Proteína derivada da matriz do esmalte associada à regeneração tecidual guiada e vidro bioativo no tratamento de lesões de furca grau III. Estudo histológico em cães

JOSÉ MARCOS ALVES FERNANDES

PROTEÍNA DERIVADA DA MATRIZ DO ESMALTE ASSOCIADA À REGENERAÇÃO TECIDUAL GUIADA E VIDRO BIOATIVO NO

TRATAMENTO DE LESÕES DE FURCA GRAU III. ESTUDO HISTOLÓGICO EM CÃES

ARARAQUARA

2002

JOSÉ MARCOS ALVES FERNANDES

PROTEÍNA DERIVADA DA MATRIZ DO ESMALTE ASSOCIADA À REGENERAÇÃO TECIDUAL GUIADA E VIDRO BIOATIVO NO

TRATAMENTO DE LESÕES DE FURCA GRAU III. ESTUDO HISTOLÓGICO EM CÃES

ARARAQUARA

2002

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia da Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho”, do Campus de

Araraquara, como requisito para a obtenção do

Título de Mestre em Odontologia (Área de

concentração: Periodontia).

Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Agradecimentos

A

DEUS

por ter sempre me auxiliado em todos os momentos na concretização

deste trabalho.

Dedico este trabalho à memória do meu pai, que durante sua vida foi o meu

maior incentivador.

A minha mãe e meus irmãos, pelo esforço conjunto no desenrolar desta jorna da.

A minha esposa

Maria Inez

e meus filhos

Marcos Leonardo

e

Paulo Vitor

,

pela compreensão, apoio e pelo muito que significam em minha vida.

Ao Prof. Dr.

Joni Augusto Cirelli

, pela orientação científica, amizade e

valiosa colaboração na execução desta pesquisa.

A todos os Professores do Departamento de Periodontia desta Faculdade e de

outros Departamentos.

Ao Prof. Dr.

Luis Carlos Spolidório

, pela colaboração na parte histológica

descritiva.

Ao Prof. Dr.

Romeu Magnani

do Instituto de Química da UNESP, pela

elaboração da análise estatística.

Ao

Rodrigo

e

Cris

pela amizade e grande colaboração no desenvolvimento da

parte experimental.

Aos colegas de Pós-graduação, funcionários e a todos que de alguma forma

colaboraram na concretização deste trabalho.

À Faculdade de Odontologia de Araraquara, na pessoa do Diretor Prof. Dr.

Sumário

INTRODUÇÃO...06

REVISÃO DA LITERATURA...09

PROPOSIÇÃO...35

MATERIAL E

MÉTODO...36

RESULTADO...48

DISCUSSÃO...65

CONCLUSÃO...75

REFERÊNCIAS...76

RESUMO...85

ABSTRACT...86

Introdução

O objetivo ideal da terapia periodontal é a eliminação das doenças periodontais e a recuperação dos tecidos destruídos por estas. No entanto, o completo restabelecimento periodontal com resolução dos defeitos ósseos ainda é um desafio atualmente, principalmente as lesões mais extensas como os defeitos de furca grau III (Carranza, 1996; Carranza & Jolkovsky, 1991). Várias técnicas têm sido desenvolvidas no sentido de buscar um tratamento adequado para a resolução destes defeitos, variando desde técnicas ressectivas, até técnicas conservadoras e/ou regenerativas que buscam proporcionar a reconstituição dos tecidos originais (Garret, 1996; Araújo & Lindhe, 1998; Sculean et al., 1999a).

A maneira como os tecidos periodontais se restabelecem após as diferentes modalidades de tratamento tem sido uma longa matéria de discussão. Dois tipos de resposta ao tratamento podem ser distinguidos: regeneração e reparação. Regeneração é definida como um processo biológico pelo qual a arquitetura e função dos tecidos perdidos são completamente reconstituídas. Reparação, por outro lado, é um processo biológico pelo qual a continuidade do tecido rompido é restabelecida por novos tecidos, que não reproduzem a estrutura e/ou função daqueles perdidos (American Academy of Periodontology, 1996).

Diversas técnicas e materiais têm sido propostos com o intuito de se obter a regeneração dos tecidos destruídos pela doença periodontal. Dentre eles, deslocamento coronário do retalho, condicionamento químico

radicular, Regeneração Tecidual Guiada (RTG), enxertos ósseos e de materiais aloplásticos, fatores de crescimento e combinação de procedimentos citados.

Apesar da multiplicidade de materiais e técnicas descritos na literatura, o sucesso no tratamento tem sido limitado pela dificuldade de se obter um adequado fechamento dessas lesões. Geralmente, um rompimento mecânico do coágulo sanguíneo, com subseqüente contaminação salivar e bacteriana, favorece a migração epitelial ao longo da superfície radicular, impedindo uma nova inserção do tecido conjuntivo (Martin et al., 1988; Wikesjo et al., 1992). A proteção da interface coágulo sanguíneo/superfície radicular nos estágios iniciais de cicatrização parece ser essencial quando se deseja obter regeneração dos tecidos perdidos (Polson & Proye, 1983; Wikesjo et al., 1992). Das técnicas citadas, a RTG apresenta vantagens quanto a estes requisitos. Proposta inicialmente por Nyman et al., em 1982, esta técnica utiliza uma membrana que age como uma barreira mecânica, colocada entre o retalho mucoperióstico e o defeito periodontal, com os seguintes objetivos: impedir a migração epitelial para dentro do defeito, excluir o tecido conjuntivo gengival do retalho do local da lesão e favorecer o repovoamento da superfície radicular por células progenitoras provenientes do ligamento periodontal, contribuindo assim para a formação de nova inserção e promovendo ainda, a manutenção de um espaço regenerativo e a retenção do coágulo sangüíneo (Greenstein & Caton, 1993). No entanto, não existe uma previsibilidade de resultado quando do uso da RTG (Garret, 1996), sendo o emprego do termo regeneração, no contexto desta técnica, questionado por alguns autores (Araújo et al., 1996; Hirooka, 1998).

Mais recentemente, uma proteína derivada da matriz do esmalte de dentes de suínos, denominada amelogenina, tem sido pesquisada como um produto para regeneração tecidual (Hammarström, 1997; Heijl, 1997 e Zetterström et al., 1997). A amelogenina constitui 90% da matriz protéica do esmalte (Brookes et al., 1995) e, em humanos, as amelogeninas são encontradas nos estágios iniciais da formação do órgão dental, mais especificamente no esmalte e cemento acelular (Hammarström et al., 1997). A partir desta proteína foi desenvolvida uma variação estável, liofilizada, com o objetivo de promover regeneração periodontal, com o nome comercial de Emdogain® (BIORA AB, Malmö Sweden).

Tem sido demonstrado que este material, in vitro, aumenta a migração e proliferação das células do ligamento periodontal (Gestrelius et al., 1997a; Lyngstadaas et al., 1999; Hoang et al., 2000), formação de cemento acelular, ligamento periodontal e osso alveolar (Hammarström et al., 1997; Heijl, 1997; Araújo & Lindhe, 1998; Mellonig, 1999; Yukna & Mellonig 2000). Clinicamente em defeitos intra-ósseos, tem-se obtido significante redução na profundidade de sondagem e ganho no nível de inserção clínica (Heden et al., 1999; Parashis & Tsiklakis, 2000; Okuda et al., 2000; Heard et al., 2000; Lekovic et al., 2000; Froum et al., 2001).

Em furcas grau III, o Emdogain® apresenta resultados favoráveis quando associado a RTG (Araújo & Lindhe, 1998), porém a associação do Emdogain® a outras técnicas e materiais regenerativos que possam melhorar seus resultados ainda necessita de mais estudos.

Revisão da literatura

Com o objetivo de facilitar a leitura desta revisão, os trabalhos revistos foram divididos em duas sessões. A primeira delas descreve os estudos com a proteína derivada da matriz do esmalte (Emdogain®), subdividida em estudos in vitro, em animais e humanos. Na 2a sessão, foram revistos os estudos em furca grau III em animais, nos quais técnicas regenerativas foram avaliadas. Esta sessão permitirá uma comparação das diversas técnicas e ou materiais no tratamento das lesões de furca grau III, salientando-se a escassez de estudos com o Emdogain® nestas lesões.

