UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Química
RAQUEL VANNUCCI CAPELLETTI
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS A
BIOPOLÍMEROS PARA O CONTROLE DE BIOFILMES EM
AMBIENTES SUSCEPTÍVEIS AO DESENVOLVIMENTO DE
CONTAMINANTES ORIUNDOS DE ÁGUA
Campinas 2015
RAQUEL VANNUCCI CAPELLETTI
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS A
BIOPOLÍMEROS PARA O CONTROLE DE BIOFILMES EM
AMBIENTES SUSCEPTÍVEIS AO DESENVOLVIMENTO DE
CONTAMINANTES ORIUNDOS DE ÁGUA
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Engenharia Química.
Orientadora: ÂNGELA MARIA MORAES
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA RAQUEL VANNUCCI CAPELLETTI, E ORIENTADA PELA PROFa. DRa. ÂNGELA MARIA MORAES.
CAMPINAS 2015
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129
Capelletti, Raquel Vannucci, 1978-
C171a Análise da associação de agentes antimicrobianos a biopolímeros para o controle de biofilmes em ambientes susceptíveis ao desenvolvimento de
contaminantes oriundos de água / Raquel Vannucci Capelletti. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Ângela Maria Moraes.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
Água. 2. Contaminação. 3. Quitosana. 4. Indústria. 5. Biofilmes. I. Moraes, Maria Ângela,1966-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Química
ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS A
BIOPOLÍMEROS PARA O CONTROLE DE BIOFILMES EM
AMBIENTES SUSCEPTÍVEIS AO DESENVOLVIMENTO DE
CONTAMINANTES ORIUNDOS DE ÁGUA
Autora: Raquel Vannucci Capelletti
Orientadora: Profa. Dra. Ângela Maria Moraes
A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Tese em Campinas, em 18 de dezembro de 2015
Profa. Dra. Ângela Maria Moraes Faculdade de Engenharia Química
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profa. Dra. Cláudia Steckelberg
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Prof. Dr. Cláudio Alberto Torres Suazo Departamento de Engenharia Química
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar)
Profa. Dra. Elisabeth de Fátima Pires Augusto Instituto de Ciência e Tecnologia
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Profa. Dra. Rose Marry Araújo Gondim Tomaz Instituto Agronômico de Campinas (IAC)
A Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no processo de vida acadêmica da aluna.
EPÍGRAFE
"Não sabendo que era impossível, foi lá e fez".
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me permite dar continuidade aos meus sonhos.
Aos meus familiares, que me motivaram durante todo o período dedicado à realização
deste trabalho.
À orientação, análise crítica e carinho dispensados pela professora Ângela, que foram
muito importantes na superação das dificuldades encontradas no decorrer do estudo, e pela
confiança desde o princípio, me acolhendo como aluna.
À Unicamp, em particular às Faculdades de Engenharia Química e Engenharia de
Alimentos e aos Institutos de Física e de Biologia, que me proporcionaram obter o título de
Doutorado.
Aos meus colegas da empresa em que atuo paralelamente às atividades acadêmicas
(Thor Brasil Ltda.), em especial aos Srs. Ridnei Brenna pelo permanente incentivo e Dave
Alexander pelo precioso suporte técnico. A esta empresa, também agradeço a facilitação de
uso do laboratório de controle de qualidade para a execução dos ensaios, bem como pela
possibilidade de utilizar alguns de seus produtos para este fim.
Também, foi de muita importância contar com Cristiele Pereira Oshiro em sua
carinhosa dedicação, colaboração e apoio. Ao Sr. Antônio José Matteucci, pela imensa
consideração e amizade no decorrer desta trajetória.
Por fim, dedico este trabalho a quem sempre foi meu maior condutor a caminhar em
direção ao aperfeiçoamento e à conclusão de objetivos, em todos os aspectos. Com amor, a
RESUMO
Biofilmes microbianos são frequentemente formados por contaminantes remanescentes ou resistentes a procedimentos de limpeza e sanitização, estando presentes em variados locais, desde indústrias a hospitais. A água é o principal estímulo para o desenvolvimento microbiano, e seu fluxo tem papel importante na disseminação de contaminantes. Biocidas são comumente utilizados para o controle microbiano, porém podem gerar culturas resistentes e causar corrosão em tubulações, requerendo frequente reposição para manter sua atividade. Este estudo teve por objetivo avaliar o uso de biocidas de diferentes categorias associados a membranas de biopolímeros como estratégia alternativa de prevenção e controle de contaminação em sistemas envolvendo fluxo de água, visando minimizar o uso de produtos agressivos, especialmente em ambientes susceptíveis com alta circulação de pessoal. Foram utilizados os polissacarídeos quitosana e alginato para a constituição das membranas, ambos de origem biológica e de baixa toxicidade a mamíferos. Culturas microbianas típicas, bem como as isoladas da tubulação, de torneiras, de chuveiros, e do ar de ambientes industriais, foram expostas, nas formas suspensa em água, em biofilmes e em cultura pura e mista, aos agentes antimicrobianos selecionados, associados ou não aos biopolímeros. Observou-se que a eficácia de uso das membranas depende da sua composição e da diversidade microbiana contaminante. A quitosana com menor grau de desacetilação (85%) mostrou-se mais efetiva, de modo geral, que a de 98%. Em pH 4,0 a formulação de quitosana apresentou maior atuação contra bactérias. Em pH 7,0 a atividade foi mais pronunciada contra fungos. A quitosana com 85% de desacetilação em pH 7,0 apresentou melhor atividade sobre microrganismos planctônicos, especialmente contra a bactéria Gram-positiva S. aureus, enquanto o alginato mostrou melhor desempenho na erradicação de biofilmes de culturas puras. Em biofilmes mistos ambos os polissacarídeos se mostraram promissores. O aumento da concentração dos biopolímeros de 1 para 2% não proporcionou aumento da eficácia. As membranas contendo apenas quitosana ou alginato apresentaram-se pouco efetivas contra os contaminantes testados, sendo a membrana formada por quitosana de melhor desempenho, mas ainda pouco atuante contra bactérias Gram-negativas e fungos. A incorporação de biocidas nesta membrana favoreceu a ampliação do seu espectro de atuação para todas as formulações, mesmo sob lixiviação. Mesmo não tendo sido possível adequar a formulação para a incorporação de todos os biocidas selecionados (classe dos sanitizantes), obteve-se alternativas promissoras, tais como a membrana contendo o biocida à base de n-octilisotiazolinona, que se mostrou majoritariamente efetiva contra fungos, em especial a versão encapsulada para exposição à lixiviação, enquanto que a formulação contendo nitrato de prata a 1,5% com benzisotiazolinona a 9%, contra bactérias. De modo global, a minimização apropriada do uso de biocidas pôde ser demonstrada, embora seja ainda dependente da diversidade na microbiota avaliada. Células em suspensão ou em biofilmes possuem diferentes mecanismos de desenvolvimento e ambos devem ser avaliados para que se possa delinear tratamentos mais efetivos, sendo a proposição de um conjunto de recomendações preventivas e de monitoramento que reflita cuidados com o segmento industrial e que dê diretrizes a outros ambientes susceptíveis considerada de alta relevância para atingir este propósito.
