Os dados obtidos da análise histométrica, referentes à extensão linear da raiz, em milímetros, e à área da lesão, em milímetros quadrados, apresentados na tabela A1 do Apêndice A, foram transformados em valores porcentuais, respectivamente, em relação à extensão linear total da raiz e em relação à área total da lesão (tabela A2, do Apêndice A). Com esta transformação, procurou-se minimizar a interferência do tamanho dos dentes no resultado das análises.
Baseado no delineamento do estudo, no qual há três tratamentos diferentes, aplicados aleatoriamente nos dentes dos cães, e mais de uma variável medida em cada unidade experimental (dente), o procedimento estatístico considerado mais adequado foi a análise de variância multivariada, seguido, se necessário, por análises de variância univariadas. A análise multivariada permite a comparação simultânea das médias populacionais, mantendo inalterada a magnitude da taxa escolhida de erro tipo I, o que não aconteceria se fossem empregadas diversas análises univariadas para essa mesma comparação conjunta das médias. Além disso, a análise de variância multivariada leva em consideração as correlações entre as variáveis.
A análise multivariada foi desenvolvida para provar diferenças entre os três grupos G1, G2 e G3, com base nos testes de Lambda de Wilks e o R de Rao. Estabeleceu-se o nível de 5% de significância, que representa a probabilidade de se cometer um erro do tipo I, isto é, errar ao se afirmar que há algum efeito entre os grupos de tratamentos.
A validade da análise de variância depende de que os dados representem amostras aleatórias da população de interesse e que as observações, nas diversas unidades experimentais, sejam independentes. Essas condições se verificaram neste trabalho. Outra pressuposição é a de normalidade, tanto multivariada quanto nas variáveis individuais. No entanto, o número reduzido de unidades experimentais para cada grupo, não permitiu uma verificação rigorosa da normalidade. Ela, então, foi analisada apenas graficamente, já que afastamentos da normalidade afetam levemente a taxa de erro do tipo I.
Além dessas condições, a análise de variância multivariada pressupõe que haja igualdade de variância entre todos os grupos de dados, tal como na análise univariada, e também que a correlação entre duas variáveis quaisquer seja a mesma em todos os grupos de dados, conhecida como suposição de mesma covariância. Diz-se que é necessário ter uniformidade da matriz de variâncias e covariâncias. Essa condição de uniformidade foi colocada a prova pelo teste de Box M.
Como a soma de quatro variáveis de extensão linear da raiz (formação cementária, tecido conjuntivo, migração epitelial e superfície livre) totalizou 100%, pois representam frações da extensão total, o procedimento da análise multivariada não poderia ser aplicado, devido à existência de colinearidade na matriz de variâncias e covariâncias. Então se desconsiderou a variável que aparentou ser a menos importante na análise dos dados. Analogamente, a soma das três variáveis de área da lesão (tecido ósseo, região vazia e tecido mole) também totaliza 100% e uma delas foi desconsiderada da análise.
Fig. 1. Criação cirúrgica dos defeitos de furca.
Fig. 2. Adaptação das membranas fechando as entradas de furca.
Fig. 3. Sutura dos retalhos.
Fig. 4. Período de cicatrização após 90 dias.
Resultados
Observações Clínicas
Durante os 90 dias de cicatrização, um dos animais foi excluído do estudo por ter apresentado problemas sistêmicos. Nos demais cães, as áreas tratadas cicatrizaram-se sem nenhuma intercorrência. No momento do sacrifício observou-se clinicamente a presença de recessão gengival (figura 4), variando de 1 a 3mm expondo a entrada das furcas em todos os dentes, exceto em um dente do grupo G2. Durante o processamento histológico houve a perda de um elemento dentário.
Desta forma, para a análise histológica descritiva e histométrica, foram utilizados sete dentes do grupo G1, sete dentes do grupo G2 e cinco dentes do grupo G3, totalizando 19 dentes.