I . Estudos com Emdogain®

I. 1 - Estudos in vitro, com Emdogain®

Gestrelius et al., (1997a), avaliaram in vitro a capacidade da matriz derivada do esmalte em influenciar propriedades específicas das células do ligamento periodontal. As propriedades das células examinadas incluíram: migração, inserção, proliferação, biossíntese e formação de nódulos minerais. Os resultados obtidos demonstraram que o Emdogain® favoreceu a formação de agregados proteicos, tendo uma aparência de microesferas acumuladas com diâmetro aproximado de 1µm. Observou-se aumento na proliferação, produção de proteínas e formação de nódulos minerais pelas células do ligamento periodontal. Segundo os autores, nenhum fator de crescimento pode ser detectado no Emdogain®. Este estudo suporta a hipótese que o Emdogain® pode agir como

uma matriz para as células regenerativas periodontais. Os resultados sugerem que os agregados formados pelo Emdogain® em temperatura e pH fisiológicos são responsáveis pela criação de um meio positivo para proliferação e diferenciação celular, necessário para a regeneração periodontal.

Ainda em 1997b, Gestrelius et al verificaram ser o alginato propileno glicol (PGA) um veículo apropriado para aplicação local do Emdogain®. Quando é dissolvido em pH ácido (ácido acético a 10 mM), o Emdogain® resulta em uma solução altamente viscosa, enquanto que em pH neutro e à temperatura do corpo diminui a viscosidade, sofrendo precipitação. Testes in vitro mostraram que o Emdogain® adsorve tanto a hidroxiapatita como o colágeno nas raízes dentais expostas, formando multicamadas. Já os testes in

vivo, realizados em ratos e porcos, mostraram que quantidades detectáveis

permanecem sobre as superfícies radiculares, nos sítios de aplicação, sob formas esféricas complexas e insolúveis, por até duas semanas, tempo que parece ser suficientemente longo para permitir a re-colonização por células do ligamento periodontal. Estudos em dentes de macacos, utilizando microscopia eletrônica de varredura, indicaram, ainda, que o Emdogain®, em alginato propileno glicol, pode promover repopulação de células semelhantes a fibroblastos, durante a primeira semana após aplicação.

Petinak et al., em 1998, avaliaram o potencial do Emdogain® em influenciar, in vitro, o sistema imunológico. Linfócitos foram isolados da

corrente sangüínea de dez doadores saudáveis e colocados em meio de cultura, na presença de várias concentrações de Emdogain®, com o objetivo de determinar a proliferação celular e a produção de citocinas e imunoglobulinas. Nestas condições experimentais, o Emdogain® fez com que ocorresse um leve aumento na proliferação de linfócitos, restrito aos receptores da fração de CD4 dos linfócitos do tipo T, e da interleucina do tipo 2 (CD25), e uma diminuição concomitante dos linfócitos tipo B (CD19). A produção de imunoglobulinas e citocinas (IL-2 e IL-6) não foi modificada com a aplicação de altas concentrações do Emdogain® em relação àquelas usadas na prática clínica, após três dias de contato. Os autores concluíram que o Emdogain® induz uma mínima reação imunológica, restrita à fração de CD4 do linfócito tipo T, in vitro.

Lyngstadaas et al., em 1999, investigaram a resposta das células do ligamento periodontal quando expostas ao Emdogain®, in vitro. O grau de inserção celular foi monitorado quanto ao crescimento, produção protéica, produção de TGF-ß1 e capacidade de formação de camadas celulares múltiplas das células do ligamento periodontal. Os resultados mostraram que os níveis de inserção e crescimento das células do ligamento periodontal foram estimulados pelo Emdogain®, havendo um aumento na produção de TGF-1 e na habilidade das células do ligamento periodontal desenvolverem camadas múltiplas.

Hoang et al., em 2000, avaliaram in vitro a influência do Emdogain® sobre as células do ligamento periodontal, fibroblastos gengivais e

células de osteosarcoma. Foram adicionados a culturas teciduais, 5 a 100ng/ml de Emdogain®, 20ng/ml de fator de crescimento derivada de plaquetas (controle positivo) e 100ng/ml de fator de crescimento de insulina (controle negativo). Os resultados mostraram, após nove dias de incubação, que houve maior crescimento celular na presença do Emdogain®. No terceiro e sexto dia houve um maior crescimento celular, estatisticamente significante, quando comparado com o controle positivo. Os presentes dados suportam o conceito que, a aplicação clínica da matriz derivada do esmalte pode aumentar a regeneração da ferida periodontal alterando especificamente a migração e proliferação das células do ligamento periodontal. Os autores concluíram que a aplicação clínica de Emdogain® pode aumentar a capacidade de regeneração pela migração e proliferação das células do ligamento periodontal.

Van Der Pauw et al., em 2000, estudaram in vitro os efeitos do Emdogain® sobre células humanas obtidas do ligamento periodontal e gengiva livre. O Emdogain® foi adicionado às culturas destas células e a expressão da atividade da fosfatase alcalina e a proliferação do fator de crescimento TGFß1

foram avaliados. Após 24 e 48 horas de cultura, as populações de células do ligamento periodontal mostraram consideráveis extensões de inserção enquanto que, as células gengivais mostraram uma pequena tendência neste sentido. A expressão da fosfatase alcalina foi maior na presença do Emdogain®, especialmente para as células do ligamento periodontal. Ambas as células apresentaram níveis altos significantes de fator de crescimento TGFß1 quando em

contato com o Emdogain®. Os autores concluíram que a presença do Emdogain induz maior inserção das células do ligamento periodontal podendo contribuir para os estágios iniciais da regeneração periodontal.

I. 2 - Estudos em animais, com Emdogain®

Hammarström et al., em 1997, testaram o efeito de diferentes preparações da matriz derivada do esmalte na regeneração periodontal em deiscências ósseas criadas cirurgicamente em caninos e pré-molares de macacos. A amelogenina e amelina foram seletivamente extraídas e aplicadas associadas ou não a diferentes veículos (alginato propileno glicol (PGA), hidroxietil celulose (HC) e dextrana (D)). Após oito semanas, os animais foram sacrificados para avaliação histológica. Nenhum dos veículos apresentou reação de corpo estranho, granulomas ou tumores. A aplicação de matriz derivada do esmalte homogeneizada resultou em uma quase completa regeneração do cemento acelular, firmemente inserido na dentina e com fibras colágenas estendendo-se sobre o novo osso formado. Somente a associação de PGA com frações de amelogenina resultou em regeneração significante dos tecidos periodontais. O presente estudo mostrou que é possível induzir regeneração dos tecidos periodontais, com formação de cemento acelular, ligamento periodontal e osso alveolar, semelhante ao desenvolvimento normal destes tecidos, quando se emprega o Emdogain®.

Araújo & Lindhe, em 1998, avaliaram o efeito do Emdogain® na cicatrização periodontal de defeitos de furca grau III, em 5 cães. Defeitos de furca grau III foram criados cirurgicamente nos 3os pré-molares mandibulares, medindo 3mm de largura e 4mm de altura, e cronificados por 21 dias. Após este período, as superfícies radiculares foram instrumentadas e receberam controle mecânico de placa por duas semanas, sendo então os defeitos expostos para tratamento cirúrgico. Após instrumentação, em um lado da mandíbula (grupo teste), um gel de ácido fosfórico a 37 % foi aplicado nas superfícies radiculares por 15 segundos, removido com irrigação de solução salina, para posterior aplicação do Emdogain®. Em seguida, colocou-se uma membrana absorvível (Resolut XT, W. L. Gore & Associates, Inc. Arizona, U.S.A) cobrindo as entradas vestibulares e linguais dos defeitos de furca. Nos pré-molares do lado oposto (grupo controle), foi feito o mesmo tratamento, com exceção da aplicação do ácido e do Emdogain®. Quatro meses após controle mecânico diário de placa, os animais foram sacrificados para avaliação histológica. Em ambos os grupos, os defeitos de furca apresentaram-se histologicamente fechados, o centro das furcas apresentava um largo espaço de osso medular e a porção mais coronal ocasionalmente estava isenta de osso mineralizado. Histologicamente, houve semelhança quanto à regeneração com formação de tecido ósseo, ligamento periodontal e nova formação de cemento radicular. No grupo teste, porém, um cemento acelular foi formado na porção mais apical, diferente do cemento celular mais coronal na mesma furca. Os autores concluíram que o Emdogain®, quando aplicado sobre uma superfície

radicular instrumentada e condicionada, pode criar um ambiente propício para a formação de cemento acelular.

Rocha, em 1999, avaliou histologicamente os efeitos do Emdogain® em 14 defeitos de furca grau II criados cirurgicamente nos 3os pré-molares inferiores de sete cães. Após um período de dois meses de cronificação, no lado controle foi realizado somente raspagem e alisamento radicular sob acesso cirúrgico. No lado teste, realizou-se o mesmo tratamento, porém, com a aplicação de ácido cítrico por 20 segundos e Emdogain® sobre as superfícies radiculares. Os cães foram sacrificados após três meses, período em que receberam controle mecânico e químico diário de placa. A análise histométrica apresentou os seguintes resultados: formação de novo cemento (lado controle = 3,21mm e no lado teste = 3,48mm), migração epitelial (lado controle = 1,63mm e no lado teste = 1,68mm), inserção conjuntiva (lado controle = 0,52mm e no lado teste = 0,27mm), e formação de novo osso (lado controle = 1,48mm2 e no lado teste = 1,42mm2). Não houve diferença estatística para todos os parâmetros avaliados. Não houve fechamento da furca em nenhum dos tratamentos propostos, demonstrando que o Emdogain não apresentou superioridade ao tratamento convencional em furcas grau II.