Palavras-chave: Biofilmes microbianos, contaminação, biocidas, membranas antimicrobianas,
ABSTRACT
Microbial biofilms are often formed by contaminants remaining or resistant to cleaning and sanitizing procedures. They may be present in various sites, from industries to hospitals. Water is the main stimulus for the development of microorganisms, and its flux plays an important role in the spread of contaminants. Biocides are products frequently used for microbial control, but they can generate resistant strains, corrosion in pipes and require frequent replenishing to maintain their activity. This study aimed to evaluate different categories of biocides associated to biopolymers in the form of membranes as prevention and control strategies of contaminants present in water systems, as an alternative to minimize the use of aggressive products in areas of high traffic of people. Chitosan and alginate were used for the production of the membranes, being both compounds of biological origin not toxic to animals. Typical microbial cultures used in laboratorial tests as well as microorganism isolated from pipes, faucets, showers, and air from industrial environments were exposed, both as cell suspension and as biofilms, in pure and mixed culture, to selected antimicrobial agents, associated or not to the biopolymer membranes. The results showed that the efficiency of the use of the membranes depends on its composition and contaminant microbial diversity. The chitosan with lower degree of deacetylation (85%) was more effective in general than that of 98%. At pH 4.0, the formulation of chitosan showed higher activity against the group of bacteria. At pH 7.0, the activity was more pronounced against fungi. The 85% deacetylated chitosan at pH 7 showed better activity on planktonic microorganisms, especially against the Gram-positive bacteria S. aureus, while alginate performed better in eradicating biofilms resulting from pure cultures. In mixed biofilms both polysaccharides showed to be promising for the desired application. Increasing the concentration of both polymers from 1 to 2% did not improve the antimicrobial efficacy of the membranes. The membranes containing only chitosan and alginate showed not o be very effective against contaminants commonly found in industrial environment. The chitosan membrane performed better, and the incorporation of biocides to its formulation improved its activity, specially against Gram-negative bacteria and fungi, as well as against biofilms. Although it was not possible to have formulations able to incorporate all selected biocides (class of sanitizants), promising alternatives were attained, such as the membrane containing the biocide n-octylisothiazolinone, which showed to be mainly effective against fungi, in particular the encapsulated version, even in leaching conditions, whereas the formulation containing 1.5% silver nitrate and 9% benzylisothiazolinone was efficient against bacteria. In general, the safe minimization of the use of biocides could be demonstrated, although it is still dependent on the diversity in the microbiota evaluated. Cells in suspension or in biofilms have different development mechanisms and those mechanisms should be considered for the design of effective treatment strategies. Thus, a set of preventive recommendations and monitoring that reflects care for specific industrial sectors giving guidelines to other susceptible environments is fundamental for achieving this purpose.
Keywords: Microbial biofilms, contamination, biocides, antimicrobial membranes, biopolymer,
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ... 1
1.1- EMBASAMENTO E JUSTIFICATIVA... 2
1.2- OBJETIVOS ... 7
CAPÍTULO 2: REVISÃO DA LITERATURA... 8
2.1- PERSPECTIVA HISTÓRICA: MICRORGANISMOS, ENFERMIDADES E ANTIBIÓTICOS ASSOCIADOS... 9
2.2- FONTES DE CONTAMINAÇÃO E DISPERSÃO MICROBIANA... 12
2.3- CONTAMINAÇÕES EM AMBIENTES CRÍTICOS E AQUISIÇÃO DE INFECÇÕES... ... 16
2.4- CONTROLE DE BIOFILMES EM SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA E IMPACTOS DA CONTAMINAÇÃO PARA A INDÚSTRIA... 24
2.5- VIAS COMPLEMENTARES À DISPERSÃO DE CONTAMINAÇÕES PELA ÁGUA E IMPACTO NA SAÚDE OCUPACIONAL... 30
2.6- POLISSACARÍDEOS E APLICAÇÕES ANTIMICROBIANAS... 35
2.7- CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE A LITERATURA CONSULTADA... ... 43
CAPÍTULO 3: METODOLOGIA EXPERIMENTAL E ANÁLISE DOS DADOS... 46
3.1- ESTRUTURA GERAL DOS ENSAIOS EXPERIMENTAIS... 47
3.2- MATERIAL... ... 48
3.2.1- Biopolímeros... 48
3.2.2- Agentes antimicrobianos complementares... 48
3.2.3- Diluentes e reagentes... 50
3.2.4- Meios de cultura... 50
3.2.5- Microrganismos... 51
3.3- MÉTODOS... 51
3.3.1- Avaliação microbiológica do sistema estudado... 51
3.3.1.1.- Estratégias para a conduta de amostragem, diagnóstico microbiológico e proposição de recomendações... 51
3.3.1.2- Coleta, isolamento e caracterização de contaminantes críticos identificados de sistemas de distribuição de água identificados... 53
3.3.1.3- Preparo dos inóculos microbianos individuais ou mistos... 54
3.3.1.4- Seleção dos biocidas para os ensaios de incorporação nas membranas... 55
3.3.2- Ensaios preliminares: análise da atividade antimicrobiana dos biopolímeros... 56
3.3.2.1- Avaliação da qualidade microbiológica inicial dos biopolímeros utilizados... 56
3.3.2.2- Avaliação da atividade antimicrobiana da quitosana sólida e em solução... 57
3.3.3- Preparação das membranas: seleção do biopolímero e incorporação dos biocidas... 58
3.3.3.1- Preparação das membranas... ... 58
3.3.3.2- Atividade das membranas contra microrganismos planctônicos em cultivo de superfície... 59
3.3.3.4- Caracterização da membrana antimicrobiana selecionada... 61
3.3.4- Ensaio de triagem das membranas com biocidas em condições basais... 62
3.3.4.1- Atividade preliminar das membranas contendo biocidas na avaliação contra microrganismos padronizados... 62
3.3.4.2- Atividade da membrana contra microrganismos amostrados de sistema de água contaminado... 62
3.3.5- Condições de exposição críticas para a avaliação da ampliação de atuação das membranas... 63
3.3.5.1- Ensaio de lixiviação das membranas... 63
3.3.5.2- Atuação antimicrobiana por exposição a microrganismos patogênicos... 64
3.3.5.3- Análise da variação do desempenho da membrana biopolimérica ao longo do tempo de utilização... 64
CAPÍTULO 4: RESULTADOS E DISCUSSÃO... 67
4.1- AVALIAÇÃO DO CENÁRIO, AMOSTRAGEM DE CONTAMINANTES INDUSTRIAIS DE SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA VISANDO À SELEÇÃO DE BIOCIDAS... 68
4.1.1- Levantamento do panorama geral e do perfil de contaminantes em sistemas envolvendo água no segmento industrial... 68
4.1.2- Análise da microbiota coletada de sistema de água visando seu uso nos ensaios de efetividade... 71
4.2- ANÁLISE PRELIMINAR DOS BIOPOLÍMEROS... 74
4.2.1- Avaliação microbiológica dos biopolímeros e interferência do ácido acético usado na solubilização da quitosana... 74
4.3- PREPARAÇÃO DAS MEMBRANAS POLIMÉRICAS, SELEÇÃO DO BIOPOLÍMERO E INCORPORAÇÃO DOS BIOCIDAS... 78
4.3.1- Avaliação do desempenho de membranas competentes após formulação e seleção do biopolímero antimicrobiano mais promissor... 78
4.3.2- Desempenho das membranas contra culturas padronizadas isoladas e mistas... 78
4.3.3- Desempenho das membranas contra biofilmes... 85
4.3.4- Caracterização da membrana selecionada... 90
4.3.5- Incorporação de agentes antimicrobianos na composição da membrana... 93
4.4- ATUAÇÃO ANTIMICROBIANA DAS MEMBRANAS COM BIOCIDAS EM CONDIÇÕES BASAIS... 96
4.4.1- Avaliação antimicrobiana preliminar das membranas compostas de quitosana com biocidas... 96
4.5- APLICAÇÃO DAS MEMBRANAS SOBRE CONTAMINANTES DE SISTEMA DE ÁGUA ENVOLVENDO CONDIÇÕES MAIS RIGOROSAS... 99
4.5.1- Submissão das membranas à lixiviação... 99
4.5.2- Atuação contra microrganismos reconhecidamente patogênicos... 102
4.5.3- Resistência das membranas à exposição microbiana continuada... 104
4.6- DISCUSSÃO GLOBAL SOBRE A APLICABILIDADE DAS MEMBRANAS COM OU SEM BIOCIDAS EM SISTEMAS COM CONTAMINAÇÃO DE ÁGUA... 105
CAPÍTULO 5: CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS... 107
5.1- CONCLUSÕES ACERCA DA APLICABILIDADE DAS MEMBRANAS COM A FINALIDADE PROPOSTA... 108 5.2- SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS... 109
CAPÍTULO 1:
INTRODUÇÃO
1.1- EMBASAMENTO E JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de métodos para a produção de meios nutrientes sólidos e a estratégia para isolar culturas de microrganismos proposta por Robert Koch nas últimas décadas do século XIX possibilitou o treinamento de gerações de microbiologistas na investigação e elucidação das propriedades de culturas puras de microrganismos. Seus postulados foram de suma importância para provar que uma bactéria seria o agente causal de uma determinada doença e requeriam o isolamento em cultura pura da bactéria supostamente patogênica (Nascimento e Taveira, 2001).