Análise Histológica Descritiva
As principais características microscópicas das regiões dos defeitos de furca foram abordadas e descritas de acordo com o tratamento realizado. Para a realização da análise histológica descritiva, as lâminas foram codificadas de acordo com o animal e grupo, de forma que o patologista não tivesse conhecimento a que grupos pertenciam.
Grupo Teste 1 (Figuras 5 e 6)
As marcas produzidas cirurgicamente na superfície radicular, na base do defeito, estavam parcial ou totalmente revestidas por cemento celularizado neoformado. A partir da “marca”, a neoformação cementária mostrou-se heterogênea, variando em espessura e altura.
Justapondo-se ao cemento, encontravam-se células mononucleares formando camada única, sugestiva de cementoblastos. Em continuidade, observava-se feixe de fibras de colágeno de variável espessura, que se unia ao cemento neoformado. Em alguns dentes observava -se neoformação óssea vizinha a estes feixes colágenos, limita da à região da “marca” radicular, na base do defeito. Na região superior da lesão, os feixes de fibras de colágeno eram mais delgados e entremeados por intenso infiltrado inflamatório composto por células mononucleares ou fibroblastos, figuras vasculares de diversos calibres e paredes delgadas.
O tecido conjuntivo formava papilas que se interdigitavam com o epitélio pavimentoso estratificado, de variável espessura e extensão.
Próximo ou junto ao teto da furca observou-se variável quantidade de tecido amorfo, sugestivo de placa bacteriana.
Grupo Teste 2 (Figuras 7 e 8)
O teto da furca exibia variável quantidade de placa bacteriana, que se caracterizava como uma massa amorfa, acelular. Subjacente, observava-se tecido epitelial e tecido conjuntivo composto por feixes de fibras de
colágeno de diversas espessuras. Na porção superior próxima ao epitélio e na periferia da lesão, a densidade fibrótica era menor que no centro e na base da lesão.
Entremeando-se com as fibras colágenas, o tecido conjuntivo exibia processo inflamatório mononuclear variando de escasso a moderado, células fusiformes, figuras vasculares de diversos calibres e parede delgada.
Em alguns espécimes observavam-se trabéculas ósseas neoformadas, que se anastomosavam entre si, e limitavam-se ao centro da lesão.
Havia neoformação de cemento na área marcada, de característica celular e que em alguns espécimes, estendia -se até o terço médio da lesão.
Um único espécime apresentou neoformação óssea em toda porção apical e média da lesão, acompanhando a neoformação cementária e apresentando espaço periodontal regular ocupado por fibras colágenas sugerindo novo ligamento periodontal.
Grupo 3 Controle (Figuras 9 e 10)
Neste grupo, o tecido epitelial estava presente, exibindo-se com variável espessura. Do mesmo modo, a reação inflamatória subjacente, composta principalmente por células mononucleares, também mostrava-se variando de branda a moderada intensidade, que parecia ser resultante da presença de placa bacteriana presente no teto da furca. O tecido conjuntivo era denso na região central da lesão, composto por feixes de fibras de colágeno mais compactos
entremeados por células fusiformes e estruturas vasculares pequenas. Nas áreas laterais e superiores mais próximas das estruturas mineralizadas, a densidade de fibras de colágeno era menor.
A neoformação cementária foi heterogênea, ocupando total ou parcialmente a área de marcação experimentalmente, com característica celular e altura variada. A neoformação óssea limitou-se a área da “marca” radicular em alguns espécimes.
Figura 5. Grupo G1 – Vista panorâmica da área da lesão de furca induzida experimentalmente e tratada com Proteína derivada da matriz do esmalte, vidro bioativo e membrana. Observa-se neoformação cementária e óssea próximas à “marca” radicular (M), tecido conjuntivo de granulação (CJ) até o terço médio, recoberto por epitélio pavimentoso estratificado (E). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (40X).
Figura 6. Grupo G1 – Detalhe da figura anterior, mostrando área da “marca” (M) induzida experimentalmente. Observa-se neoformação de cemento celular (CE) óssea (O), interpostos por fibras colágenas inseridas em ambos, sugerindo novo ligamento periodontal (LP). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (100X).