Sculean et al., em 2000a, avaliaram histologicamente, em pré-molares e incisivos de três macacos, o tratamento de defeitos intra-ósseos criados cirurgicamente, empregando-se o Emdogain®, Regeneração Tecidual Guiada

(RTG) ou combinação de ambos. Após quatro semanas de cronificação dos defeitos, seguidos de duas semanas de controle químico de placa, realizou-se o tratamento cirúrgico. Após raspagem e alisamento radicular, os defeitos foram divididos em quatro grupos: Grupo1 - os defeitos receberam membrana absorvível (Resolut®), Grupo 2 - as raízes foram condicionadas com EDTA 24% por 2 minutos, seguido de aplicação do Emdogain®, Grupo 3 - associou-se os dois tratamentos: Emdogain® e membrana e o Grupo 4 - controle, no qual somente reposicionou-se o retalho coronalmente. Após cinco meses, os animais foram sacrificados. Resultados histológicos: no Grupo Controle, a cicatrização foi caracterizada por epitélio juncional longo e uma limitada regeneração periodontal no fundo do defeito. Os defeitos tratados com RTG apresentaram regeneração periodontal consistente quando as membranas não foram expostas, e os sítios tratados com Emdogain® apresentaram regeneração com uma altura variada. A combinação de terapias não mostrou melhores resultados. Os autores concluíram que todas as três modalidades de tratamento regenerativo favorecem a regeneração periodontal.

Boyan et al., em 2000, avaliaram a capacidade do Emdogain® de induzir nova formação óssea, em músculo liso da panturrilha de ratos, ou de aumentar o potencial de indução óssea de um enxerto de osso desmineralizado liofilizado (DFDBA). Foram utilizados lotes de DFDBA com atividade osteoindutora alta (DFDBA ativo) e baixa (DFDBA inativo). Trinta e dois camundongos machos foram usados neste estudo. Os animais foram

divididos em 8 grupos: 1) DFDBA ativo, 2) DFDBA inativo, 3) DFDBA ativo + 2mg de EMD, 4) DFDBA ativo + 4mg de EMD, 5) DFDBA inativo + 2mg de EMD, 6) DFDBA inativo + 4mg de EMD, 7) 2mg de EMD e 8) 4mg de EMD. Quatro camundongos foram usados para cada grupo testado. Dois implantes idênticos foram colocados intramuscularmente. Após 56 dias de implantação os animais foram sacrificados. Os autores observaram que os grupos 2, 5, 6, 7 e 8 não induziram nova formação óssea. Os grupos 1 e 3 induziram a formação de novo osso com dimensões semelhantes. No grupo 4 houve uma maior indução óssea, área de novo osso, osso cortical e aumento também do DFDBA residual. A área de nova formação óssea com DFDBA ativo foi cinco vezes maior do que a área com DFDBA inativo. Os autores concluíram que o Emdogain® não é osseoindutor. Porém, pode aumentar o potencial osseoindutor de outro material, quando em associação, sendo, portanto considerado um material osseopromotor devido as suas propriedades osseocondutivas.

I. 3 - Estudos em humanos, com Emdogain®

Heijl, em 1997, verificou histologicamente o efeito da matriz derivada do esmalte na regeneração periodontal de um defeito experim ental, em humano. Foi criado um defeito de deiscência na vestibular de um incisivo inferior, em um paciente do sexo masculino, seguido de remoção óssea e condicionamento da superfície radicular exposta, com ácido ortofosfórico a 37 %, por 15 segundos. A matriz derivada do esmalte foi aplicada na superfície radicular. Após quatro

meses, o dente foi removido cirurgicamente em bloco. Os resultados revelaram a formação de cemento acelular sobre a superfície radicular com inserção de novas fibras periodontais, com orientação funcional e inserindo no novo osso alveolar. A nova camada de cemento cobriu 73 % do defeito criado inicialmente. A recuperação óssea foi de 65 % da altura óssea pré-cirúrgica. O autor concluiu que o Emdogain® pode levar a uma regeneração periodontal.

Sculean et al., em 1999a, realizaram outro trabalho para investigar a combinação de técnicas no tratamento de 16 pacientes com defeitos periodontais intra-ósseos contralaterais. Um grupo recebeu raspagem cirúrgica, condicionamento radicular com EDTA 24% por 2 minutos e aplicação de Emdogain®. O outro, o mesmo tratamento, associado ao emprego de uma membrana absorvível (Resolut XT, W. L. Gore & Associates, Inc. Arizona, U.S.A). Antes das cirurgias e aos oito meses pós -operatórios, foram analisados os seguintes parâmetros clínicos: sangramento à sondagem (SS), profundidade de sondagem (PS) e nível de inserção clínica (NIC). Nenhum paciente teve reação alérgica após o tratamento ou durante os oito meses de controle. Os sítios tratados com Emdogain® mostraram uma redução na PS de 8,1 ± 1,7mm para 4,3 ± 1,2mm e um ganho no NIC que mudou de 10,3 ± 1,8mm para 7,2 ± 1,2mm. Os sítios tratados com Emdogain® mais membrana mostraram uma redução na PS de 8,3 ± 1,7mm para 4,3 ± 0,7mm e um ganho no NI que mudou de 10,1 ± 1,9mm para 7,1 ± 1,7mm (p < 0.001). Os autores não encontraram diferença estatisticamente significante entre as técnicas cirúrgicas, para os parâmetros

clínicos avaliados. Em ambas as técnicas, houve melhora em todos os parâmetros clínicos avaliados.

No mesmo ano, Sculean et al., 1999b, avaliaram histologicamente os resultados do tratamento de defeitos intra-ósseos com Emdogain® e Regeneração Tecidual Guiada (RTG). Participaram deste estudo 40 pacientes, com 14 defeitos ósseos angulares, divididos em dois grupos. O grupo I recebeu tratamento cirúrgico a retalho com colocação de membrana (Resolut XT, W. L. Gore & Associates, Inc. Arizona, U.S.A) e o grupo II tratamento cirúrgico a retalho, seguido de condicionamento com EDTA 24 % por 2 minutos e aplicação de Emdogain®. Clinicamente foram analisadas: profundidade de sondagem (PS) e nível de inserção clínica (NIC). Profilaxias foram realizadas a cada 2 a 4 meses. Após seis meses, os dentes foram removidos em bloco. Os resultados da análise clínica com o Emdogain® mostraram que a PS diminuiu de 11,3mm para 5,6mm após seis meses e o ganho no NIC foi de 12,1mm para 9,1mm aos seis meses pós-operatórios. Com RTG, a PS diminuiu de 11,4mm para 5,6mm aos seis meses pós-operatórios e o ganho no NIC foi de 13,3mm para 10,1mm. Na análise histológica, a medida linear do grupo de Emdogain® mostrou uma média de 2,6 ± 1,0mm de novo tecido conjuntivo de inserção, com novo cemento, e uma média de 0,9 ± 1,0mm de novo osso. No grupo de RTG a média de nova inserção de tecido conjuntivo foi de 2,4 ± 1,0mm e a média de novo osso foi de 2,1 ± 1,0mm. Os autores concluíram que o tratamento de defeitos intra-ósseos com Emdogain®

ou RTG leva à formação de novo cemento com inserção de fibras colágenas, não havendo diferenças significativas entre as técnicas.

Mellonig, em 1999, pesquisou clínica e histologicamente o uso do Emdogain® em dois pacientes com defeitos periodontais intra-ósseos em dentes indicados para extração por motivos protéticos. Os defeitos receberam debridamento cirúrgico, condicionamento radicular com EDTA pH = 6,7 por 15 segundos, e aplicação do Emdogain®. Os indivíduos foram analisados clinicamente quanto à profundidade de sondagem (PS) e nível de inserção clínica (NIC). Os resultados clínicos em ambos os pacientes mostraram uma redução de 5mm de PS e 4mm de ganho no NIC. A remoção dos dentes em bloco foi feita após seis meses. A análise histológica demonstrou formação de novo osso, cemento e ligamento periodontal. Houve formação de cemento acelular sobre o cemento anteriormente existente. O osso apresentava características de maduro, com algumas áreas lamelares imaturas. O autor concluiu que o Emdogain® torna possível a regeneração periodontal.