Posteriormente, o advento de técnicas de análise por microscopia mais sofisticadas e efetivas contribuiu para a constatação de que, em ambientes naturais, os microrganismos se apresentam majoritariamente em associação mista e fixos a suportes (Costerton et al., 1978). Aos microrganismos aderidos, chamados sésseis, é atribuído o nome de biofilme quando há formação de um material extracelular protetor, secretado por células microbianas de fisiologia diferenciada. Os microrganismos precursores da formação de biofilmes, denominados planctônicos, são encontrados dispersos em meios aquosos, o que os torna mais susceptíveis a agressões ambientais que em sua forma aderida. Geralmente, a forma séssil apresenta alterações genéticas que possibilitam a inibição ou síntese de novas substâncias, além de uma estrutura protetora do grupo microbiano contra fatores ambientais agressivos. Assim, tais características proporcionam a estas células condições favoráveis de sobrevivência, o que as tornam menos susceptíveis à erradicação quando comparadas aos mesmos microrganismos sob a forma planctônica (Morck et al., 2001). A partir de então, a importância do tema se tornou mais abrangente e pesquisas vêm sendo realizadas em muitas áreas relacionadas com a ecologia microbiana.
A deposição de biofilmes pode ocorrer em uma ampla variedade de locais, incluindo desde a colonização em superfícies de materiais como dispositivos médicos ou em locais contendo produtos com alto nível de controle, como reservatórios e linha de produção de água ultrapura (Flemming e Ridgway, 2008). Outra implicação com impacto direto na saúde humana é quando se tem uma higienização ineficiente das superfícies de equipamentos, tais como em trocadores de calor, tendo como consequência o acúmulo de biofilmes microbianos, uma preocupação importante e constante na indústria laticinista (Miguel et al., 2014).
Vinculados aos seus diversos ambientes de possível instalação, frequentemente, os biofilmes estão envolvidos com diversos problemas, tais como o processo de corrosão microbiologicamente induzido em tubulações, equipamentos e peças metálicas (Walker et al., 1998), contaminação em linhas de processamento de indústrias de alimentos (Flint et al., 1997), doenças periodontais (Hobson e Bolsen, 2001), infecções hospitalares relacionadas à ineficácia de limpeza de superfícies, a implantes de biomateriais e a sistemas envolvendo distribuição de ar e água (Dankert et al., 1986), sendo este último veiculador de contaminantes mencionado de maior interesse no presente estudo.
No ambiente hospitalar, contaminações por biofilme têm grande impacto na segurança dos pacientes e dos profissionais envolvidos. A transmissão de microrganismos responsáveis por infecções hospitalares, também denominada de nosocomiais, é um grave e recorrente problema de saúde pública, que acomete tanto os países em desenvolvimento quanto os desenvolvidos. De acordo com o Ministério da Saúde (Portaria nº 930, Anexo II - 1992), “Infecção Hospitalar é qualquer infecção adquirida após a internação do paciente e que se manifesta durante a internação ou mesmo após a alta, quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares”. A infecção pode ser caracterizada como um desequilíbrio no sistema parasita-hospedeiro-ambiente, por consequência do aumento da patogenicidade do parasita em relação aos mecanismos de defesa do hospedeiro, ou pela diminuição da capacidade normal de defesa anti-infecciosa do hospedeiro em relação à patogenicidade normal do parasita.
Os biofilmes são responsáveis por mais de 65% das infecções bacterianas nos Estados Unidos, e contribuem para a ocorrência de aproximadamente 90.000 mortes, gerando cinco bilhões de dólares em despesas por ano, de acordo com o Centro de Controle de Doenças e Prevenção daquele país (CDC, 2003). No Brasil, estima-se que entre 13 e 15% dos pacientes adquirem algum tipo de infecção durante a hospitalização, resultando em significativa morbidade, mortalidade e elevados custos (Associação Paulista de Medicina, 2006). Normalmente estas infecções caracterizam-se pela sua cronicidade, o que torna o diagnóstico microbiológico difícil, e pela elevada resistência ao tratamento com antibióticos.
Entretanto, os biofilmes podem ser investigados para a prevenção de sua formação, controle ou erradicação. A utilização de produtos químicos com atividade antimicrobiana é frequentemente empregada, porém, o uso destes requer a determinação quanto à concentração apropriada para aplicação. Dosagens abaixo do nível necessário causam falsa segurança,
seleção de microrganismos resistentes e, consequentemente, a ocorrência de surtos de contaminação, enquanto que acima do necessário, além dos aspectos econômicos, podem ocorrer problemas de toxicidade entre os envolvidos.
O controle das infecções hospitalares no Brasil está regulamentado desde 1982 pelo Ministério da Saúde, porém, para delinear o panorama do problema, somente em 1997 foi estabelecida a Lei 9431, que dispõe sobre a obrigatoriedade de os hospitais manterem um programa de controle de infecções hospitalares responsável pelas ações preventivas e corretivas relacionadas à disseminação de patógenos. Em decorrência de infecções adquiridas em hospitais brasileiros são registrados 45 mil óbitos por ano dentre 12 milhões de internações, consistindo na principal causa de mortes ocorridas em Unidades de Terapia Intensiva (UTI) hospitalares. Também em decorrência de infecções hospitalares o tempo de internação pode ser prolongado de 10 a 14 dias em média, o que gera um custo de 10 bilhões anuais para o tratamento complementar (Associação Paulista de Medicina, 2006).
Além da inata susceptibilidade dos enfermos, um dos principais fatores que podem contribuir sensivelmente para a transmissão de patógenos e a aquisição de infecção pelos pacientes são materiais que possam acumular sujidades e contaminantes e que estejam em contato direto ou indireto com os pacientes no ambiente durante o qual os mesmos estejam sob tratamento. Dentre as superfícies mais propícias ao desenvolvimento microbiano em hospitais podem-se citar aquelas em que há o condicionamento resultante de respingos de água contaminada, facilitando o depósito de outras moléculas e de patógenos. Microrganismos podem facilmente aderir no interior de tubulações e aparatos do sistema que geralmente acumulam água estagnada, principalmente onde o escoamento é dificultado, formando biofilmes. Estes contaminantes são carreados pelo próprio fluido ou pelo bioaerossol expelido pela água contaminada de torneiras e chuveiros, sendo então veiculados no ar, facilitando a dissipação no ambiente. São a causa de muitas infecções adquiridas em hospitais, que podem resultar em piora da doença e, muitas vezes morte, principalmente em pacientes cujo sistema imunológico esteja debilitado.
Diante do exposto, os biofilmes e a diversidade microbiana são áreas que merecem intensa investigação científica, face ao crescente desenvolvimento da resistência de cepas a tratamentos antimicrobianos. A implantação de medidas para prevenir a progressão da colonização à infecção por microrganismos é uma necessidade para a adequação das boas práticas ocupacionais no âmbito hospitalar e nas demais áreas cujo controle microbiológico
necessite ser rigoroso, em particular nas indústrias dos setores de alimentos, fármacos, cosméticos e produtos de higiene pessoal. Nestes últimos setores, o problema pode também adquirir caráter muito grave e ter severas implicações no que tange à saúde dos envolvidos diretamente no processamento de materiais, em função de etapas pouco seguras com relação à exposição a contaminantes, e mesmo àqueles envolvidos de forma indireta, como usuários dos produtos porventura contaminados.
