rotatório sob agitação de 150 rpm, a 50 °C e durante 96 h. As amostras coletadas foram levadas ao banho de água fervente por 5 min para inativar as enzimas e, portanto, finalizar a reação. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 10000 rpm durante 15 min. A fração líquida foi filtrada em membranas de 20,0 µm e armazenadas a -20 °C para determinação de açúcares. Os ensaios foram realizados em duplicata.
Os pontos da hidrólise foram coletados no tempo zero e após 96 h e quantificaram-se os açúcares redutores totais pelo método DNS (Miller, 1959) e os açúcares (glicose, xilose, arabinose), ácidos (acético e fórmico) e outros compostos inibitórios (furfural e HMF) através de CLAE.
As conversões celulósicas do material foram calculadas usando a Equação (10) (Zhou et
al., 2015).
𝑪𝒐𝒏𝒗𝒆𝒓𝒔ã𝒐 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍ó𝒔𝒊𝒄𝒂 (%) = (𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑑𝑎 (𝑔) 𝑥 0,9
𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝑔) ) 𝑥 100 (10)
Sendo:
Glicose produzida (g) = volume utilizado na hidrólise (L) versus glicose (g/L);
Celulose inicial (g) = massa do material em base seca versus quantidade inicial de celulose presente no material.
3.7 – Análises estatísticas
As análises estatísticas dos resultados dos planejamentos experimentais deste trabalho foram realizadas utilizando o software Statistica 7.0. Através deste, obtiveram-se os gráficos de superfície de respostas, os diagramas de Pareto, os dados da ANOVA e as equações dos modelos.