Rasperini et al., em 2000, avaliaram clínica e histologicamente a utilização do Emdogain®, associado a enxerto de tecido conjuntivo. Utilizaram um canino mandibular direito, com recessão de 6mm de altura, profundidade de bolsa de 1mm e sem tecido ceratinizado. Foi realizado tratamento cirúrgico com aplicação de Emdogain®, colocação de enxerto de tecido conjuntivo subepitelial, deslocamento coronário do retalho e sutura. Foram

feitas análises clínicas (inicial e aos seis meses pós-operatórios) da profundidade de sondagem (PS), nível de inserção clínica (NIC), gengiva ceratinizada (GC) e recessão gengival (RG). Os resultados clínicos obtidos mostraram recessão residual de RG = 4mm, ganho de NIC = 2mm, diminuição na PS = 0 e aumento da GC = 3mm. Aos seis meses pós-operatórios o dente foi extraído em bloco e realizado as análises histológicas e histométrica. Os resultados histológicos mostraram novo cemento com inserção de fibras colágenas. A análise histométrica mostrou nova inserção conjuntiva = 2,25mm, novo cemento acelular = 1,0mm, novo osso = 1,87mm e epitélio sulcular = 1,96mm.

Yukna & Mellonig, em 2000, avaliaram histologicamente a cicatrização periodontal após terapia regenerativa com Emdogain®. Dez defeitos intra-ósseos, em dentes indicados para extrações em oito pacientes apresentando periodontite moderada a severa, foram selecionados para este estudo. Durante os procedimentos cirúrgicos a retalho, o tecido de granulação foi cuidadosamente removido ao redor do defeito, sem remoção do cálculo. Ácido cítrico, pH=1, foi aplicado por 1 minuto e lavado com solução salina, seguido por aplicação do Emdogain®. Aos seis meses pós-operatório as extrações foram realizadas e os dentes avaliados histologicamente. Os resultados mostraram evidências de regeneração, formação de novo cemento, novo osso e ligamento periodontal em três espécimes em dez, na porção localizada coronariamente à marcação radicular. Inserção de tecido conjuntivo foi observado em três espécimes e epitélio juncional longo em quatro. Os resultados deste estudo permitiram concluir que o uso de

Emdogain® pode resultar em regeneração periodontal na superfície de raiz previamente infectada.

Sculean et al., em 2000b, fizeram uma avaliação dos resultados clínicos e histológicos obtidos no tratamento de defeitos intra-ósseos com a aplicação de Emdogain®. Em dois pacientes, dois dentes anteriores com defeitos intra-ósseos e indicados para extração por razões protéticas, foram selecionados para tratamento. Três meses após tratamento básico, os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados: profundidade de sondagem (PS), recessão gengival (RG) e nível de inserção clínica (NCI). Posteriormente, foram realizados retalhos mucoperiósteos, raspagem e alisamento radicular e condicionamento radicular com EDTA 24% por 2 minutos, seguidos de aplicação do Emdogain®. Aos seis meses pós -operatórios, os resultados histológicos mostraram nova formação de cemento com inserção de fibras colágenas em ambos os espécimes. No 1º caso, uma nova formação de cemento também foi acompanhada de nova formação óssea. Concluíram que o Emdogain® possui o potencial de estimular formação de nova inserção de tecido conjuntivo em defeitos intra-ósseos em humanos.

Parodi et al., em 2000, avaliaram a aplicação de Emdogain® na terapia de bolsas periodontais profundas. Foram selecionados 21 pacientes que apresentavam defeitos interproximais intra-ósseos, os quais foram divididos em defeitos profundos (< 9mm) e muito profundos (= 9mm). Durante as cirurgias

somente defeitos de uma e duas paredes foram incluídos para avaliação (oito de uma parede e 13 de duas). Realizou-se raspagem e alisamento radicular, condicionamento radicular nos primeiros casos com ácido ortofosfórico por 15 segundos e EDTA 24% nos demais. O Emdogain® foi aplicado nas raízes expostas e os retalhos suturados. Os dentes foram extraídos após seis a nove meses. Os bons resultados clínicos obtidos não foram confirmados radiograficamente, pois radiografias computadorizadas e padronizadas aos 12 meses pós -operatórios não revelaram melhora significante. Ao exame histológico, as duas amostras mostraram pequena regeneração, somente na região mais apical da marcação havia uma pequena quantidade de novo osso e nenhuma formação de novo cemento. Os autores sugeriram que mais estudos são necessários para clarificar o mecanismo de ação e avaliar os resultados a longo tempo deste material.

Lekovic et al., em 2000, compararam a eficiência clínica do Emdogain® sozinho ou associado com osso mineral poroso bovino (BPBM), no tratamento de defeitos periodontais intra-ósseos, em humanos. Vinte e um defeitos foram cirurgicamente tratados, usando um desenho de boca dividida. Re-entradas cirúrgicas foram realizadas aos seis meses pós -operatórios. Medidas clínicas pós-cirúrgicas, em sítios vestibulares(V) e linguais (L) mostraram uma redução significativa na profundidade à sondagem no grupo de Emdogain®/BPBM (3.43 ± 1.32mm em sítios V e 3.36 ± 1.35mm em sítios L) quando comparado ao grupo de Emdogain® somente (1.91 ± 1.42mm em sítios V e 1.85 ± 1.38mm em sítios L).

O grupo de Emdogain®/BPBM também apresentou um ganho significativamente maior de inserção clínica (3.13 ± 1.41mm em sítios V e 3.11 ± 1.39mm em sítios L) quando comparado ao grupo com Emdogain® (1.72 ± 1.33mm em sítios V e 1.75 ± 1.37mm em sítios L). A re-entrada cirúrgica dos defeitos tratados revelou uma quantidade significativamente maior de preenchimento a favor do grupo de Emdogain®/BPBM (3.82 ± 1.43mm em sítios V e 3.74 ± 1.38mm em sítios L), quando comparado ao grupo de Emdogain® (1 .33 ± 1.17mm em sítios V e 1.41 ± 1.19mm em sítios L). Os autores concluíram que o osso mineral poroso bovino (BPBM) tem a habilidade de aumentar os efeitos do Emdogain®, reduzindo a profundidade de sondagem, melhorando o nível de inserção clínica e promovendo o preenchimento do defeito, quando comparado a níveis pré-cirúrgicos.

Lekovic et al., também em 2001, avaliaram a efetividade de uma combinação de Emdogain® (EMD), osso mineral poroso bovino (BPBM), e uma membrana absorvível para regeneração tecidual guiada (RTG), como terapia regenerativa para defeitos ósseos em humanos e compararam-na com a técnica de retalho aberto para debridamento, denominada em inglês de “Open Flap Debridement” (OFD). Utilizou-se um desenho de boca dividida, incluindo 18 pares de defeitos intra-ósseos com profundidade de sondagem >6mm observada na terapia inicial. Após seis a oito semanas de terapia inicial, os procedimentos de cirurgia reconstrutiva foram iniciados. As superfícies radiculares adjacentes aos defeitos foram tratadas com gel de EDTA 24% por 2 minutos. Os sítios experimentais foram tratados com EMD, BPBM e membrana de colágeno para

RTG, enquanto sítios controles foram tratados com OFD. Medidas clínicas feitas aos seis meses pós-operatórios revelaram uma significante redução na profundidade de sondagem no grupo experimental, quando comparado ao grupo controle (4.95 ± 1.52 mm nos sítios V e 4.74 ± 1.47 mm nos sítios L) e (2.83 ± 0.83 mm nos sítios V e 2.90 ± 0.91 mm nos sítios L), como também um maior ganho no nível de inserção clínica (3.89 ± 1.16 mm nos sítios V e 3.78 ± 1.14 mm nos sítios L e 1.52 ± 0.83 mm nos sítios V e 1.48 ± 0.78 nos sítios L, respectivamente). Na re-entrada cirúrgica, os defeitos trata dos revelaram um significante aumento no preenchimento do defeito a favor do grupo experimental (4.76 ± 1.36 mm nos sítios V e 4.81 ± 1.37 nos sítios L), quando comparado ao grupo controle (1.78 ± 0.92 mm nos sítios V e 1.67 ± 0.90 mm nos sítios L). Os resultados indicam que a combinação de técnicas incluindo BPBM, EMD e RTG resulta em melhores resultados clínicos no tratamento de defeitos intra-ósseos que a técnica simples do retalho aberto para debridamento somente com OFD.