Comumente, na rotina de limpeza e sanitização de ambientes utiliza-se de produtos chamados biocidas para a contenção dos níveis de contaminação críticos. Biocida pode ser definido como qualquer substância que contém um ou mais agentes ativos, capaz de prevenir, inibir, diminuir ou eliminar a ação de organismos vivos patogênicos e não patogênicos (definição adaptada da European Commission, 1998). A escolha de um agente antimicrobiano com ampla atividade se faz necessária onde o foco de contaminação é constituído por distintos tipos de microrganismos. Por vezes, princípios ativos em associação apresentam sinergismo na erradicação de comunidades de microrganismos e/ou quando estes são resistentes a tratamentos convencionais. Porém, a cada nova condição de exposição a agentes químicos, os microrganismos tendem a se adaptar, persistindo e requerendo maiores doses de produto para que sejam eliminados.
Desta forma, no presente trabalho teve-se por meta o estudo de membranas obtidas a partir de biopolímeros naturais contra a instalação microbiana, seu crescimento e disseminação, de modo a agregarem valor no combate a contaminantes persistentes. Como opção promissora para a manufatura das membranas tem-se a quitosana que, dependendo do pH do meio, pode apresentar cargas positivas. Por apresentar cargas negativas também de forma dependente do pH foi analisado o uso de outro polissacarídeo, o alginato. Ambos são de origem biológica e com reconhecida aplicação na área biomédica, o que confere a estes biopolímeros pré-requisitos essenciais para uso como material não-tóxico a mamíferos de forma geral. O alginato é amplamente utilizado como revestimento de fármacos para liberação controlada no organismo e como agente para imobilização de células em estudos na área biotecnológica (Dornish e Dessen, 2004). Recentemente, a quitosana foi utilizada com êxito no recobrimento de implantes médicos para impedir sua colonização por bactérias e leveduras de importância clínica (Carlson et al., 2008). Destaca-se ainda que ambos os biopolímeros poderiam ser potencialmente obtidos a partir da biota marinha brasileira e que seu custo de processamento não é muito elevado, sendo ambos de fácil manipulação. Com base nestas observações, estes biopolímeros foram então testados na forma isolada ou combinada com
agentes antimicrobianos complementares que tenham aprovação para esta aplicação, visando ampla atuação contra os microrganismos comumente presentes em sistemas de distribuição de água.
Assim, diante dos problemas associados ao controle de biofilmes em sistemas de água considerando-se as técnicas e os produtos comumente utilizados, a presente proposta de estudo foi definida levando-se em conta a necessidade do uso de agentes antimicrobianos mais sustentáveis que pudessem substituir ou atuar como agentes de minimização do uso de produtos agressivos. Foram enfocadas no estudo especialmente áreas microbiologicamente controladas, a análise da disseminação microbiana através da água (insumo mais utilizado em vários campos de aplicação) e o controle da formação de biofilmes microbianos em locais de difícil acesso à remoção, que induzem à resistência microbiana e a disseminações ambientais. Ainda, considerou-se neste estudo o uso de materiais biodegradáveis (biopolímeros), total ou parcialmente, para a constituição dos dispositivos para o controle e/ou eliminação dos contaminantes, pois boa parte das matrizes comumente usadas para a incorporação de agentes antimicrobianos tem elevada persistência no ambiente após o seu descarte, o que não é o caso da quitosana e do alginato.
Visto que a realização dos ensaios em ambiente hospitalar poderia levar ao agravamento do problema na localidade enfocada, optou-se por conduzir o estudo em áreas sujeitas à mesma problemática de alto potencial de formação de biofilmes, com elevada disseminação microbiana por via aérea e por meio de circulação de água, e com grande trânsito de pessoas, mas sem o inconveniente e o risco da presença de pessoas com alta susceptibilidade de infecção que poderiam ser prejudicadas pela realização do estudo. Desta forma, realizou-se os ensaios em um vestiário com 40 m2 de extensão, 20 chuveiros e aproximadamente 50 usuários por dia, localizado em ambiente industrial com foco de atuação no processamento de produtos químicos para linha escolar.
Com isto, tem-se que a problemática apresentada abrange várias vertentes que se complementam para o estudo de alternativas mais sustentáveis ao uso de agentes antimicrobianos comumente empregados, tendo como fundamento a preocupação de atender os aspectos ambiental e ocupacional envolvidos nesta prática, áreas estas ainda com registro de dados restrito na literatura.
1.2- OBJETIVOS
Sendo assim, o presente estudo teve como principal objetivo a análise de estratégias alternativas para o controle microbiológico de sistemas envolvendo distribuição de água, especialmente em ambientes com grande probabilidade de disseminar contaminantes para o ambiente externo. A proposta baseou-se no uso de agentes antimicrobianos e de biopolímeros bioativos por serem estes materiais compatíveis com o organismo humano e por apresentarem outras potenciais vantagens no uso a longo prazo em relação aos produtos atualmente utilizados para este propósito.
As etapas envolvidas na busca do objetivo global estabelecido foram:
a) Analisar a factibilidade de uso de membranas poliméricas contendo quitosana de diferentes tipos ou alginato, isoladas ou contendo agentes coadjuvantes antimicrobianos (biocidas), sob condições adversas, como material complementar ou substituto a agentes químicos agressivos e que possam evitar o desenvolvimento de microrganismos, sua instalação na forma de biofilmes e dispersão ambiental;
b) Avaliar a capacidade antimicrobiana das membranas contra microrganismos padronizados para uso em ensaios laboratoriais e avaliar comparativamente sua atuação contra culturas resistentes oriundas de sistema de água de ambientes industriais com microrganismos planctônicos (suspensos no fluido) e sésseis (fixos a superfícies e envoltos por uma matriz extracelular, na forma de biofilmes), com exposição também à lixiviação (fluxo intenso e contínuo de água);
c) Determinar a forma de atuação da membrana selecionada como a mais promissora e eventuais limitações de sua eficácia antimicrobiana na aplicação final, considerando variações na microbiota que possam influenciar o controle microbiológico do sistema envolvendo culturas individuais e mistas, células em suspensão e em biofilmes;
d) Propor um conjunto de recomendações que reflita cuidados com o segmento industrial e que remeta ou dê diretrizes também a outros ambientes susceptíveis, como o segmento de processamento de alimentos, de artigos para uso humano e de amparo à saúde.
CAPÍTULO 2:
REVISÃO DA LITERATURA
Os assuntos abordados nesta seção foram compilados visando apresentar os marcos referenciais relacionados à temática do presente trabalho. Fundamentos sobre as condições que desencadeiam os diferentes modos de sobrevivência dos microrganismos, o uso de antimicrobianos e sua relação com o desenvolvimento da resistência de microbiotas envolvendo ambientes críticos são fornecidos e discutidos. Tais informações são importantes para a compreensão global da problemática apresentada, bem como para o direcionamento de medidas para intervenções. O levantamento de dados sobre a eficácia antimicrobiana de produtos variados e suas limitações visam colaborar na avaliação de novos potenciais tratamentos, como o estudado neste trabalho.
2.1- PERSPECTIVA HISTÓRICA: MICRORGANISMOS, ENFERMIDADES E ANTIBIÓTICOS ASSOCIADOS
A humanidade registra, desde períodos muito antigos, a ocorrência de epidemias que devastaram civilizações, cujos primeiros relatos datam de mais de três mil anos. Moléstias consideradas atualmente de simples tratamento frequentemente resultavam em morte ou sequelas, devido às corriqueiras complicações em decorrência de doenças infecciosas. De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde (OMS, World Health Organization, em inglês, WHO), até meados do século XIX a expectativa de vida na Europa e América do Norte era, em média, de 50 anos (WHO, 2000-b).