Figura 7. Grupo GII – Visão panorâmica da área da lesão induzida experimentalmente e tratada com Emdogain® e membrana. Observava -se tecido conjuntivo fibroso (CJ), recoberto por epitélio (E) com moderada hiperplasia, estruturas vasculares e pontos de inflamação (I). Na área da “marca” (M), observa-se neoformação cementária e óssea. Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (25X).
Figura 8. Grupo GII – Maior aumento da figura anterior mostrando área “marcada” (M), com neoformação de cemento celular (CE), novo ligamento periodontal (LP) neoformação óssea (O). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (100X).
Figura 9. Grupo GIII – Visão panorâmica da área da lesão de furca induzida experimentalmente e tratada com vidro bioativo e membrana. Considerável formação óssea e cementária, próximo a “marca” (M), com tecido conjuntivo fibroso (CJ), inúmeras figuras vasculares, e processo inflamatório (I)
subjacente ao epitélio (E) com moderada hiperplasia, áreas negativas, sugerindo presença de Biomaterial (B). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (40X).
Figura 10. Grupo GIII – Detalhe da região marcada (M), mostrando neoformação de cemento celular (CE), tecido conjuntivo (CJ) sugestivo de neoformação do ligamento periodontal e tecido ósseo neoformado (O). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (100X).
Análise Estatística Dos Dados Histométricos
Na tabela A1 do Apêndice A são apresentados os dados para a análise histométrica referentes às variáveis de extensão linear da raiz (Cemento, Conjuntivo, Epitélio, Livre e Regeneração), em milímetros, e às variáveis de área da lesão (Tecido ósseo, Região vazia e Tecido mole), em milímetros quadrados, para avaliação dos três grupos de experimentos: G1, G2 e G3. As figuras B1 e B2 do Apêndice B contêm as representações gráficas da dispersão dos dados, segundo os três grupos de tratamento, respectivamente, para as variáveis de extensão linear da raiz e de área da lesão. Alguns desses dados são discrepantes dos demais, tanto em variáveis de extensão como em variáveis de área da lesão, comprometendo a validade de normalidade dos dados e de uniformidade da matriz de variâncias e covariâncias. O teste de Box M, para este caso, cujo resultado é apresentado na tabela C1 do Apêndice C, mostra que para as variáveis de área da lesão não há uniformidade da matriz de variâncias e covariâncias.
Em vista do exposto, dois dados foram considerados discrepantes dos demais e excluídos da análise. Assim, o resultado apresentado a seguir não contém os dados discrepantes (G2/482/3D e G3/482/4D nas tabelas do Apêndice A) e, agora, considerou-se que a normalidade pode ser aceita, e algum afastamento dela não afetaria a análise. O teste de Box M, cujo sumário se encontra na tabela C2 do Apêndice C, indicou que a uniformidade da matriz de variâncias e covariâncias pode ser considerada aceitável, ao nível de 5% de significância.
Na tabela 1 são dadas as médias e desvios padrão para os valores porcentuais das variáveis de extensão linear da raiz: Cemento, Conjuntivo, Epitélio, Livre e Regeneração. Na tabela 2, para essas mesmas variáveis, são dados os coeficientes de correlação. Algumas variáveis têm grau de correlação muito alto, justificando a análise multivariada para a avaliação dos grupos de tratamentos.
A análise de variânc ia multivariada, cujo sumário é apresentado na tabela 3, não indicou diferença significativa entre as médias dos grupos (p=0,6822), de modo que não há evidência estatística de que algum tratamento seja diferente de um outro. Pode -se verificar pela tabela C3 do Apêndice C que nenhuma análise de variância univariada para a comparação das médias dos grupos, separadamente para cada variável de extensão linear da raiz, foi significativa. A figura 11 permite uma avaliação visual deste resultado, apesar da aparente tendência da extensão linear livre de aumentar do grupo G1 para G3.