II. Estudos regenerativos em furcas grau III, em cães

Aukhil et al., em 1986, avaliaram a eficiência da técnica de RTG no tratamento de pré-molares de seis cães com doença periodontal natural e 40-60% de perda óssea, observada radiograficamente. Três semanas após raspagem supragengival e controle de placa com clorexidina, os dentes foram tratados cirurgicamente. Nesta etapa, realizou-se raspagem e alisamento radicular seguido de cobertura dos dentes com membrana de silicone (Biobrane, Woodroof

Labs). Uma única membrana cobriu todos os dentes de cada quadrante, suportada por fios ortodônticos presos às proximais de cada dente. Os resultados clínicos mostraram recessão gengival progressiva até a 5a semana, estabilizada após a remoção das membranas. Os resultados histométricos mostraram, em amostras com períodos de oito e 16 semanas pós-operatórios, um epitélio juncional longo e uma formação de cemento novo com fibras inseridas na porção apical do defeito. O osso alveolar sofreu, em média, uma reabsorção de 0,12mm para ambos os grupos (embora tenha ocorrido formação óssea em vários sítios). Os resultados sugeriram que o emprego da técnica de RTG resultou em uma maior formação de nova inserção conjuntiva e que o modo de colocação da membrana mostrou-se eficaz na manutenção da mesma no local desejado.

Caffesse et al., em 1988, testaram o efeito de uma membrana de politetrafluoretileno expandido ePTFE (Gore-Tex® Periodontal Material) na obtenção de nova inserção de tecido conjuntivo em sete cães com periodontite natural. Os dentes selecionados foram os pré-molares e primeiros molares mandibulares. Após receberem raspagem e alisamento radicular, retalhos mucoperiósticos permitiram a adaptação das membranas ao redor dos pré-molares e o retalho foi suturado firmemente mantendo o material coberto. Os primeiros molares atuaram como grupo controle recebendo somente debridamento cirúrgico. A membrana em um quadrante foi removida em quatro semanas, e nos quadrantes contralaterais, de oito a dez semanas após a cirurgia. Os cães foram sacrificados três meses após a colocação das membranas. Os resultados histológicos

mostraram nova inserção de tecido conjuntivo com deposição de cemento nas áreas onde a membrana foi usada, sendo observado um crescimento epitelial apical reduzido nestas áreas. No grupo controle a cicatrização ocorreu através da formação de epitélio juncional longo, com um mínimo de nova inserção conjuntiva era visto. Os autores concluíram que a membrana Gore-tex foi efetiva em impedir o crescimento apical do epitélio gengival e proliferação do tecido conjuntivo gengival, promovendo nova inserção de tecido conjuntivo de acordo com os princípios de “Regeneração Tecidual Guiada”. Contudo, nenhuma diferença na resposta óssea foi constatada entre os grupos. Também não puderam ser observadas diferenças entre as áreas onde a membrana foi removida após 1 mês de sua colocação e as áreas onde o material permaneceu por mais tempo.

Claffey et al., em 1989, investigaram a cicatrização de defeitos de furca classe III em pré-molares mandibulares de cinco cães tratados com uma membrana de politetrafluoretileno expandido(ePTFE). Três meses após a cirurgia os dentes foram removidos em bloco para análise histológica. Foi observada formação de nova inserção conjuntiva em 79% da extensão dos defeitos no grupo controle, no qual não foram colocadas membranas, sendo os resultados prejudicados pela regeneração espontânea, e no grupo experimental esta formação foi maior. Os autores relatam que o uso da membrana proporciona suporte mecânico aos retalhos reposicionados, protege o coágulo formado no interior da lesão e ainda funciona como barreira física à migração epitelial, evitando também o contato da parte interna do retalho com a superfície radicular.

Claffey et al., também em 1989, desenvolveram um modelo de estudo de cicatrização periodontal, em defeitos de furca classe III horizontais no qual as coroas clínicas eram removidas para “submergir” totalmente os dentes durante o período de cicatrização. O tratamento do grupo controle foi somente com debridamento cirúrgico; no grupo teste 1, associou-se retalho e membrana de ePTFE e no grupo teste 2 o tratamento foi semelhante ao anterior, porém, a membrana foi colocada de forma a cobrir todo o processo alveolar (interproximal e interradicular). Não foram encontradas diferenças na qualidade de regeneração óssea e cementária com o uso da membrana de ePTFE. Este estudo mostra que a oclusão física de células do interior do retalho, ou do osso pré-existente, não é suficiente para prevenir a reabsorção radicular na cicatrização da ferida periodontal.

Niederman et al., em 1989, avaliaram a regeneração óssea de furcas classe III utilizando uma membrana de ePTFE como barreira, em pré-molares de três cães beagles com perda óssea alveolar severa. Em ambos os grupos, teste e controle, foi realizado retalho total e as raízes das furcas foram raspadas e aplainadas. No grupo teste, os dentes receberam membrana de ePTFE . Os animais foram sacrificados após doze semanas. Os resultados histológicos mostraram, no lado teste, substancial preenchimento da furca (aproximadamente 90%), quando comparado ao controle (aproximadamente 10%). Os autores concluíram, com base nos resultados radiográficos e histológicos, que houve

maior regeneração óssea nos dentes tratados com membrana de ePTFE em comparação aos dentes que não receberam qualquer membrana.

Em outro estudo realizado por Caffesse et al., em 1991, comparou-se os resultados alcançados pela técnica de RTG, associada ou não ao condicionamento radicular com ácido cítrico e aplicação de fibronectina autógena, no tratamento de lesões periodontais com perda óssea horizontal e lesões de furca em cães com doença periodontal natural. Após o tratamento básico, os cães passaram por terapia cirúrgica na região de pré-molares e 1os molares. Parte dos dentes tiveram suas raízes condicionadas (grupo experimental) e, posteriormente, as raízes de todos os dentes foram cobertas com membrana de ePTFE (Gore-Tex Periodontal Material). Os resultados histológicos, após três meses de cicatrização, foram semelhantes para ambos os grupos: ausência de processo inflamatório interferindo na cicatrização, ausência de anquilose, uma fina camada de cemento novo cobrindo as superfícies radiculares, onde também estava presente uma nova inserção conjuntiva. Considerável quantidade de osso novo também estava presente. Nas furcas, o tecido conjuntivo e o novo tecido ósseo praticamente preencheram toda a área do defeito, havendo proliferação epitelial freqüente na sua porção mais coronária. Os autores concluíram que a reparação periodontal após o uso da técnica de RTG apresentou considerável regeneração óssea e de tecido conjuntivo. A associação desta técnica com o ácido cítrico e a fibronectina produziu resultados levemente melhores, porém sem significância estatística.

White et al., em 1994, trabalhando em lesões de furcas classe III induzidas por ligaduras nos pré-molares de seis cães, avaliaram a eficiência do tratamento com membranas de politetrafluoretileno expandido (ePTFE). As membranas foram colocadas nos segundos e quartos pré-molares (grupo teste), e os terceiros pré-molares receberam somente debridamento cirúrgico sem colocação de membrana (grupo controle). Após quatro semanas, as membranas foram removidas. Os animais foram sacrificados doze semanas após colocação das membranas para avaliação histológica. Os resultados mostraram que não houve diferenças tanto nos níveis de regeneração óssea, como na presença e extensão de tecido epitelial, quando compararam dentes do grupo controle aos dentes do grupo experimental.

Lindhe et al., em 1995, realizaram em um mesmo estudo, dois experimentos com Regeneração Tecidual Guiada. No 1º estudo, foram usados cinco cães. Em cada animal um 30 pré-molar inferior foi selecionado como sítio teste e tratado com membrana de ePTFE, o dente contralateral, controle, foi tratado apenas com debridamento cirúrgico. No 2º estudo, foi utilizada uma membrana absorvível (Resolut®) no grupo teste e uma membrana de ePTFE no grupo controle. Ambas membranas foram removidas 30 dias após sua colocação e os animais sacrificados quatro meses após a terapia cirúrgica. Verificou-se, histologicamente, maior neoformação óssea e cementária nos defeitos tratados com membranas de ePTFE em comparação aos defeitos tratados apenas com debridamento cirúrgico. Além disso, verificou-se que as membranas não

absorvíveis de ePTFE e absorvíveis de copolímero de glicolídeo e lactídeo mostraram-se igualmente eficientes e superiores ao grupo controle, que não recebeu qualquer membrana.

Crigger et al., em 1996, avaliaram a cicatrização após o tratamento de defeitos periodontais usando duas barreiras de membranas de colágeno bovino com diferentes graus de reticulamento, e comparou os resultados com os obtidos com o uso de uma membrana de politetrafluoretileno expandido (ePTFE). Defeitos circunferenciais horizontais foram criados em dentes pré-molares mandibulares de seis cães beagles. Cada cão recebeu um tipo de membrana por quadrante mandibular. Após seis meses da colocação das membranas os cães foram sacrificados. Na análise histológica, os dentes tratados com colágeno de absorção rápida ou membranas de ePTFE revelaram uma melhor regeneração periodontal. Os autores concluíram que estas membranas são capazes de estimular o reparo do tecido conjuntivo periodontal, enquanto que as membranas de colágeno de absorção lenta levaram a uma regeneração periodontal significativamente inferior.