Diante de variadas situações de risco, o Homem deu início a um processo de desenvolvimento de estratégias de enfrentamento e práticas de controle em resposta aos surtos infecciosos que, até então, tinham sua origem desconhecida. Apesar da crença na origem divina dos males, os povos da Antiguidade já expressavam em sua cultura cuidados com a higiene e o saneamento para a manutenção da saúde. Nesse período, ao longo da costa do Mediterrâneo, era muito comum a incidência de malária, pois o mosquito transmissor se proliferava nos pântanos. Após a drenagem ou aterro, eliminavam-se os reservatórios de água parada, os insetos perdiam seu local de reprodução e as febres desapareciam. A extinção dos insetos, entretanto, não era relacionada ao aterro ou à drenagem, mas sim ao fim do odor desagradável, que se acreditava na época ser o causador das febres. Essa crença de que alguma alteração no ar, vinda principalmente de lugares pantanosos e fétidos, águas e valas estagnadas e cemitérios era a responsável pelas doenças, deu origem à teoria dos miasmas
(odores presentes no ar como responsáveis pelas doenças e epidemias), que predominaria até o século XIX (CRF-SP, 2011).
Mesmo desconhecendo as bactérias, os romanos construíram uma rede de abastecimento de água potável e um sistema de esgotos responsável pela profilaxia de diarreias. No entanto, as cidades medievais não dispunham de sistemas de esgotos e os dejetos se acumulavam próximos aos muros, fluindo para os rios, de onde a população muitas vezes retirava a água que ingeria (CRF-SP, 2011). A peste bubônica, denominada popularmente como peste negra, talvez a mais conhecida das grandes epidemias, ganhou este nome devido ao seu pior episódio, que atingiu a Europa no século XlV. Em apenas dois anos, a doença matou cerca de um terço da população europeia, estimada em 75 milhões de pessoas.
Por volta de 1670, após o advento do microscópio, as bactérias foram identificadas pela primeira vez pelo pesquisador holandês Van Leeuwenhoek. Somente no século XIX foi considerada a possibilidade de que estes microrganismos poderiam ser causadores de processos infecciosos. Esta hipótese surgiu após os experimentos de Louis Pasteur, que comprovaram que as bactérias se distribuíam amplamente no meio ambiente. Após a segunda metade do século XIX, Robert Koch identificaria o microrganismo responsável pela tuberculose (Guimarães et al., 2010).
Baseado nas descobertas de Pasteur, em 1860, Joseph Lister demonstrou uma técnica para manter as incisões cirúrgicas livres de contaminação pelos microrganismos. Lister passou a pulverizar o ar da sala cirúrgica com ácido fênico e, posteriormente, passou a utilizar ácido carbólico para desinfecção do instrumental. Alguns anos mais tarde, em 1883, Pasteur e Charles Chamberland, criador da autoclave, demonstraram que a esterilização pelo calor era de eficácia superior.
Até meados do século XIX, as estratégias sanitárias de combate às infecções eram limitadas. Somente a partir da segunda metade deste século, após a constatação dos microrganismos como agentes infecciosos, houve uma reorientação das práticas de tratamento e prevenção das infecções, reduzindo sensivelmente o número de mortes. Mas foram os estragos causados pelas epidemias que assolaram a Europa durante a Revolução Industrial que desencadearam o desenvolvimento da saúde pública. A série de transformações sociais promovidas pela proliferação de fábricas levou à ocorrência de várias doenças infecciosas. A população urbana aumentou exponencialmente, o que contribuiu para o alastramento de
doenças infecciosas e para o aumento das taxas de mortalidade. Nesta época, havia grandes aglomerações populacionais e surtos de sarampo e varíola se disseminavam com facilidade entre os moradores, condições insalubres suficientes para que a tuberculose surgisse como uma grande epidemia (Freitas, 2003).
No século XX, foram conduzidas diversas pesquisas na busca de agentes químicos com atividade antibiótica. O pesquisador Paul Ehrlich foi responsável pelos conceitos primários de que uma substância química poderia interferir na proliferação de microrganismos em concentrações toleráveis pelo hospedeiro e ficou conhecido como o "pai da quimioterapia" (Guimarães et al., 2010). Em 1910, este pesquisador desenvolveu o primeiro antibiótico de origem sintética, denominado Salvarsan, que fora utilizado no tratamento da sífilis. Entretanto, o grande marco no tratamento das infecções bacterianas ocorreu com a descoberta da penicilina, por Alexander Fleming, no final da década de 20 e que levaria mais de dez anos para que fosse introduzida como agente terapêutico. Neste período, Gerhard Domagk verificou que o corante vermelho prontosil apresentava atividade in vivo contra infecções causadas por espécies de Streptococcus. O prontosil (pró-fármaco) originou uma nova classe de antibióticos sintéticos: as sulfas ou sulfonamidas, que constituem a primeira classe de agentes efetivos contra infecções sistêmicas, sendo introduzida no início dos anos 40 (Guimarães et al., 2010).
Ainda na década de 1940, a penicilina G (benzilpenicilina) foi introduzida como agente terapêutico. Após o seu processo de industrialização, especialmente em consequência da Segunda Guerra Mundial, foi observado um rápido crescimento no desenvolvimento de novos antibióticos e o consumo generalizado dessas substâncias (Guimarães et al., 2010). Entre 1940 e 1960, vários antibióticos foram descobertos, pela triagem de produtos naturais microbianos, sendo a maioria deles eficazes para o tratamento de bactérias Gram-positivas: betalactâmicos (cefalosporina), aminoglicosídeos (estreptomicina), tetraciclinas (clortetraciclina), macrolídeos (eritromicina), peptídeos (vancomicina) e outros (cloranfenicol, rifamicina, clindamicina e polimixina). Neste período, apenas três derivados sintéticos foram introduzidos no mercado: isoniazida, trimetoprima e metronidazol. Entre 1960 e 1980, foram introduzidos no mercado antibióticos semi-sintéticos eficazes para o tratamento de patógenos Gram-positivos e Gram-negativos, análogos aos antibióticos naturais já existentes. Entre 1980 e 2000, a genômica foi uma das principais ferramentas utilizadas para a busca de novos antibióticos. Houve, porém, uma redução dramática na identificação de novos protótipos antibióticos, ao mesmo tempo em que ocorreu um aumento na incidência de resistência
bacteriana. Este período é marcado pela modificação do mercado de antibióticos e pela introdução da classe das fluoroquinolonas sintéticas na metade dos anos 80, desenvolvidas a partir do ácido nalidíxico. Alguns antibióticos baseados em protótipos naturais, como o imipenem e análogos da eritromicina também foram introduzidos neste período (Guimarães et al., 2010).
A partir de 2000, poucos antibióticos foram introduzidos na terapêutica antimicrobiana. Em 2001, apenas um antibiótico de origem sintética da classe das oxazolidinonas foi introduzido no mercado farmacêutico, a linezolida (Guimarães et al., 2010). Atualmente, os programas direcionados ao estudo de novos antibióticos oriundos de fontes naturais têm sido retomados em algumas indústrias farmacêuticas como alternativa aos produtos sintéticos amplamente utilizados. Com o grande advento de pesquisas centradas no modo de ação pelo qual as culturas desenvolvem resistência, foi constatado que tal evento é altamente estimulado quando as culturas se desenvolvem em um modo diferenciado de colonização, denominado biofilme.
2.2- FONTES DE CONTAMINAÇÃO E DISPERSÃO MICROBIANA
Quando fixos a um suporte, os microrganismos se agregam e formam biofilmes, o que lhes confere a capacidade para estabelecer-se em variados locais e em inóspitas condições nutricionais, além de facilitar a comunicação intercelular através de moléculas sinalizadoras de níveis populacionais e de nutrientes, que lhes garante maior chance de viabilidade. A estrutura unificadora e protetora dos biofilmes é denominada matriz extracelular (EPS, Extracellular Polymeric Substances), de composição heterogênea e complexa. Ainda que, de uma maneira geral, sejam os polissacarídeos a prevalecer, a EPS pode também ser constituída por proteínas, ácidos nucléicos, glicoproteínas e fosfolipídios (Vieira, 1995). Estudos mostraram que a EPS promove a adesão, proliferação e diferenciação celular, além de poder conter regiões hidrofílicas e hidrofóbicas em sua estrutura química, permitindo o depósito microbiano em diversas superfícies (Tsuneda et al., 2003). A penetração de substâncias através destas estruturas se dá através de canais preenchidos pelo meio líquido circundante, que facilitam a transferência de massa (Xavier, 2002).
