3.1- ESTRUTURA GERAL DOS ENSAIOS EXPERIMENTAIS
Com base na literatura analisada, a estrutura deste trabalho foi organizada compreendendo as etapas e atividades mostradas na Figura 8. Na sequência, estão descritos o material e os procedimentos utilizados nos ensaios experimentais.
Figura 8: Estrutura geral para os métodos de análise e sequência dos ensaios. - Estratégias para a amostragem, diagnóstico e proposição de recomendações; - Coleta de contaminantes de sistemas de distribuição de água industriais; - Preparo dos inóculos microbianos individuais ou mistos utilizando-se coleções de cultura e os contaminantes isolados;
- Seleção dos biocidas.
4. Triagem das membranas com biocidas em condições basais 5. Análise da eficácia das membranas com biocidas em condições de uso simuladas
6. Comparação final dos resultados:
Formulações da membrana com maior competência para debelar contaminantes representativos do sistema - Avaliação da qualidade microbiológica inicial dos biopolímeros contra microrganismos padronizados, para a seleção da composição de base da membrana.
- Preparação das membranas e avaliação da conformidade para os ensaios; - Atividade das membranas contra microrganismos planctônicos em culturas padronizadas isoladas e mistas;
- Atividadedas membranas contra biofilmes;
- Seleção e caracterização da membrana antimicrobiana; - Incorporação dos biocidas na composição da membrana.
1. Avaliação do sistema estudado: Amostragem, preparo de inóculos e triagem dos biocidas convencionais 2. Ensaios preliminares: Análise da atividade antimicrobiana dos biopolímeros 3. Preparação das membranas biopoliméricas: Seleção do biopolímero e adição dos biocidas
- Atividade preliminar das membranas contra culturas padronizadas; - Aplicação das membranas sobre contaminantes de sistema de água.
- Análise do desempenho das membranas em condições de lixiviação; - Atuação contra microrganismos reconhecidamente patogênicos; - Resistência à exposição microbiana continuada.
3.2- MATERIAL
3.2.1- Biopolímeros
Considerando-se os parâmetros que fazem da quitosana um material de características diversificadas e que podem ter influência em sua atividade antimicrobiana, foram avaliadas as seguintes matérias-primas para a confecção das membranas:
- Quitosana nacionalmente processada, obtida de carapaças de caranguejos com grau de desacetilação mínimo de 98% (obtida da Polymar) e quitosana de grau técnico, com desacetilação mínima de 85% (Sigma Chemical Co., código: C3646).
- Quitosana de baixa massa molar (150 kDa, Sigma Chemical Co., lote: 06720AE) e de média massa molar (400 kDa, Sigma Chemical Co., lote: 07918TE).
- Lactato de quitosana (oligossacarídeo de 340 kDa, Sigma Chemical Co., lote: 11925MU).
Além das diferentes quitosanas, testou-se também o alginato de sódio de baixa viscosidade (Sigma Chemical Co.) para avaliação comparativa entre as cargas superfíciais dos biopolímeros e sua influência na atividade antimicrobiana das membranas.
O uso de polissacarídeos de baixa e média massa molar foi realizado com vistas a facilitar o processamento dos materiais por ocasião da produção das membranas.
3.2.2- Agentes antimicrobianos complementares
Alguns dos principais biocidas comumente empregados para o tratamento microbiológico de uma vasta diversidade de segmentos industriais foram utilizados para a avaliação da capacidade de erradicação da microbiota estudada, bem como para serem incorporados como agentes coadjuvantes na composição da membrana biopolimérica. Estes produtos, apresentados na Tabela 5, foram submetidos à consulta de suas fichas técnicas disponibilizadas pelos fabricantes e selecionados por apresentarem propriedades relevantes que corroboram com a aplicação almejada, apresentando grande potencial para o tratamento de um amplo espectro de contaminantes.
Tabela 5: Agentes antimicrobianos empregados na formulação das membranas para avaliação
do espectro de atuação contra contaminantes de sistema de água.