Araújo et al., em 1997, fizeram um experimento em 8 cães para descrever a formação dos tecidos periodontais nos defeitos de furca grau III tratados por Regeneração Tecidual Guiada (RTG). Após extração dos 20s e 40s pré-molares inferiores, os defeitos de furca foram produzidos nos 30s pré-molares e cronificados por três semanas. Após este período, os dentes receberam controle

de placa por 15 dias e, posteriormente, tratamento regenerativo cirúrgico. Uma membrana Resolut® foi adaptada fechando as entradas vestibular e lingual das furcas. Os cães foram sacrificados entre 2, 4, 8, e 20 semanas após colocação das membranas. Os resultados histológicos mostraram: em 2 semanas os defeitos de furca continham tecido de granulação rico em células; com 4 semanas as furcas estavam preenchidas, principalmente com tecido conjuntivo. Com 8 semanas, um osso misto ocupava a área central da furca, enquanto tecido conjuntivo e cemento foram observados na porção lateral. As áreas de furca, após 20 semanas da colocação das membranas, foram preenchidas com nova formação de cemento, ligamento periodontal e osso. Os resultados demonstram que defeitos de furca grau III tratados com RTG podem ter sucesso na cicatrização com formação de novo cemento, ligamento periodontal e osso.

Araújo et al., em 1998, realizaram outro estudo para descrever os tecidos periodontais formados após RTG com diferentes tipos de barreiras absorvíve is aplicadas em defeitos de furca grau III. Utilizaram 5 cães, nos quais os 2os. e 4os. pré-molares mandibulares foram extraídos. Os defeitos de furca foram criados cirurgicamente nos 3os. pré-molares mandibulares e cronificados por 21 dias. Após este período, um regime de controle de placa foi iniciado. Após duas semanas, cirurgias reconstrutivas foram realizadas. Foram utilizadas duas diferentes barreiras: Resolut® Grupo A, e Guidor® Grupo B. Seis meses após a cirurgia reconstrutiva, os animais foram sacrificados. Os resultados histológicos mostraram que em ambos os grupos as superfícies radiculares

estavam cobertas com um tipo de cemento celular com fibras intrínsicas e extrínsicas. A proporção de osso medular e ligamento periodontal, porém, foi substancialmente maior no grupo A. No grupo B, uma área de defeito de furca prévia foi consistentemente ocupada por um granuloma. Isto sugere que a presença de um granuloma na cicatrização de defeitos de furca impede a neoformação óssea. Os autores concluíram que o uso de ambas as barreiras absorvíveis em defeitos de furca grau III promovem formação de nova inserção sobre as superfícies radiculares expostas e instrumentadas.

Em 2000, Rossa Jr. et al., fizeram um estudo para avaliar, histológica e histometricamente, o efeito da aplicação tópica de fator de crescimento de fibroblastos básicos (b-FGF) associado com Regeneração Tecidual Guiada (RTG) no tratamento de defeitos de furca grau III, induzidos cirurgicamente em cães. Os 2os. e 4os. pré-molares inferiores de cinco cães foram usados neste estudo e divididos em três grupos: Grupo 1 (controle) - tratados com raspagem e alisamento radicular, condicionamento com tetraciclina hidroclorídrica (125mg/ml) e RTG com membrana de colágeno; grupo 2 - mesmo tratamento do grupo 1 mais 0.5 mg de b-FGF; grupo 3 - mesmo tratamento do grupo 1 mais 1.0 mg de b-FGF. Após um período de cicatrização de 90 dias, os animais foram sacrificados. Os resultados da análise descritiva indicaram maior grau de regeneração periodontal em ambos os grupos tratados com b-FGF. Concluiu-se que o b-FGF, especialmente em pequenas doses, pode aumentar os

resultados regenerativos obtidos com RTG em lesões de furca grau III, conduzindo para um maior preechimento destes defeitos com novo tecido ósseo.

Proposição

Avaliar histologicamente, em cães, a eficiência da proteína derivada da matriz do esmalte no tratamento de lesões de furca grau III quando associada a:

- técnica de RTG com membrana absorvível, - técnica de RTG com membrana absorvível e preenchimento da lesão com vidro bioativo.

Foram empregados para a realização da pesquisa seis cães de raça indefinida, mantidos em cativeiro no Biotério do Campus de Araraquara – UNESP, sob tratamento profilático de vacina ções e vermifugação. Os animais encontravam-se com peso corporal variando de 11 a 14 kg, e não apresentavam doenças ou alterações sistêmicas evidentes. Quanto às condições orais, apresentavam dentição permanente completa e ausência de perda óssea e de sinais clínicos de doença periodontal destrutiva.

Foram utilizados os 2os. e 4os. pré-molares inferiores de ambos os lados, de cada cão, totalizando 24 dentes.

A parte experimental clínica constou das seguintes etapas: 1- Criação e cronificação das lesões de furca.

2- Tratamento das lesões.

3- Período de cicatrização periodontal. 4- Análise histológica e histométrica

1 - Criação dos defeitos ósseos

Para a criação cirúrgica dos defeitos, os animais foram pesados e sedados com Rompun (Bayer do Brasil S/A, São Paulo, SP), um pré-anestésico à base de cloridrato de dihidro tiazina, aplicado por via intramuscular numa proporção de 1,5 ml/10 kg. Posteriormente, os animais foram submetidos à

anestesia geral, por injeção endovenosa de Tiopental Sódico (ABBOTT Laboratórios do Brasil Ltda., São Paulo, SP), na concentração de 20 mg/ml e na proporção de 0,5 ml/kg, dividida em dose inicial e doses de manutenção.

Os animais foram mantidos com soro fisiológico durante o ato cirúrgico, possibilitando a manutenção anestésica, a hidratação e a medicação endovenosa quando necessária.

Tomadas radiográficas iniciais pela técnica periapical da bissetriz permitiram a avaliação do nível ósseo e das características anatômicas da área de furca dos dentes de interesse. Os dentes foram examinados clinicamente quanto à presença de bolsas periodontais, sangramento e recessão gengival.

Em seguida, os dentes foram raspados com o auxílio de curetas de Gracey no 7-8 e universais McCall n.º 13-14 (Neumar, São Paulo,SP), para a remoção de placa bacteriana e cálculo de forma a padronizar as condições gengivais do grupo.

Foi realizada anestesia local por meio da técnica infiltrativa com Lidocaína a 2% (Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Itirapina, SP), para obter melhor hemostasia durante o ato cirúrgico. Posteriormente, foi realizada uma incisão sulcular em todas as faces do 1o pré-molar ao 1o molar inferior, com bisturi Bard Parker e lâmina n.º 15, deslocando-se um retalho mucoperióstico com espátula n.º 7 (Duflex, Rio de Janeiro, RJ) a fim de expor as tábuas ósseas vestibular e lingual. Após o acesso ao tecido ósseo, procedeu-se à remoção do tecido conjuntivo gengival remanescente sobre a superfície radicular,

e exodontia dos 1os. e 3os. pré-molares com o propósito de facilitar posteriormente a reposição coronária do retalho.

O passo subseqüente foi a criação dos defeitos nas áreas de furca dos 2os. e 4os. pré-molares (Figura 1). Com o auxílio de uma fresa esférica Carbide n.º 2 (KG Sorensen, São Paulo, SP) em baixa velocidade, sob refrigeração com solução salina, e de microcinzéis de Ochsenbein n.º 1 e 2 (Neumar, São Paulo, SP) e de Rhodes n.º 36 e 37 ( Neumar, São Paulo, SP ), foi realizada a osteotomia na região de furca. Os defeitos criados apresentaram uma altura no sentido cérvico apical nos 2os. pré-molares de 4 mm e nos 4os. pré-molares de 5 mm tanto por vestibular como por lingual, criando-se desta forma, um defeito de furca Grau III, segundo a classificação descrita por Hamp & Nyman ( 1992 ).

A superfície radicular foi raspada com curetas de furca PL-N n.º 1-2, 3-4, 5-6 (Neumar, São Paulo, SP) de forma a remover as fibras de Sharpey e o tecido cementário. As cavidades ósseas foram preenchidas com guta percha (Odahcam, Herpe Produtos Dentários Ltda., Rio de Janeiro,RJ) para dificultar a regeneração espontânea dos defeitos. Os retalhos foram reposicionados e suturados com fio de seda Ethicon 4.0 Atraloc (Johnson & Johnson, São Paulo, SP), por meio de sutura interrompida interproximal. Quando necessário, suturas suspensórias foram realizadas posicionando o retalho vestibular de forma a cobrir toda a guta percha.