Os biofilmes são formados a partir de uma sequência de eventos, de acordo com as etapas de adesão e de adaptação dos microrganismos ao suporte (Figura 1). A primeira etapa
envolvida na formação de um biofilme, a adesão dos colonizadores primários, é fundamentalmente controlada por interações iônicas negativas e/ou positivas entre a parede celular dos microrganismos e as macromoléculas do filme condicionador que se forma a partir de resíduos do próprio ambiente. Apêndices celulares externos, como flagelos, fímbrias e pílis também desempenham papel importante na adesão celular inicial, além de formarem pontes entre as células e a superfície (Christensen e Characklis, 1990). A adesão irreversível é quase sempre mediada pelos polímeros extracelulares. Após o contato com a superfície e a instalação microbiana, ocorre a fase de crescimento e divisão celular. Assim, ocorre a consolidação do material extracelular (biofilme propriamente dito), fazendo com que as ligações entre as células e a superfície se fortaleçam (Figura 2). A partir de então, dentro de dias a meses, a adesão de outros microrganismos é facilitada, e ocorre a liberação de novos colonizadores que se desprendem do biofilme maduro. Os microrganismos liberados formarão novos biofilmes, caracterizando um ciclo de contaminações (Christensen e Characklis, 1990).
Estima-se que mais de 90% dos microrganismos existentes esteja sob a forma de biofilmes (Costerton et al., 1987) e que praticamente não há nenhuma superfície que não possa ser colonizada por microrganismos. Machado (2005) avaliou o efeito de um produto antimicrobiano com ação surfactante (cloreto de benzalcônio) em biofilmes de Pseudomonas fluorescens formados sobre aço inoxidável e silicone. Em ambos os materiais houve a formação de um consistente biofilme, mas na superfície do aço a inativação microbiana foi mais difícil que sobre o silicone.
Figura 1: Estrutura típica de um biofilme e principais etapas de formação. Microrganismos em suspensão (células planctônicas) Adesão celular em superfície (células sésseis) Superfície Fluxo de água Formação de EPS: desenvolvimento de biofilme Dispersão de biomassa contaminante
(a) (b)
Figura 2: Fotomicrografia ilustrativa das diferenças morfológicas entre uma mesma cultura
da bactéria Staphylococcus sp. (a) sob a forma planctônica, em condições ambientais favoráveis; (b) em condições inóspitas de crescimento, favorecendo a formação de biofilme (fonte: Center for Biofilm Engineering, 2003).
A maioria dos biofilmes comumente encontrados em ambientes diversos é composta por associações de diferentes grupos e espécies microbianas (Figura 3). Muitos estudos têm demonstrado que não há relação direta entre o efeito do agente químico para erradicar as células livres e para erradicar o biofilme formado, já que além das diferenças fisiológicas e estruturais entre ambas as formas de vida dos microrganismos, as células aderidas em um dado local podem não ser as mesmas encontradas na forma dispersa (Capelletti, 2006). Desta forma, em sistemas industriais, por exemplo, a troca periódica de produtos antimicrobianos se faz necessária para cada situação específica, onerando e dificultando a manutenção do controle microbiológico dos processos. Tal situação se complica quando a ocorrência envolve a área da saúde, com implicações na vida humana. A concentração de microbicida empregada para eliminar as células planctônicas em relação às mesmas na forma de biofilmes pode chegar a até 1.000 vezes a empregada usualmente, ou até mesmo ser necessária a substituição do agente antimicrobiano para que o biofilme seja efetivamente erradicado (Costerton et al., 1987; Lucchesi et al., 2006; Capelletti, 2006).
Portanto, a prevenção do desenvolvimento de biofilmes é especialmente importante, pois a resistência intrínseca dos biofilmes a sanitizantes é claramente demonstrada em diversos estudos, como os efetuados com células não aderidas de Listeria monocytogenes, em que as mesmas foram eliminadas após 30 segundos de contato com o sanitizante cloreto de benzalcônio, enquanto as células aderidas resistiram ao mesmo tratamento por 20 minutos
(Frank e Kofi, 1990). Outros microrganismos, como Pseudomonas fluorescens e Yersinia enterocolitica, quando na presença de hipoclorito de sódio, sofreram redução celular de 5 log quando em suspensão, mas as células aderidas foram atingidas no máximo em 3 log (Mosteller e Bishop, 1993).
Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura de parte de uma placa bacteriana dentária
típica, mostrando a associação entre Fusobacterium sp e Streptococcus sp (Bos et al., 1999).
Vários são os mecanismos pelos quais os microrganismos desenvolvem resistência a tratamentos antimicrobianos. Pode, por exemplo, ocorrer a inativação ou modificação da substância. Como exemplo desta situação, tem-se a desativação enzimática da penicilina por certas bactérias resistentes, pela produção de β-lactamases. Também, pode haver alteração física do sítio de interação com antimicrobianos, como em Staphylococcus sp resistente à meticilina (MRSA) e em outras bactérias resistentes à penicilina. Em alguns casos observam-se modificações da via metabólica celular em que, por exemplo, bactérias resistentes a tratamento com sulfonamida deixam de necessitar de ácido para-aminobenzóico (PABA) para a síntese de ácido fólico. Finalmente, pode ocorrer redução do acúmulo intracelular de agente ativo por diminuição da permeabilidade e/ou aumento do efluxo na superfície celular. Os genes que codificam estes mecanismos de defesa podem ser transmitidos para a próxima geração e entre microrganismos de diferentes estirpes, principalmente quando a densidade microbiana é elevada, como nos biofilmes (Davison, 1999).
Um dos principais fatores envolvidos na persistência de patógenos é o uso inapropriado de sanitizantes (tipo e concentração ineficazes), que pode gerar cepas tolerantes
a este tratamento no sistema de água, no qual os contaminantes voltam a se proliferar, causando uma falsa segurança de desinfecção. O mesmo princípio se aplica quando do uso indiscriminado de antibióticos, favorecendo a posterior resistência microbiana a diversos tratamentos. Um agravante a este fato é que, na forma de biofilmes os microrganismos interagem através de substâncias que são secretadas e que possibilitam às células a informação sensitiva necessária para a modulação da expressão gênica e de metabólitos para a adaptação perante diversos fatores, tais como o controle do nível populacional para garantia de nutrientes e permanência da comunidade microbiana (Camilli e Bassler, 2006). Bactérias Gram-positivas geralmente secretam peptídios, enquanto a maioria das Gram-negativas tem como metabólito principal moléculas chamadas acil-homosserino lactonas. Assim, muitas bactérias patogênicas são capazes de transitar entre a vida no meio ambiente e no organismo humano, tendo habilidade para se adaptar a alterações súbitas na disponibilidade de nutrientes e nas respostas do sistema imune do hospedeiro, e a formação de biofilme é um exemplo relevante de adaptação microbiana (Jefferson, 2004).
2.3- CONTAMINAÇÕES EM AMBIENTES CRÍTICOS E AQUISIÇÃO DE INFECÇÕES
Durante séculos, as pessoas que adoeciam eram isoladas em locais úmidos, sem luz natural, e sem cuidados higiênicos e dietéticos. Não raro, um paciente admitido por uma enfermidade degenerativa, ou lesão externa, acabava falecendo por outra, infecciosa, como a cólera, febre tifóide ou por supurações. Porém, a aquisição de novas doenças e o óbito eram associados a crenças e superstições. No decorrer do tempo, mesmo que ainda não se dispusesse dos conhecimentos de microbiologia, foi-se percebendo a associação entre hospitalização e infecção. As transformações ocorridas, sobretudo no século XVIII, possibilitaram que os hospitais exercessem uma ação terapêutica mais efetiva, com o questionamento sobre todas as condições que favoreciam o contágio e com a mudança da concepção de hospital como um local onde as pessoas eram internadas para serem excluídas do convívio social, para um local de cura e medicação (Angerami e Andrade, 1999).