Produto Ingrediente(s) ativo(s)
Conteúdo de ativos (% m/v)
Descrição e propriedades de destaque
Biocida 1 Fosfato hidrogenado de zircônio e sódio e prata 10% em massa de prata
Confere ação antimicrobiana aos materiais tratados, tais como recipientes plásticos para contato com alimento ou água, aparatos para purificadores de ar, materiais de construção para banheiros e cozinhas (EPA, 2002) e no tratamento de infecções em feridas (Atiyeh et al., 2007).
Biocida
2 Cloreto de prata 2%
Eficácia de acordo com a norma JIS Z 2801 (2000)*.
Atua principalmente contra o desenvolvimento de bactérias.
Produto com baixo AOX (Adsorbable Organic
halogens) e isento de VOC (Volatile Organic Compounds).
Biocida 3
Nitrato de prata; 1,5%
Eficácia de acordo com a norma JIS Z 2801 (2000)*. Benzisotiazolinona (BIT) 9% Biocida 4 n-octilisotiazolinona (OIT) encapsulada em sílica 8%
Utilizado para tratamento de superfícies, com liberação controlada do ingrediente ativo, proporcionando um maior período de atuação. Produto com baixa toxicidade**.
Biocida 5
n-octilisotiazolinona
(OIT) 8%
Utilizado para tratamento de superfícies. Atua contra o desenvolvimento de bactérias e principalmente de fungos.
Biocida 6
Quaternário de
amônio 80%
Utilizado em tratamento de água na indústria de papel e em produtos para uso humano, como em lenços umedecidos. Pode ser utilizado para contato direto com a pele no máximo a 0,12%. Efetivo contra L. pneumophila.
Biocida 7
DBNPA; 12% Utilizado para a sanitização de equipamentos
industriais contra incrustações e recomendável para a preservação de membranas de Osmose Reversa. Compatível com todos os tipos de aplicações de tratamento de água e eficaz contra a erradicação de bactérias redutoras de sulfato
(anaeróbias), contaminantes planctônicos
persistentes, L. pneumophila e microrganismos sésseis como boa alternativa a biocidas oxidantes. Produto com baixa toxicidade**.
Bronopol; 10% CIT/MIT (Clorometil/Metil- isotiazolinona) 1% Biocida 8 Polihexametileno- biguanida (PHMB) 20%
Produto utilizado como desinfetante, limpador e esterilizante, também para a proteção de água de banho e em produtos para cuidados pessoais.
* Norma JIS Z 2801-2000: Aprovação especial para uso em superfícies higiênicas aplicáveis em áreas tais como hospitais e indústria de processamento de alimentos ou em demais ambientes que apresentem elevado risco de infecção microbiana e onde criteriosos níveis de higiene são requeridos.
** Produto com baixa toxicidade, apresentando os seguintes atributos: seguro no contato com alimentos, possui facilidade de inativação em casos emergenciais, é biodegradável e tem baixo potencial de bioacumulação.
Estes biocidas estão codificados sequencialmente e identificados pela sua composição química. As identidades de seus nomes comerciais foram preservadas, com exceção do Biocida 1 (AlphaSan® RC2000, Milliken), por este fabricante ter parceria em pesquisas com o grupo de trabalho na área de Biomateriais da FEQ/Unicamp, facilitando assim a correlação dos resultados com outros trabalhos. Por outro lado, a ausência dos nomes comerciais dos demais biocidas justifica-se, uma vez que a aplicação estudada ainda não faz parte do escopo direto de atuação da empresa (Biocidas 2 a 8, Thor Brasil Ltda.) e sua política interna requer validação paralela com dados de prática industrial para a divulgação definitiva de sua efetividade. Porém, tais agentes ativos podem ser facilmente localizados e estão comercialmente disponíveis em diferentes empresas fabricantes e/ou fornecedoras de biocidas, tais como Nalco, Dow, Miracema e Ipel, dentre outras.