As suturas foram removidas uma semana após o procedimento cirúrgico. Os animais foram mantidos sem nenhum controle de

higiene oral, com dieta macia constituída de ração acrescida de água por um período de oito semanas para favorecer o acúmulo de placa bacteriana e propiciar um ambiente bucal favorável ao desenvolvimento da doença periodontal. Após este período, os animais foram pesados e anestesiados para que se realizasse a remoção da guta percha das áreas de furca, com auxílio de curetas de Gracey n.º 7-8 (Neumar, São Paulo, SP) e de uma sonda exploradora n.º 5 (Duflex, Rio de Janeiro, RJ). Neste momento, os animais receberam tratamento de raspagem e profilaxia dental com pasta (Odahcam, Herpe Produtos Dentários Ltda., Rio de Janeiro) e taça de borracha para padronizar o grau de inflamação gengival e facilitar a próxima etapa cirúrgica.

2 - Tratamento das lesões

Uma semana após a profilaxia dental, os animais foram novamente anestesiados e realizou-se um retalho mucoperióstico na região, deslocado de forma a expor as lesões de furca criadas na etapa cirúrgica anterior.

Os defeitos foram curetados e as superfícies radiculares raspadas e aplainadas com o auxílio de curetas para furca PL-N n.º 1-2, 3-4, 5-6 e de Gracey n.º 7-8 (Neumar, São Paulo, SP). Em seguida, realizou-se uma marcação com broca carbide nº 1/2 na superfície radicular do defeito, na altura da crista óssea alveolar, para auxiliar na delimitação do defeito na análise histológica. Os dentes foram então divididos aleatoriamente, por meio de sorteio, em três grupos:

Grupo Teste 1 (G1) - as superfícies radiculares receberam tratamento químico com EDTA 24% (Farmácia Santa Paula, Araraquara, SP) por dois minutos, com bolinhas de algodão, esfregadas sobre a superfície e trocadas a cada 30 segundos. Em seguida, a superfície radicular foi lavada com soro fisiológico e aplicou-se o Emdogain® (Biora Inc., Chicago IL, USA) previamente preparado sobre a mesma. O preparo do Emdogain®, procedido15 minutos antes de sua aplicação, consistiu na mistura do veículo Alginato de Propileno Glicol (PGA) com a proteína derivada da matriz do esmalte (fornecido em dois frascos distintos). Com o auxílio de uma seringa estéril, o produto foi removido do frasco por aspiração e inserido nas lesões de furca de forma a entrar em contato com toda superfície radicular das mesmas. Os defeitos foram então preenchidos com vidro bioativo - PerioGlass® (US Biomaterial Corporation. Florida, USA). Os grânulos foram misturados com solução salina e, com o auxilio de uma espátula nº 7 (Duflex, Rio de Janeiro, RJ), foram colocados nos defeitos e protegidos com membrana absorvível - Gore Resolut XT (W.L.Gore & Associates, Inc. Arizona). A membrana foi fixada por meio de suturas suspensas ao redor do colo dentário, com fio Vicryl Ethicon 4.0 (Johnson & Johnson, São Paulo, SP), recobrindo todo o defeito e estendendo-se 2 a 3mm sobre o tecido ósseo ao redor do mesmo (Figura 2).

Grupo Teste 2 (G2) - Os defeitos receberam o mesmo tratamento descrito no Grupo (G1), exceto a colocação do vidro bioativo.

Grupo Controle (G3) – Os defeitos foram preenchidos com o vidro bioativo e protegidos com a membrana absorvível, de forma semelhante ao Grupo G1, porém não receberam o Emdogain® e nem o EDTA 24%.

Os retalhos foram reposicionados coronariamente por meio de suturas interrompidas interproximais e suspensórias, com fio de seda Ethicon 4.0, Atraloc (Johnson & Johnson, São Paulo, SP) (Figura 3).

3 - P e ríodo de cicatrização periodontal

Este período compreendeu do pós -operatório imediato ao tratamento das lesões de furca ao momento do sacrifício dos animais, totalizando 90 dias. Durante esta fase, os cães foram mantidos com alimentação macia para evitar a ruptura dos pontos ou o deslocamento do material de enxerto.

Durante todo o transcorrer do período de cicatrização periodontal, foi realizado controle de placa bacteriana através da aplicação tópica de gel de digluconato de clorexidina a 0,2% (Farmácia Santa Paula, Araraquara, SP) sobre os dentes e tecidos gengivais com o auxílio de um pincel de pêlos macios nos primeiros 15 dias pós-operatórios e de uma escova dentária macia posteriormente. A freqüência das aplicações foi de cinco vezes por semana. As suturas foram removidas no 10o dia após as cirurgias.

4 - Obtenção dos dados histológicos e histométricos

Finalizado o período de 90 dias (Figura 4), os animais foram anestesiados e sacrificados com uma dose letal de solução de Cloreto de Potássio

a 19,1%, e os dentes removidos em bloco e colocados em solução de formol a 10% por 48h para fixação. A seguir as peças foram reduzidas e lavadas em água corrente por 24h e, então, colocadas em solução de Morse (partes iguais de ácido fórmico a 50% e citrato de sódio a 20%) para descalcificação, envolvidas individualmente em uma compressa de gaze e suspensas por um barbante, de forma a permanecerem submersas na solução, porém sem entrar em contato com o fundo do recipiente.

A solução de descalcificação foi trocada a cada dois dias, e o grau de desmineralização da peça avaliado com uma agulha descartável. O período de descalcificação foi, em média, de quatro meses. Após a descalcificação adequada, as peças foram novamente lavadas em água corrente por 24h e colocadas em solução de sulfato de sódio a 5% por 48h, com o objetivo de neutralizar o ácido da solução anterior. Após nova lavagem em água corrente por 24h, foi realizada a tramitação laboratorial de rotina, com desidratação em álcool em ordem crescente de concentração até o álcool absoluto, diafanização em xilol e inclusão em blocos de parafina.

A microtomia foi realizada em micrótomo automático (Jung Supercut 2065 – Leica Instruments GmbH, Heidelberg, Germany), obtendo cortes seriados com 5 micrômetros de espessura ao longo de toda extensão do bloco. Estes cortes foram realizados no plano longitudinal dos dentes, no sentido mésio-distal, de forma a obter uma visão panorâmica da área de furca.

Para análise histológica descritiva e histométrica foram selecionados cinco cortes, incluindo o primeiro e último corte que evidenciava,

em ambas as raízes, a marca de referência na altura da crista óssea, confeccionada no momento do tratamento do defeito. Estes dois cortes assim selecionados serviram de referência para a seleção dos outros três, selecionados de forma a apresentarem uma distância constante entre cada um e eqüidistantes entre os dois primeiros, representando as porções vestibulares, médias e linguais da furca no sentido vestíbulo-lingual.

As técnicas de coloração empregadas foram Hematoxilina e Eosina (H/E) e tricrômico de Masson.

Na análise histológica descritiva, foram avaliados o tipo e qualidade dos tecidos neoformados, reação tecidual ao material, presença de reação inflamatória, reabsorção radicular, anquilose, migração epitelial e regeneração tecidual.

Para a realização das medições foram utilizados: microscópio óptico com objetiva de aumento de 2.5/0.10 (Diastar – Cambridge Instruments, Buffalo, NY, USA), câmara de vídeo (DXC-107AP – Sony Eletronics Inc., Japan) acoplada a este microscópio e conectada a um microcomputador com um software analisador de imagens digitalizadas Jandel Sigma Scan Pro, Version 2.0 (Jandel Corporation).

Na análise histométrica foram obtidas as seguintes medições lineares e de área:

1- Extensão radicular total do defeito – superfície radicular compreendida entre as marcações produzidas nas raízes mesial e distal.

2- formação cementária – soma das extensões lineares da superfície radicular do defeito recobertas por cemento novo.

3- tecido conjuntivo – soma das extensões lineares da superfície radicular do defeito não recoberta por cemento novo ou epitélio, estando o tecido conjuntivo em contato direto com a superfície radicular.

4 - regeneração periodontal – soma das extensões lineares da superfície radicular do defeito recobertas por novo cemento adjacente a novo

osso.

5- migração epitelial – extensão linear da superfície radicular do defeito recoberta pelo tecido epitelial.

6- superfície livre – extensão linear da superfície radicular do defeito não ocupada por qualquer tipo de tecido e em contato com placa bacteriana.

7- área total do defeito – área da furca delimitada apicalmente por uma reta unindo a base das duas marcações radiculares.

8- área de tecido ósseo – porção da área total do defeito preenchida por osso novo.

9- área de tecido mole – porção da área total do defeito preenchida por tecido conjuntivo e epitelial.