As médias e desvios padrão relativos aos três grupos de tratamentos, considerando as variáveis da área da lesão: Tecido ósseo, Região vazia e Tecido mole, são dados na tabela 4. Os coeficientes de correlação na tabela 5 e o sumário da análise de variância multivariada na tabela 6. O resultado é totalmente análogo ao resultado da comparação dos grupos de tratamentos relativamente às variáveis de extensão linear, ou seja, não se observou diferença significativa entre as médias de qualquer dos grupos de tratamento.
Os gráficos da figura 12 representam as médias dos valores porcentuais das variáveis de área da lesão, segundo o grupo de tratamento. Aqui
também a aparente diferença entre as médias não têm significância estatística. Aliás, nenhuma análise de variância univariada para a comparação de médias de grupos, separadamente para cada variável, mostrou diferença significativa entre as médias (tabela C3 do Apêndice C).
Tabela 1. Médias e desvios padrão (DP) para os valores porcentuais relativos a extensão linear da raiz: Cemento, Conjuntivo, Epitélio, Livre e Regeneração.
Variável Grupo n Média DP Cemento 1 7 24,2 9,2 2 6 17,2 9,5 3 4 14,2 9,0 Conjuntivo 1 7 10,0 4,9 2 6 7,7 5,0 3 4 6,6 6,5 Epitélio 1 7 23,2 8,5 2 6 24,8 13,7 3 4 22,1 8,5 Livre 1 7 42,7 13,7 2 6 50,3 9,4 3 4 57,1 16,8 Regeneração 1 7 6,3 6,4 2 6 1,0 2,5 3 4 1,5 3,1
Tabela 2. Coeficientes de correlação entre as variáveis da extensão linear da raiz, consideradas como porcentagens da extensão linear total.
Variável Cemento Conjuntivo Epitélio Livre
Regeneração Cemento 1 Conjuntivo 0,8564 1 Epitélio -0,3463 -0,5253 1 Livre -0,7824 -0,6030 -0,2903 1 Regeneração 0,7105 0,3554 0,0311 -0,6638 1
Tabela 3. Análise de variância multivariada para as variáveis de extensão linear (excluída a variável Conjuntivo).
Fonte de variação Lambda de Wilks R de Rao GL 1 GL 2 Valor-p Grupos 0,6326 0,7075 8 22 0,6822 GL= Graus de Liberdade
0 10 20 30 40 50 60 G1 G2 G3 % Cemento Conjuntivo Epitélio Livre Regeneração
Figura 11. Representação gráfica das médias dos valores porcentuais relativos a extensão linear da raiz, para os três grupos experimentais.
Tabela 4. Médias e desvios padrão para os valores porcentuais relativos a área da lesão: Óssea, Região vazia e tecido mole.
Variável Grupo n Média D P Tecido Ósseo 1 7 2,0 2,9 2 6 0,1 0,3 3 4 0,8 1,7 Região vazia 1 7 26,3 15,7 2 6 35,0 13,4 3 4 45,5 16,7 Tecido mole 1 7 71,7 13,7 2 6 64,8 13,2 3 4 53,7 16,4
Tabela 5. Coeficientes de correlação entre as variáveis de área da lesão, consideradas como porcentagens da área total da lesão
Variável Tecido ósseo Região vazia Tecido mole Tecido ósseo 1
Região vazia -0,5546 1
Tecido mole 0,4530 -0,9931 1
Tabela 6. Análise de va riância multivariada para as variáveis da área da lesão (excluída a variável Tecido ósseo).
Fonte de variação
Lambda de Wilks
R de Rao GL Uma GL 2 Valor-p
Grupos 0,66 1,51 4 26 0,2297 GL= Graus de Liberdade
0 20 40 60 80 G1 G2 G3 % Tecido ósseo Região vazia Tecido mole
Figura 12. Representação gráfica das médias dos valores porcentuais relativos a área da lesão, para os três grupos experimentais.