3.2.3- Diluentes e reagentes
Ácido acético glacial P.A. (Ecibra) foi utilizado para a solubilização da quitosana para o preparo das membranas poliméricas. Hidróxido de sódio P.A. (Synth) foi utilizado para a neutralização do excesso de ácido após a manufatura das membranas contendo quitosana e cloreto de cálcio (Synth) foi utilizado como agente reticulante para as membranas contendo alginato. O corante cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), marca Inlab, foi utilizado nos meios de cultura, quando aplicável, para a evidenciação de células microbianas. O corante Congo Red Agar (CRA), marca Inlab, foi utilizado nos meios de cultura, quando aplicável, para a evidenciação de matriz extracelular.
3.2.4- Meios de cultura
Para a detecção de microrganismos por grupos, foram utilizados para bactérias aeróbias totais o meio Tryptic Soy Agar (TSA, Difco), para fungos (bolores e leveduras) o meio Sabouraud Dextrose Agar (SDA, Difco), para enriquecimento celular um caldo nutritivo (Nutrient Broth, Oxoid) e um meio pobre em nutrientes (Mineral Salts Agar), formulado de acordo com a composição explicitada na norma AATCC 147 (1998), originalmente utilizada para a avaliação antimicrobiana de materiais têxteis. Os mesmos foram preparados de acordo com as instruções dos fabricantes, esterilizados a 121ºC por 20 minutos e resfriados a 40ºC, antes do uso.
3.2.5- Microrganismos
Os microrganismos selecionados para os ensaios foram contaminantes representativos da água, do ar, de superfícies e da microbiota humana originários de coleções de cultura ou de estudos de isolamento de cepas de ambientes industriais (Tabela 6) para avaliação da atividade antimicrobiana dos biopolímeros. Estas culturas foram utilizadas individualmente ou como suspensões mistas, em concentração mínima de 108 UFC/mL para bactérias e de 107 UFC/mL para fungos, para que se tivesse uma massa celular robusta, e seu uso direcionado ao atendimento da finalidade proposta em cada ensaio.
Adicionalmente, foram utilizados microrganismos coletados de diferentes ambientes de um vestiário industrial, nos quais foi detectada a presença de contaminantes oriundos de sistemas de distribuição de água. O nome da empresa não é divulgado por questões éticas. As formas de coleta e isolamento dos microrganismos são descritas a seguir, no item 3.3.1.2. Os tipos microbianos específicos detectados são descritos no item 4.1.2 do Capítulo Resultados e Discussão.
3.3- MÉTODOS
As manipulações assépticas foram realizadas em laboratório microbiológico, equipado com câmara de fluxo laminar vertical provida de filtro HEPA Classe II/A1 (Veco, VLFS-12) e lâmpada UV. Todos os ensaios foram realizados em triplicata, com duas repetições por experimento e os resultados são reportados pela média de leitura das avaliações (n=6).
3.3.1- Avaliação microbiológica do sistema estudado
3.3.1.1- Estratégias para a conduta de amostragem, diagnóstico microbiológico e proposição de recomendações
Para a análise da criticidade de sistemas envolvendo água, sob o ponto de vista microbiológico, de modo a se obter um panorama geral do cenário industrial neste quesito, a avaliação microbiológica de amostras representativas foi realizada em 15 empresas totais, abrangendo 15 amostras coletadas em cada um dos pontos críticos observados nos processos.
Tabela 6: Culturas empregadas para a avaliação da atividade antimicrobiana dos
biopolímeros bioativos associados ou não aos outros agentes testados.
Microrganismo Cepas Características
C ul tu ras par a us o nos ens ai os pad ron iza do s Pseudomonas aeruginosa* ATCC 9027
Bactéria Gram-negativa, de fácil adaptação a diferentes ambientes.
Escherichia coli*
ATCC 8739 Bactéria Gram-negativa, indicadora de contaminação fecal em água.
Staphylococcus
aureus* ATCC 6538
Bactéria Gram-positiva, naturalmente presente na pele humana, mas com alta capacidade de se tornar patogênica.