Ignaz Philipp Semmelweis, médico obstetra de origem húngara, é considerado o precursor no controle de infecções hospitalares. Em meados de 1840, observou uma diferença no número de casos de infecções adquiridas pós-parto (puerperal) em duas clínicas de um hospital em Viena. Na primeira clínica, as gestantes eram examinadas por médicos que
também estavam presentes constantemente na sala de necropsias, enquanto na segunda clínica, os atendimentos eram realizados por parteiras e o número de infecções era substancialmente menor. Certa vez, um dos médicos foi acidentalmente ferido por um bisturi, durante a realização de uma necropsia e adquiriu uma infecção similar à das puérperas, levando Semmelweis a concluir que ele havia sido contaminado pela mesma “matéria”, já que nesta época o conceito sobre a existência de microrganismos ainda não era bem estabelecido. Tal como o bisturi da dissecação introduziu o agente infeccioso na corrente sanguínea do patologista, as mãos contaminadas dos médicos o carregavam da sala de necropsia para as mulheres durante os exames e o parto. Então, em maio de 1847 Semmelweis tornou compulsório para todos os profissionais do hospital a lavagem das mãos com uma solução clorada, o que reduziu drasticamente a mortalidade por este tipo de infecção, de 12% para 1,9% (Veiga e Padoveze, 2003).
A utilização de medicamentos antimicrobianos sistêmicos em larga escala, iniciada na década de 1940, possibilitou o tratamento das doenças infecciosas e a redução das infecções em pacientes hospitalizados. Hospitais militares se depararam com Streptoccoccus pyogenes resistentes à sulfonamida, medicamento muito utilizado em feridas. Da mesma forma, a resistência da Mycobacterium tuberculosis à estreptomicina se deu pouco depois da introdução deste medicamento no mercado. Aturdida pelas infecções por Staphylococcus aureus nos hospitais, a comunidade médica recebeu com grande entusiasmo os novos agentes antimicrobianos (Santos, 2006). Logo após o início do uso da penicilina, os hospitais se confrontaram com a emergência da resistência dos Staphylococcus aureus a este medicamento. Em meados de 1950, surtos de infecções por estafilococos resistentes foram identificados em praticamente todo o mundo, caracterizando assim o fenômeno da resistência como uma pandemia. Mais tarde, na década de 1960, novos microrganismos, especialmente as bactérias Gram-negativas e os fungos, surgem como agentes das infecções nos hospitais (Santos, 2006).
Paradoxalmente, a resistência microbiana foi um dos principais estímulos para que os profissionais de saúde e administradores hospitalares reconhecessem a necessidade de medidas de controle e prevenção das infecções adquiridas durante a hospitalização. Em ambientes cuja contaminação tem impacto direto na saúde humana, a criticidade de controle deve ser ainda maior. Infecções nosocomiais oriundas da água podem ser transmitidas por contato, ingestão ou aspiração. Há casos em que intervenções severas são necessárias, restando apenas a restrição do uso da água como medida para prevenir ou interromper o
processo de infecção em pacientes de alto risco (Squier et al., 2000). Por exemplo, o guia de diretrizes da área de saúde na União Européia recomenda que a água de torneira para uso em clínicas odontológicas apresente contagem microbiana abaixo de 100 unidades formadoras de colônia por mililitro (<102 UFC/mL) a 22°C (Karpay et al., 1999). O mesmo índice é aplicável para água de diálise, segundo o Centers for Disease Control and Prevention, nos Estados Unidos (Sehulster e Chinn, 2003).
Em um levantamento realizado por Rogues et al. (2007) em uma unidade de terapia intensiva de um hospital na França, detectou-se a bactéria P. aeruginosa em aproximadamente 10% das águas de torneira amostradas (dentre 657 coletas). A porcentagem de transmissão deste contaminante às mãos dos profissionais de saúde foi de 14% e a mesma cepa foi detectada em 38 pacientes.
A água está presente em praticamente todas as partes da instituição hospitalar. Dentre as áreas de maior consumo destacam-se os geradores de vapor, equipamentos de hemodiálise, os setores de análises laboratoriais, de processamento de materiais cirúrgicos, o sistema de condicionamento de ar e as lavanderias (Anaissie et al., 2002). Os principais reservatórios de patógenos em ambientes clínicos relatados em literatura são a água potável, a água para diálise, a água usada para lavagem de aparatos médicos, a utilizada em torneiras e chuveiros, as linhas de água em clínicas odontológicas e em lavadores de olhos (Sehulster e Chinn, 2003).
Portanto, se o planejamento do sistema de distribuição de água não contemplar certas precauções, como a minimização de cantos para evitar acúmulo de água estagnada, este pode transformar-se em importante veiculador de patógenos. A água disponibilizada através de torneiras tem sido correlacionada com incidência de bacteremias, infecções em pacientes queimados e em áreas cirúrgicas (Pegues et al., 1994). A habilidade de bactérias Gram-negativas de sobreviver sob elevada umidade por longos períodos explica sua comum ocorrência nestes ambientes (Rutala e Weber; 1997). A contaminação é, então, transferida quando as mãos se tornam contaminadas durante a lavagem (Pegues et al., 1994).
Um estudo envolvendo a desinfecção em um hospital italiano contaminado com Legionella pneumophila foi realizado aplicando-se ácido peracético em circulação nas tubulações do sistema de água (Ditommaso et al., 2005). Testes in vitro mostraram que a concentração efetiva para a eliminação do contaminante presente no sistema foi de 50 ppm
após 5 minutos de contato. Com base neste resultado, foi realizado um processo de desinfecção em quatro etapas. Na primeira etapa fez-se a desinfecção com 50 ppm de ácido peracético por 30 minutos. Na segunda, o tratamento foi repetido semanalmente ao longo de três semanas; na terceira, a desinfecção foi realizada nas mesmas condições de tempo de contato e concentração de ácido peracético, com repetição mensal do procedimento por cinco meses. Finalmente, na fase 4, foram adicionadas 1.000 ppm de ácido peracético, com tempo de contato de também 30 minutos. Apesar das múltiplas etapas de tratamento efetuadas, foi detectado retorno do desenvolvimento da bactéria 30 dias após a desinfecção, em concentração microbiana superior à inicial ao tratamento, devido à permanência de biofilmes no interior das tubulações de água, que protegeram os microrganismos contra o agente desinfetante.
A transferência de patógenos da água a instrumentais médicos é uma rota de difícil constatação e que pode levar a um incorreto diagnóstico da infecção. Dados fornecidos por um estudo sobre infecções nosocomiais relacionadas à água (Pall Corporation, 2006) mostraram que dentre os aparatos comumente envolvidos na transmissão destacaram-se os nebulizadores e as torneiras, debilitando pacientes com problemas respiratórios, queimados, neonatos, os sob recuperação de cirurgia cardíaca e neurocirurgia, bem como idosos, que são muito vulneráveis. Segundo o CDC dos Estados Unidos, recomenda-se que para a lavagem de materiais médicos, tais como endoscópios e broncoscópios, deve-se utilizar água de elevado grau de qualidade, a fim de se evitar a proliferação microbiana e a formação de biofilmes no interior destes aparatos Sehulster e Chinn (2003).