Discussão
O objetivo do presente estudo foi avaliar histologicamente a aplicação da proteína derivada da matriz do esmalte (Emdogain®) associada a vidro bioativo e a membrana absorvível em defeitos periodontais experimentais de furca grau III, em cães.
A opção pelos defeitos de furca grau III foi feita baseada na baixa previsibilidade de sucesso obtido no tratamento destas lesões conforme demonstrado pela literatura (Garret, 1996). Além disso, por se tratar de um estudo em defeitos criados cirurgicamente em cães, a escolha por defeitos mais extensos teve o objetivo de reduzir o risco de ocorrência de regeneração espontânea. Este processo pode interferir no resultado do tratamento e aumenta o número de fatores que impedem a extrapolação dos resultados para defeitos similares em humanos.
Dentre as técnicas regenerativas de que dispomos atualmente para tratamento de lesões de furca grau III, a RTG tem apresentado resultados favoráveis para regeneração periodontal (Caffesse et al., 1988, Niederman et al., 1989), embora com baixa previsibilidade e sucesso limitado a lesões com menores dimensões (Garret, 1996). A associação desta técnica com materiais de preenchimento, como os enxertos ósseos ou materiais aloplásticos, visam dar suporte para células progenitoras e ósseas promovendo uma osseocondução no interior das lesões (Anderegg et al, 1999, Yoshinobu et al., 1997). Além disso, segundo Fetner et al., 1994, estes materiais aumentam a nova inserção conjuntiva e o preenchimento dos defeitos ósseos. Porém, os resultados dessas associações
tem sido variável, como pode ser constatado na literatura. Enquanto alguns estudos têm mostrado não haver diferenças no grau de regeneração e no fechamento de defeitos periodontais, (Becker et al., 1992), outros mostram superioridade para a associação (Seibert & Nyman, 1990, Anderegg, 1991).
Dentre os materiais utilizados para preenchimento dos defeitos ósseos, o vidro bioativo representa uma nova classe de materiais sintéticos, desenvolvido primeiramente pelo Dr Larry Hench em 1970. No tratamento de defeitos ósseos de invasão de furca grau II, em molares de humanos, o uso do vidro bioativo proporciona benefícios clínicos como redução na profundidade de sondagem e sangramento, diminuição da migração epitelial e favorecimento de formação de tecido conjuntivo (Anderegg et al., 1999).
Segundo Yoshinobu et al. (1997), o vidro bioativo ativa as células necessárias para a formação óssea e impede a diferenciação de células precursoras osteoclásticas em osteoclastos. Schepers et al., relataram em 1989 e 1993, que este material tem uma ótima capacidade de osseocondução, como também, capacidade para causar diferenciação de células osseoprogenitoras em osteoblastos.
Além disso, o vidro bioativo oferece vantagens como: quantidade ilimitada, nenhum local cirúrgico adicional e nenhum potencial de transmissão de doença (Lovelace et al., 1998). Segundo Schepers et al. (1993), pequenas mudanças no contorno das partículas do vidro bioativo puderam ser observadas aos dois meses pós-operatórios. Após três meses do preenchimento de defeitos ósseos e cavidades de extração, o vidro bioativo apresentava-se
estabilizado e, aos seis meses pós-operatórios, não havia nenhuma diferença radiográfica entre as partículas de vidro e o tecido ósseo. Foi constatado também, ser este material efetivo como adjuvante na cirurgia convencional para o tratamento de defeitos intra-ósseos (Zamet et al., 1997), resultando em maior preenchimento quando comparado ao debridamento sozinho.
Baseado no exposto anteriormente, optamos pela utilização da membrana Resolut® XT (W. L. Gore & Associates, Inc. Arizona) e vidro bioativo Perioglass® (USBiomaterals Corporation. Alachua. Florida. USA.) como materiais para associação ao Emdogain® e também como tratamento controle nas lesões utilizadas neste estudo.