Aspergillus
niger** ATCC 6275
Bolor (fungo filamentoso) formador de esporos de fácil dispersão, comum em diversos ambientes e frequentemente causador de doenças respiratórias.
Candida
albicans** ATCC 10231
Levedura (fungo unicelular), importante patógeno envolvido em infecções transmitidas por dispositivos médicos e de comum associação com bactérias.
C ul tu ras par a us o em ens ai os e sp ec íf icos Serratia marcescens
CBMAI 325 Bactéria Gram-negativa, de crescimento lento.
Staphylococcus epidermidis
ATCC 9142
Bactéria padrão para ensaio de biofilmes, formadora de matriz extracelular abundante
(Cerca et al., 2005).
ATCC 12228 Bactéria padrão para ensaio de biofilmes, não formadora de matriz extracelular
(Mathur et al., 2006). Pseudomonas aeruginosa Isolado industrial, cedido pela empresa Thor Brasil Ltda.
Bactéria Gram-negativa resistente a biocida clorado (500 ppm). Pseudomonas mendocina (patogênico) Isolado ambiental, cedido pela empresa Thor Brasil Ltda.
Bactéria Gram-negativa que pode causar infecções oportunistas.
Enterobacter gergoviae (patogênico)
ATCC 33028
Bactéria Gram-negativa, comumente utilizada em ensaios de produtos para lavagem das mãos contendo medicamentos.
* Cepa utilizada no Inóculo misto de Bactérias ** Cepa utilizada no Inóculo misto de Fungos
As empresas selecionadas para esta investigação apresentam diferentes portes e estruturas de processo, contemplando segmentos industriais envolvidos com a fabricação de cosméticos (produtos relevantes: shampoos, cremes, etc), de domissanitários (produtos relevantes: detergentes, amaciantes, etc) e de processamento de artigos para uso escolar (produtos relevantes: colas, massas de modelar, etc). Estes processos foram escolhidos por produzirem itens de uso humano passíveis de controles rigorosos, bem como por disporem de intenso uso de seus sistemas de distribuição de água ao longo do processo, além de serem acessíveis a contribuir para este estudo. Os seus nomes foram mantidos em sigilo por questões éticas.
A sistemática utilizada baseou-se nas diretrizes reportadas para a Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC ou HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point HACCP), conforme ASTM E 2590 (2015), muito utilizada para a garantia de segurança em diversos processos, mas especialmente na indústria de alimentos, é referida como fundamento de regulamentação (Resolução RDC nº 12, 2001).
3.3.1.2- Coleta, isolamento e caracterização de contaminantes críticos identificados de sistemas de distribuição de água
A partir da análise crítica de sistemas de distribuição de água, envolvendo o cenário industrial, as amostras foram coletadas e processadas da seguinte maneira: para as coletas de água, um volume de 100 mL foi coletado em frascos estéreis; para a avaliação de contaminantes em aerossóis, placas contendo meio de cultivo específico para o desenvolvimento de bactérias e de fungos foram expostas ao ambiente por 20 minutos, enquanto que o material incrustrado nas superfícies dos diversos materiais em contato com água foi coletado com a utilização de swabs (haste com algodão estéril para fins laboratoriais), com posterior estriamento em placas contendo os meios de cultura apropriados para o desenvolvimento de bactérias e de fungos. Para a efetiva avaliação do material presente no chuveiro foi necessária a abertura do aparato e coleta do biofilme em seu interior.
Para a seleção e caracterização dos grupos microbianos mais críticos, os procedimentos descritos a seguir foram adotados para a obtenção destes contaminantes. Abrangeu-se nesta avaliação apenas uma área específica, identificada como sendo de grande risco dentre os locais inspecionados nas empresas envolvidas, a fim de se compreender a diversidade da microbiota nas fases livre, em biofilmes e dispersas no ambiente.