10- área de região vazia – porção da área total do defeito sem a presença de qualquer tipo de tecido, ocupada por placa bacteriana depositada na superfície radicular.

Metodologia Estatística

Os dados obtidos da análise histométrica, referentes à extensão linear da raiz, em milímetros, e à área da lesão, em milímetros quadrados, apresentados na tabela A1 do Apêndice A, foram transformados em valores porcentuais, respectivamente, em relação à extensão linear total da raiz e em relação à área total da lesão (tabela A2, do Apêndice A). Com esta transformação, procurou-se minimizar a interferência do tamanho dos dentes no resultado das análises.

Baseado no delineamento do estudo, no qual há três tratamentos diferentes, aplicados aleatoriamente nos dentes dos cães, e mais de uma variável medida em cada unidade experimental (dente), o procedimento estatístico considerado mais adequado foi a análise de variância multivariada, seguido, se necessário, por análises de variância univariadas. A análise multivariada permite a comparação simultânea das médias populacionais, mantendo inalterada a magnitude da taxa escolhida de erro tipo I, o que não aconteceria se fossem empregadas diversas análises univariadas para essa mesma comparação conjunta das médias. Além disso, a análise de variância multivariada leva em consideração as correlações entre as variáveis.

A análise multivariada foi desenvolvida para provar diferenças entre os três grupos G1, G2 e G3, com base nos testes de Lambda de Wilks e o R de Rao. Estabeleceu-se o nível de 5% de significância, que representa a probabilidade de se cometer um erro do tipo I, isto é, errar ao se afirmar que há algum efeito entre os grupos de tratamentos.

A validade da análise de variância depende de que os dados representem amostras aleatórias da população de interesse e que as observações, nas diversas unidades experimentais, sejam independentes. Essas condições se verificaram neste trabalho. Outra pressuposição é a de normalidade, tanto multivariada quanto nas variáveis individuais. No entanto, o número reduzido de unidades experimentais para cada grupo, não permitiu uma verificação rigorosa da normalidade. Ela, então, foi analisada apenas graficamente, já que afastamentos da normalidade afetam levemente a taxa de erro do tipo I.

Além dessas condições, a análise de variância multivariada pressupõe que haja igualdade de variância entre todos os grupos de dados, tal como na análise univariada, e também que a correlação entre duas variáveis quaisquer seja a mesma em todos os grupos de dados, conhecida como suposição de mesma covariância. Diz-se que é necessário ter uniformidade da matriz de variâncias e covariâncias. Essa condição de uniformidade foi colocada a prova pelo teste de Box M.

Como a soma de quatro variáveis de extensão linear da raiz (formação cementária, tecido conjuntivo, migração epitelial e superfície livre) totalizou 100%, pois representam frações da extensão total, o procedimento da análise multivariada não poderia ser aplicado, devido à existência de colinearidade na matriz de variâncias e covariâncias. Então se desconsiderou a variável que aparentou ser a menos importante na análise dos dados. Analogamente, a soma das três variáveis de área da lesão (tecido ósseo, região vazia e tecido mole) também totaliza 100% e uma delas foi desconsiderada da análise.

Fig. 1. Criação cirúrgica dos defeitos de furca.

Fig. 2. Adaptação das membranas fechando as entradas de furca.

Fig. 3. Sutura dos retalhos.

Fig. 4. Período de cicatrização após 90 dias.

Resultados

Observações Clínicas

Durante os 90 dias de cicatrização, um dos animais foi excluído do estudo por ter apresentado problemas sistêmicos. Nos demais cães, as áreas tratadas cicatrizaram-se sem nenhuma intercorrência. No momento do sacrifício observou-se clinicamente a presença de recessão gengival (figura 4), variando de 1 a 3mm expondo a entrada das furcas em todos os dentes, exceto em um dente do grupo G2. Durante o processamento histológico houve a perda de um elemento dentário.

Desta forma, para a análise histológica descritiva e histométrica, foram utilizados sete dentes do grupo G1, sete dentes do grupo G2 e cinco dentes do grupo G3, totalizando 19 dentes.

Análise Histológica Descritiva

As principais características microscópicas das regiões dos defeitos de furca foram abordadas e descritas de acordo com o tratamento realizado. Para a realização da análise histológica descritiva, as lâminas foram codificadas de acordo com o animal e grupo, de forma que o patologista não tivesse conhecimento a que grupos pertenciam.

Grupo Teste 1 (Figuras 5 e 6)

As marcas produzidas cirurgicamente na superfície radicular, na base do defeito, estavam parcial ou totalmente revestidas por cemento celularizado neoformado. A partir da “marca”, a neoformação cementária mostrou-se heterogênea, variando em espessura e altura.

Justapondo-se ao cemento, encontravam-se células mononucleares formando camada única, sugestiva de cementoblastos. Em continuidade, observava-se feixe de fibras de colágeno de variável espessura, que se unia ao cemento neoformado. Em alguns dentes observava -se neoformação óssea vizinha a estes feixes colágenos, limita da à região da “marca” radicular, na base do defeito. Na região superior da lesão, os feixes de fibras de colágeno eram mais delgados e entremeados por intenso infiltrado inflamatório composto por células mononucleares ou fibroblastos, figuras vasculares de diversos calibres e paredes delgadas.

O tecido conjuntivo formava papilas que se interdigitavam com o epitélio pavimentoso estratificado, de variável espessura e extensão.

Próximo ou junto ao teto da furca observou-se variável quantidade de tecido amorfo, sugestivo de placa bacteriana.

Grupo Teste 2 (Figuras 7 e 8)

O teto da furca exibia variável quantidade de placa bacteriana, que se caracterizava como uma massa amorfa, acelular. Subjacente, observava-se tecido epitelial e tecido conjuntivo composto por feixes de fibras de

colágeno de diversas espessuras. Na porção superior próxima ao epitélio e na periferia da lesão, a densidade fibrótica era menor que no centro e na base da lesão.

Entremeando-se com as fibras colágenas, o tecido conjuntivo exibia processo inflamatório mononuclear variando de escasso a moderado, células fusiformes, figuras vasculares de diversos calibres e parede delgada.

Em alguns espécimes observavam-se trabéculas ósseas neoformadas, que se anastomosavam entre si, e limitavam-se ao centro da lesão.

Havia neoformação de cemento na área marcada, de característica celular e que em alguns espécimes, estendia -se até o terço médio da lesão.

Um único espécime apresentou neoformação óssea em toda porção apical e média da lesão, acompanhando a neoformação cementária e apresentando espaço periodontal regular ocupado por fibras colágenas sugerindo novo ligamento periodontal.

Grupo 3 Controle (Figuras 9 e 10)

Neste grupo, o tecido epitelial estava presente, exibindo-se com variável espessura. Do mesmo modo, a reação inflamatória subjacente, composta principalmente por células mononucleares, também mostrava-se variando de branda a moderada intensidade, que parecia ser resultante da presença de placa bacteriana presente no teto da furca. O tecido conjuntivo era denso na região central da lesão, composto por feixes de fibras de colágeno mais compactos

entremeados por células fusiformes e estruturas vasculares pequenas. Nas áreas laterais e superiores mais próximas das estruturas mineralizadas, a densidade de fibras de colágeno era menor.

A neoformação cementária foi heterogênea, ocupando total ou parcialmente a área de marcação experimentalmente, com característica celular e altura variada. A neoformação óssea limitou-se a área da “marca” radicular em alguns espécimes.

Figura 5. Grupo G1 – Vista panorâmica da área da lesão de furca induzida experimentalmente e tratada com Proteína derivada da matriz do esmalte, vidro bioativo e membrana. Observa-se neoformação cementária e óssea próximas à “marca” radicular (M), tecido conjuntivo de granulação (CJ) até o terço médio, recoberto por epitélio pavimentoso estratificado (E). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (40X).

Figura 6. Grupo G1 – Detalhe da figura anterior, mostrando área da “marca” (M) induzida experimentalmente. Observa-se neoformação de cemento celular (CE) óssea (O), interpostos por fibras colágenas inseridas em ambos, sugerindo novo ligamento periodontal (LP). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (100X).

Figura 7. Grupo GII – Visão panorâmica da área da lesão induzida experimentalmente e tratada com Emdogain® e membrana. Observava -se tecido conjuntivo fibroso (CJ), recoberto por epitélio (E) com moderada hiperplasia, estruturas vasculares e pontos de inflamação (I). Na área da “marca” (M), observa-se neoformação cementária e óssea. Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (25X).

Figura 8. Grupo GII – Maior aumento da figura anterior mostrando área “marcada” (M), com neoformação de cemento celular (CE), novo ligamento periodontal (LP) neoformação óssea (O). Dentina (D). H/E. Reichert & Jung (100X).