A associação da proteína derivada da matriz do esmalte com materiais de preenchimento foi avaliada em animais por Boyan et al., em 2000, utilizando enxerto de osso desmineralizado liofilizado (DFDBA ativo) mais 4 mg de Emdogain®. Obteve-se um importante aumento na indução óssea, com nova formação óssea em todas as amostras. Também em 2000 e 2001, Lekovic et al. associaram o Emdogain® a enxerto ósseo mineral poroso bovino (BPBM) para tratamento de defeitos intra-ósseos, em humanos. Os resultados obtidos foram redução na profundidade de sondagem e aumento no nível de inserção clínica, com preenchimento do defeito quando comparado a níveis pré-cirúrgicos. Esses resultados sugerem que mais estudos sejam realizados, principalmente em defeitos de furca, nos quais o Emdogain® tem-se mostrado efetivo (Araújo & Lindhe, 1998).
Desta forma, os grupos teste deste estudo compreenderam o emprego do Emdogain® associado à membrana absorvível, semelhante ao estudo de Araújo & Lindhe em 1998, e a associação destes materiais com o biovidro. Os resultados não apresentaram diferenças clínicas e histológicas entre os dois grupos teste e entre estes e o grupo controle.
Para uma melhor avaliação dos resultados, podemos subdividir a análise histológica em três tópicos principais: Migração Epitelial, Formação de Cemento e Preenchimento Ósseo.
Migração Epitelial
A migração epitelial pode ser considerada um indicador de insucesso na obtenção de regeneração periodontal. Ao impedir a migração epitelial, temos maiores chances de revestimento da superfície radicular por células indiferenciadas provenientes do ligamento periodontal ou tecido ósseo e, por conseguinte, formação de novo cemento e ligamento periodontal.
No presente estudo, o tecido epitelial estava presente, exibindo-se de variável espessura em todos os dentes, independente do tipo de tratamento recebido. A migração epitelial para apical apresentava-se mínima em todos os grupos, compreendendo a 23,2%, 24,8% e 22,1% da extensão radicular linear total do defeito nos grupos Teste 1, 2 e Controle, respectivamente.
O Emdogain® tem sido relatado como inibidor da migração epitelial. Estudo in vitro de Lyngstadaas et al., em 1999, mostrou que as células epiteliais não se proliferam quando em contato com o Emdogain®. Isto está de
acordo também com os resultados obtidos nos experimentos in vivo, de deiscências em macacos, no qual o crescimento epitelial apical foi muito limitado quando o Emdogain® foi aplicado nas superfícies radiculares (Hammarström et al., 1997). Já Heijl, em 1997, ao tratar um defeito de deiscência vestibular experimental de um incisivo mandibular em humano, verificou histologicamente uma pequena proliferação do epitélio juncional cobrindo somente 12% do defeito.
No presente estudo, a migração epitelial também foi reduzida nos grupos teste (com Emdogain®), porém sem diferença com o grupo controle. Isto pode ser explicado pelo emprego da técnica de RTG em todos os grupos, que visa o bloqueio das células epiteliais. A recessão gengival ocorrida no terço cervical das furcas, nos três grupos, também contribuiu para o baixo percentual de epitélio em contato com a superfície radicular.
Em estudos em animais, quando se usa a técnica de RTG, a migração epitelial é pequena, como verificaram Claffey et al., 1989, Cirelli et al., 1997 e Caffesse et al., 1991.
Formação De Novo Cemento
Além da migração epitelial, outro parâmetro avaliado no presente estudo foi a formação de novo cemento revestindo a superfície radicular dos defeitos, sendo este resultado desejado após um tratamento regenerativo. No presente experimento, o novo cemento formou-se a partir da porção apical da marca produzida na raiz, em continuidade com o cemento remanescente e com características microscópicas de cemento celular, sendo observado na maioria dos
defeitos tratados, com altura e espessura variável. Dos três grupos, o grupo Teste1 apresentou uma maior formação cementária (24,2% da extensão radicular do