A classificação dos principais microrganismos detectados foi baseada em diferenciá- los em gênero e quando possível, em espécie, considerando que os gêneros reúnem os microrganismos com características em comum no que se refere à morfologia e metabolismo de um modo geral e que as espécies são subdivisões dos gêneros, discriminando com maior detalhamento as diferenças intrínsecas entre os microrganismos. A visualização da morfologia dos microrganismos foi realizada por microscopia óptica convencional (microscópio óptico binocular de bancada modelo DME, Leica) e suas prováveis identidades foram correlacionadas com as descrições estruturais de referência para a identificação de microrganismos, utilizando-se um manual de diagnóstico microbiológico tradicional (Koneman, 2001).
A estrutura celular das bactérias foi evidenciada por coloração de Gram, enquanto os micélios e esporos fúngicos foram visualizados com o auxílio de um manual de identificação (Koneman et al., 2001).
Tais formas de caracterização foram utilizadas por serem de mais fácil acesso e baixo custo para a indústria e também por serem suficientes para o propósito apresentado.
3.3.1.3- Preparo dos inóculos microbianos individuais ou mistos
Cada microrganismo-teste foi inicialmente retirado de um tubo de ensaio, armazenado sob refrigeração, contendo o meio de cultura sólido apropriado para cada grupo microbiano. Utilizou-se uma alça de inoculação de 0,1µL para a sua transferência para um novo tubo com o mesmo tipo de meio de cultura do tubo original (primeiro repique) para a confirmação de sua viabilidade e do crescimento livre de outros microrganismos contaminantes após 24 horas sob incubação em estufa com temperatura controlada de 35±2oC para bactérias e de 25±2oC para fungos (modelo Orion 502, Fanem). Uma nova transferência de cada cepa após 24 horas (segundo repique) foi realizada a partir do tubo do primeiro repique a fim de aumentar a probabilidade de que a maioria das células estivessem em fase de crescimento exponencial, usualmente requerida para a avaliação de agentes antimicrobianos.
Para o preparo das suspensões individuais, uma porção de cada cepa foi retirada do tubo de segundo repique com o uso da alça de inoculação e suspensa em um frasco para coleta de material biológico (com capacidade para 80 mL) contendo 50 mL de água destilada
esterilizada, de acordo com Capelletti (2006). A concentração celular final desejada, minimamente contendo 108 UFC/mL de bactérias e 107 UFC/mL de fungos foi ajustada após a contagem do número de células viáveis presentes em 1mL da suspensão que foi disposta em placa de Petri com o respectivo meio de cultura sólido, após incubação por 24 horas.
Para o preparo das suspensões mistas, quantidades equivalentes de cada suspensão individual foram dispostas em um mesmo frasco e homogeneizadas. A concentração celular final do inóculo foi então reconfirmada para eventual ajuste.
As suspensões foram mantidas sob refrigeração para a diminuição do metabolismo celular e manutenção do número de células presentes, até que fossem utilizadas como inóculos nos ensaios pertinentes.
3.3.1.4- Seleção dos biocidas para os ensaios de incorporação nas membranas
Os biocidas utilizados como agentes coadjuvantes na preparação das membranas biopoliméricas foram selecionados considerando-se principalmente os seguintes parâmetros desejáveis à aplicação pretendida: apresentarem ampla efetividade contra microrganismos, incluindo-se cepas patogênicas; possuírem atributos em segurança (baixa toxicidade e uso em aplicações sanitárias), além de serem dotados de compostos ativos com efetividade hipotética contra os microrganismos ambientais coletados para os experimentos. Dados referenciais sobre a interação entre os tipos de microrganismos e os biocidas, bem como o uso prático dos diversos componentes ativos em diferentes segmentos industriais foram consultados (Paulus, 2004) para a proposição dos ensaios.
