sistema digestório globalmente, em todos os segmentos, e separadamente, em cada segmento do sistema digestório; 2. verificar se há correlação entre a ocorrência das lesões no sistema digestório e o uso ou não de HAART).
A - Coleta dos dados morfológicos
O diagnóstico das lesões encontradas no sistema digestório foi feito através de revisão de lâminas histológicas arquivadas dos casos selecionados. Nas necrópsias realizadas na UFTM, após o exame macroscópico do cadáver, foram coletadas amostras dos segmentos do sistema digestório (língua, esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso) posteriormente fixadas em formaldeído a 10%. A padronização de amostragem para
microscopia do sistema digestório no nosso serviço é confeccionar no mínimo um bloco contendo fragmentos de cada segmento sem alterações macroscópicas e fragmentos das lesões encontradas. Posteriormente, cortes histológicos foram preparados a partir dessas amostras e corados através da técnica de hematoxilina-eosina. Quando pertinente, procedeu-se à realização de técnicas histoquímicas especiais de coloração para a identificação de agentes infecciosos ou à revisão das mesmas, quando já existentes: Fite-Faraco para micobactérias; Grocott, PAS e mucicarmin para fungos. Foram revistos os cortes histológicos pela autora da tese e feitos cortes adicionais quando necessário. Apesar da padronização macroscópica, não havia cortes histológicos de todos os segmentos do sistema digestório em todos os casos, sendo os resultados apresentados na forma de números absolutos e porcentagem sobre o total de casos avaliados de cada segmento do sistema digestório.
Foi elaborado um protocolo para o relato das alterações macro e microscópicas encontradas nos órgãos do sistema digestório (Anexo 2). Por fim, os resultados foram dispostos em uma tabela que continha as informações de todos os órgãos analisados em cada necrópsia (Anexo 3).
A.1-Imuno-histoquímica
Quando indicado, foi feito estudo imuno-histoquímico, ou revistas as lâminas previamente feitas, para confirmação microbiológica (anti-toxoplasma, anti-CMV, anti-HSV, anti-papilomavírus humano) e de neoplasias (anti-CD34 e anti-CD117). Empregou-se a técnica de polímeros, utilizando-se novos cortes do material incluído em parafina. Os novos cortes, com espessura de 4µm, foram dispostos em lâminas histológicas silanizadas (ATPS/Silano, A3648, Sigma®).
A seguir, as lâminas permaneceram na estufa a 56°C por 24 horas. Em seguida, foram desparafinizadas em três banhos de xilol, permanecendo cerca de 5 minutos em cada um e hidratadas em 3 banhos de álcool absoluto e um banho de álcool a 80%, durante 10 segundos cada um.
Posteriormente, as lâminas permaneceram em banho de PBS (pH 7,2) durante cinco minutos para hidratação. Logo depois, o excesso de tampão foi removido e a borda do corte cuidadosamente secada com papel absorvente. As lâminas foram colocadas em uma bandeja, adicionando-se água oxigenada a 3% sobre cada corte, durante dez minutos, para bloqueio da peroxidase endógena. Novamente foi feita a lavagem em PBS.
A seguir, foi feita a recuperação dos antígenos: foram colocados 250µl de tampão citrato pH 6 (Reagen) sobre as lâminas; essa incubação foi feita na panela Pascal (vapor de água a 121°C e 18psi) por 30 minutos. Após essa etapa, as lâminas foram novamente lavadas em 3 banhos de cinco minutos no tampão PBS e incubadas com seus respectivos anticorpos primários em torno de 18 horas, em câmara úmida com temperatura de 3 a 4°C. Os anticorpos foram diluídos em soro de albumina bovina (Sigma ®) de acordo com as indicações presentes em suas especificações. Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais: anti- toxoplasma (Novocastra-NCL-TG-TP3) 1:1200; anti-citomegalovírus (Novocastra-NCL- CMV-pp65) 1:200; anti-herpes simples vírus (Dako-HSV Tipo I e Tipo II) 1:2000; anti- papilomavírus (Dako-BVP-1) 1:800; anti-CD34 (Biocare Medical-CD34) 1:600; anti-CD117 (Zeta corporation-CD117-YR145) 1:600.
Após incubação por toda a noite, as lâminas foram colocadas em temperatura ambiente, em torno de 15 minutos, lavadas em PBS e secas como anteriormente. O reagente pós-primário (Técnica de polímeros - Novolink - Novocastra®) foi adicionado em cada lâmina por 30 minutos à temperatura ambiente, em câmara úmida. Em seguida foram feitas 3 lavagens de cinco minutos cada uma em PBS e secaram-se as lâminas como anteriormente. Logo depois, o reagente Polímero (Técnica de polímeros - Novolink - Novocastra®) foi adicionado por 30 minutos nas mesmas condições acima.
Após três lavagens em PBS, por cinco minutos cada uma, as lâminas foram reveladas através da adição de uma solução cromógena (Liquid DAB, Dako®, Carpinteria, CA) por cinco minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas e contra-coradas com hematoxilina de Harris por dois segundos.
Finalmente, as lâminas foram imersas em 3 banhos de álcool absoluto por cerca de dez segundos cada um e, a seguir, utilizou-se entellan para a montagem das lamínulas.
B - Coleta dos dados clínicos
Durante a revisão dos prontuários anotou-se se os pacientes com aids faziam uso de medicações antirretrovirais ou não, quais as drogas utilizadas e por quanto tempo. Como HAART considerou-se o uso de, pelo menos, três medicamentos (dois inibidores da transcriptase reversa associados a um inibidor de protease ou a um inibidor não nucleosídeo da transcriptase reversa).
Anotou-se o tempo de utilização da HAART, pois, segundo dados da Literatura, quando utilizada por período inferior a 6 meses não haveria benefício de melhoria da imunidade (BATEGAY et al., 2006; HUNT et al., 2003). A intenção inicial era comparar os períodos pré e pós-HAART considerando o ano de 1997 como início do emprego da HAART. Porém, devido à heterogeneidade na utilização da HAART a partir desse período, decidiu-se agrupar os pacientes nos três seguintes grupos de estudo:
Grupo A – Pacientes sem uso de qualquer medicação antirretroviral
Grupo B – Pacientes em uso de 1 ou 2 antirretrovirais por qualquer tempo ou HAART por período inferior aos 6 últimos meses
Grupo C – Pacientes em uso de HAART durante os 6 últimos meses ou mais