De acordo com informações disponibilizadas pelo Ministério da Saúde (1995), a provisão ideal de reservatórios de água deve considerar os tanques para água potável de modo a permitir o uso de unidades alternativas, enquanto um tanque estiver interditado para reparos ou limpeza, e outros dois, totalmente segregados dos de água potável, destinados a suprir água para descarga de bacias sanitárias e similares, abastecidas geralmente com água de poço, proveniente de mina ou mesmo de chuva. A segregação destas caixas desempenha papel importante na prevenção de contaminação da rede de água. É sabido que, no sistema de válvula flexível, a água, quando descarregada em bacia sanitária cheia (por entupimento ou problemas mecânicos) acaba por criar uma variação de pressão negativa no duto de alimentação da bacia, acarretando e, consequentemente, aspiração e ascensão de água poluída, com possibilidade de transmitir contaminantes à caixa de água. Esta transmissão pode atingir aparelhos como lavatórios, chuveiros e torneiras de lavagem, quando alimentados pelo mesmo
duto de descida que supre a bacia sanitária. Todavia, a efetiva contaminação por esta rota carece ser melhor estudada. Neste caso, a aplicação de medidas, como as propostas no presente estudo, utilizando membranas como barreira nas saídas de água, pode impedir a disseminação e contaminação cruzada de patógenos, principalmente em locais susceptíveis ao desenvolvimento microbiano, tais como chuveiros e torneiras, que podem ser uma fonte significativa de microrganismos causadores de infecções, prejudicando principalmente a saúde de indivíduos com o sistema imunológico debilitado.
Ao contrário do que se supõe na crença popular, obviamente a água de chuveiro não é suficientemente quente para debelar a transmissão de microrganismos. A maioria da microbiota encontrada nestes aparatos é composta por grupos comumente encontrados em água e solo, e que encontram condições favoráveis para a formação de biofilmes (Feazel et al., 2009). Um chuveiro pode constituir-se em um reservatório de bactérias, como é o caso da Legionella, que integra o grupo das chamadas “water bacteria”. Com o aquecimento da água do chuveiro, esta bactéria se beneficia do vapor d´água que se forma para se disseminar, podendo facilmente atingir o aparelho respiratório do paciente. Além disto, drenos e ralos costumam ocasionar problemas aos hospitais. O seu transbordamento pode levar agentes patogênicos a aflorar e a contaminar os pisos (Ministério da Saúde, 1995).
Em 2001, de forma pioneira, foi realizado um estudo sobre a rota de transmissão de Aspergillus abrangendo chuveiros e torneiras hospitalares (Warris et al., 2001). Foram analisadas 100 amostras deste fungo, isoladas do ar, da água e de pacientes de um hospital na Noruega. Dentre as amostras analisadas, 55 foram coletadas do sistema de água (51% presente em torneiras, 44% na tubulação principal e 5% em chuveiros), 25 foram obtidas do ar e 20 oriundas de treze pacientes imunodeprimidos. As amostras do fungo originadas da água foram geneticamente distintas das amostras coletadas no ar. Em nove dos treze pacientes avaliados, foram detectadas cepas de Aspergillus geneticamente similares àquelas encontradas no sistema de água.
Um relevante fato foi associado com o desenvolvimento de cianobactérias (algas azuis) em reservatórios de água potável, que culminou em uma síndrome conhecida como pneumonia tóxica, em uma cidade na Escandinávia. A manifestação de sintomas como febre e sinais de falência relacionados ao trato respiratório ocorreram de 1,5 a 6 horas após pessoas banharem-se habitualmente. Endotoxinas dispersas nos aerossóis gerados durante o banho foram relatadas como provável agente (Annadotter et al., 2005). Em muitos casos, reações
pirogênicas foram também reportadas como decorrentes de lipopolissacarídeos microbianos (EPS) formados por biofilmes (Sehulster e Chinn, 2003). No Brasil, em 1996, um importante surto de infecção hospitalar transmitido pela água ocorreu na cidade de Caruaru, em Pernambuco, afetando 131 pacientes renais crônicos submetidos à hemodiálise. Destes, 46 faleceram por intoxicação pela toxina microcistina produzida por algas ali presentes (Agência Fapesp, 1996).
Assim, nestes e em diversos outros casos em que haja potencial de disseminação de contaminantes, é de extrema relevância a diminuição da carga microbiana à qual os indivíduos possam se expor, podendo se fazer necessária a intervenção direta na rede de distribuição ou até mesmo a restrição do uso da água oriunda desta fonte.
Com o uso de modernos métodos moleculares hoje utilizados para a detecção de bactérias em água, nota-se que o significativo nível e tipo de contaminação microbiana residente denota que a água havia sido por muito tempo subestimada na qualidade de ser fonte de infecções no âmbito hospitalar.
Segundo a Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), os fungos são responsáveis por aproximadamente 8% das infecções hospitalares totais, sendo o gênero Aspergillus o principal causador de infecções em pacientes imunocomprometidos, em especial as espécies fumigatus e flavus, levando à morte aproximadamente metade dos acometidos (Anvisa, 2004). Porém, são muitos os patógenos que podem acometer pacientes debilitados, tais como: Escherichia coli, Klebsiella sp, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Nocardia sp, Mycobacterium, Haemophylus influenzae, Neisseria meningitidis, dentre outros (Nucci e Maiolino, 2000). Alguns microrganismos merecem destaque, como a bactéria Pseudomonas aeruginosa, que está frequentemente envolvida em enfermidades humanas, tanto em número quanto em tipos de infecção, e é encontrada em diferentes regiões do corpo e ambiente por ser facilmente adaptável a diferentes condições adversas. Esta bactéria está onipresente na água e tem sido responsável por taxas de mortalidade em torno de 30% entre pacientes com pneumonia e septicemia e de 60% em queimados (Angelbeck, 2004). Já a bactéria Legionella pneumophila, pode causar pneumonia tanto durante a internação hospitalar (por contaminação da água e transmissão pelo ar) quanto no ambiente extra-hospitalar, e a Serratia marcescens é geralmente associada à pneumonia e septicemia em pacientes que recebem quimioterapia. Este último microrganismo tem crescimento lento, com propriedades invasoras e tendência a resistir a muitos dos antibióticos utilizados na atualidade
(Koneman et al., 2001). Adicionalmente, as metilobactérias, caracterizadas por apresentarem crescimento lento e resistência a tratamento à base de cloro, são descritas como importantes patógenos transmitidos pela água (Hiraishi et al., 1995). Destacam-se também as micobactérias, que possuem capacidade de sobrevivência em temperaturas extremas, como em máquinas de gelo e em água aquecida, e a espécie intracellulare que pode persistir por mais de um ano em água destilada. Outras bactérias comumente encontradas em água potável e de grande relevância quanto à incidência de infecções, incluem: Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas hydrophila, Acinetobacter spp., Enterobacter spp., Flavobacterium spp. e Burkholderia cepacia (Angelbeck et al., 2006).
Levando-se em conta a elevada prevalência de contaminantes presentes na água, variadas alternativas complementares ao uso de agentes químicos estão sendo consideradas em muitos hospitais no exterior, particularmente os europeus. Na Alemanha, um crescente número de filtros descartáveis são instalados em torneiras e chuveiros para a proteção de pacientes, de modo a evitar a proliferação de biofilmes, pois acima de 40% das infecções por Pseudomonas sp em unidades de terapia intensiva foram associadas à água. A adoção da instalação destes filtros também foi motivada por ter sido considerada uma alternativa bastante econômica, levando-se em conta a compensação pelos gastos minimizados com a reabilitação dos pacientes acometidos e de medidas para tratamento do foco de contaminação. Foi constatado que a instalação de sete filtros em um hospital reduziram os casos de infecção, poupando aproximadamente 82% dos dispêndios normalmente gastos (Reiter, 2004).
Também, é bastante comum a ocorrência da transmissão de contaminantes por via aérea, em que microrganismos geralmente inócuos podem ser causadores de infecções. Microrganismos carreados por este meio podem se dispersar amplamente por correntes de ar e ser inalados por um hospedeiro susceptível. A viabilidade de patógenos presentes no ar é proporcionada por gotículas de água ou por partículas de sujeira, que ficam suspensas no ar por longo período. Supondo-se que no ar de um dado ambiente a concentração microbiana seja de 1.000 unidades formadoras de colônia por metro cúbico, e que um indivíduo normalmente respira 30 litros deste ar por minuto, a carga de microrganismos inalados seria de 1.800 unidades formadoras de colônia a cada hora, enquanto que um sistema filtrante convencional com tamanho de poro médio de 0,5 m processa em torno de 90 unidades formadoras de colônia por hora (Lee et al., 2004).