De maneira sucinta, os biocidas selecionados eram das classes dos conservantes ou dos sanitizantes. Os conservantes são substâncias ou preparações que previnem ou inibem o desenvolvimento microbiano e são usados em formulações diversas para a preservação a longo prazo destes materiais. Sanitizantes são substâncias ou preparações destinadas à higienização e desinfecção em superfícies inanimadas e apresentam atuação rápida, mas não duradoura (adaptado de Paulus, 2004). De acordo com a sua composição química (explicitada em 3.2.2), tem-se que o Biocida 1 apresenta as duas propriedades acima mencionadas, mas preponderantemente é um conservante. Os Biocidas 2 a 5 são da classe dos conservantes e os Biocidas 6 a 8, da classe dos sanitizantes.
3.3.2- Ensaios preliminares: análise da atividade antimicrobiana dos biopolímeros
3.3.2.1- Avaliação da qualidade microbiológica inicial dos biopolímeros utilizados
A realização deste ensaio visou analisar interferentes naturais do produto para validar os ensaios pretendidos de atividade antimicrobiana das quitosanas e do alginato.
Foram realizadas as análises considerando-se os polímeros em sua apresentação original (pó), bem como em suas formas solubilizadas a 1% em seus respectivos solventes estéreis, sendo solução aquosa contendo 1% de ácido acético para as quitosanas e água destilada para o alginato. A presença de microrganismos nestes materiais foi verificada conforme metodologias descritas a seguir.
Para as amostras na forma sólida, foi realizado o procedimento referido como teste de exposição em placas. Foi pesado 1 g do material, dispondo-se o mesmo no centro de cada placa de Petri contendo os meios de cultura sólidos seletivos para bactérias e fungos (especificados no item 3.2.4). Com o auxílio de uma espátula esterilizada, o material foi espalhado de modo a ocupar uma área de aproximadamente 4 cm2. As placas foram incubadas em condições adequadas ao desenvolvimento dos microrganismos (informadas no item 3.3.1.3) e após incubação o grau de contaminação dos materiais foi avaliado considerando-se a eventual área recoberta pelos contaminantes na superfície do material exposto, em porcentagem.
Para as amostras na forma solubilizada, foi realizado o procedimento referido como detecção microbiana por plaqueamento. Foi retirado 1 mL da solução e transferido para um tubo de ensaio contendo 9 mL de água destilada estéril (diluição 10-1). Tal procedimento foi realizado sucessivamente por 3 vezes visando facilitar a posterior enumeração das células presentes. Posteriormente, 1 mL do conteúdo de cada tubo contendo as diferentes diluições preparadas foi adicionado e homogeneizado em placas de Petri separadas contendo os meios de cultura seletivos para cada grupo microbiano. Após incubação nas condições especificadas, foi efetuada a contagem das colônias microbianas (contador de colônias modelo CP-602, Phoenix), e os resultados registrados, levando-se em consideração o número de colônias microbianas presentes no meio de cultura e o fator de diluição da amostra plaqueada.
3.3.2.2- Avaliação da atividade antimicrobiana da quitosana sólida e em solução
Diferentemente do alginato, que é solúvel em água, a quitosana é solubilizada em soluções ácidas que podem ser potencialmente ativas contra bactérias. Portanto, o objetivo deste ensaio foi determinar a influência do ácido acético na atividade da quitosana, fixando-se o uso da quitosana com desacetilação mínima de 85% para o preparo de soluções de concentração de 1% (m/v) em ácido acético a 1% (v/v), com ajuste de pH para 4,0 e 7,0 (pHmetro e potenciômetro Gehaka PG-2000). Também, foram utilizadas a solução de ácido acético a 1% e a quitosana in natura (sem diluição) isoladamente. As soluções foram impregnadas em discos de papel de filtro de 2 cm, enquanto a quitosana na forma sólida foi disposta diretamente sobre os meios de cultura previamente inoculados com os microrganismos em culturas isoladas e mista.
Os seguintes ensaios foram realizados: avaliação da viabilidade celular de suspensões microbianas após contato com a solução (morte celular) e a efetividade de inibição contra os mesmos microrganismos, como segue.
Para avaliar a redução da contaminação inicial dos inóculos microbianos na forma de suspensões mistas de bactérias, fungo filamentoso e leveduras, separadamente em tubos de