METODOLOGIA UTILIZADA NAS INVESTIGAÇÕES

A identificação e a quantificação de cianobactérias e cianotoxinas nos mananciais é o principal componente dos programas de vigilância e podem proporcionar precocemente um efetivo sistema de alerta a respeito do desenvolvimento de florações potencialmente tóxicas (Chorus e Bartram, 1999).

No Brasil têm sido registradas ocorrências de florações de cianobactérias nas diversas regiões (Azevedo,1994; Lagos et al.,1999; Magalhães et al., 2001; Porfírio et al., 1999; Tsukamoto e Takahashi 2007; Yunes, 1996), e a preocupação tem aumentado significamente após o caso de Caruaru. Para análises quantitativas e qualitativas das amostras fitoplanctônicas são necessárias rotinas laboratoriais, que têm início desde a coleta, estocagem, sedimentação e identificação das espécies ao microscópio. Em câmaras de sedimentação apropriadas é possível contar e identificar os organismos em questão. O volume celular é estimado por meio de formas geométricas, correspondentes às dimensões celulares dos organismos. O carbono orgânico e os pigmentos fotossintetizantes, principalmente a clorofila-a, fornecem indicação da biomassa fitoplanctônica (Alves, 2005). Alguns métodos laboratoriais, como bioensaios, HPLC, CG, ELISA, Inibição de Fosfatase e Inibição de Acetilcolinesterase têm sido de grande auxílio na determinação das cianotoxinas, o que possibilita às empresas de abastecimento de água tomarem as providências quanto ao cumprimento da Portaria 518, de 24 de março de 2004 (Alves, 2005), que determina a realização mensal do monitoramento de cianobactérias na água do manancial, no ponto de captação, quando o número de cianobactérias não exceder 10.000 células/mL e semanal quando exceder este valor. Sempre que o número de cianobactérias na água do manancial, no ponto de captação, exceder 20.000 células/mL, diz a portaria, será exigida a análise semanal de cianotoxinas na água na saída do tratamento e nas entradas das clínicas de hemodiálise e indústrias de injetáveis, o que pode ser dispensado quando Não houver comprovação de toxicidade na água bruta por meio da realização semanal de bioensaios em camundongos de acordo com a metodologia proposta pela OMS (Brasil, 2004). Esta

Norma exige apenas a análise de microcistinas, estabelecendo o valor de 1 µg/Lpara a microcistina-LR total (conjunto da intracelular e extracelular) na água para consumo humano, embora a própria OMS considere inexistente uma base fiável para estimativa de exposição às cianotoxinas (Chorus e Bartram, 1999).

As microcistinas são as toxinas que têm métodos de detecção e quantificação mais desenvolvidos. Valores para outro tipo de cianotoxinas não foram estabelecidos devido à insuficiência de dados (Falconer et al. 1999).

A identificação de cianobactérias é amplamente recomendada e tem sido utilizada, tomando-se por base suas características morfológicas (Bittencourt- Oliveira et al., 2001; Sivonem e Jones, 1999). No entanto, apenas a identificação não é suficiente em razão da grande diversidade fenotípica de algumas espécies (Calijuri et al., 2006). Portanto, outros métodos para detecção e quantificação de cianotoxinas devem ser utilizados. Os métodos em uso atualmente compreendem os biológicos realizados por bioensaios, os métodos bioquímicos e os físico-químicos; os primeiros são indicados para aferir os efeitos das toxinas e os últimos para quantificá-las (Lorenzi, 2004). Aqui serão suscintamente descritos os métodos integrantes da rotina de monitoramento das águas de consumo humano no Brasil.

3.1. Método Biológico

3.1.1. Bioensaios

A utilização de camundongos tem sido o teste padrão para avaliação de toxicidade de cianobactérias, no que se refere à saúde pública. É econômico, pode ser facilmente utilizado em laboratórios por não exigir equipamentos sofisticados e fornece uma resposta dentro de poucas horas (Azevedo e Chassin, 2003). Entretanto, esta é uma prática que tem implicações éticas, há uma crescente oposição ao uso e sacrifício de animais nos testes de toxicidade e ocorre que nem sempre as companhias de abastecimento têm condições de obter e manter os animais-teste (Calijuri et al, 2006). Segundo Chorus e Bartram (1999), os bioensaios

são recomendados em algumas situações: quando Não houver disponibilidade de equipamentos, métodos analíticos ou pessoal capacitado para realização de análises químicas, quando a toxicidade de uma floração for diferente das que já ocorrem habitualmente em reservatórios destinados ao abastecimento público ou quando for necessária a confirmação dos resultados de análises químicas, especialmente para confirmação de bioatividade da toxina.

3.2. Métodos Físico-Químicos

3.2.1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Performance Liquid Chromatography (HPLC) em inglês, é um método largamente utilizado no Brasil. Trata-se de um método físico-químico para separação de componentes de uma mesma mistura (De Sá, 1994). A CLAE tem sido amplamente utilizada para detectar, quantificar, purificar e isolar algumas cianotoxinas (Meriluoto et al., 2000; Dahlmann et al., 2001). Nesta técnica faz-se passar a amostra por uma coluna de sílica – C18 (fase reversa), com um gradiente de acetonitrilo e água, ambos com ácido trifluoracético (fase móvel). De acordo com a polaridade, as microcistinas vão sendo retidas durante mais ou menos tempo, ao que denomina-se (tempo de retenção) neste sistema. À saída da coluna está um detector fotodíodo (PDA) que capta a absorção pelas substâncias que por aí passam. As microcistinas caracterizam-se por ter um espectro de absorção máximo a 238 nm (banda UV) devido ao resíduo ADDA. Embora seja uma metodologia semi-selectiva e com um grau de detecção bastante bom, na ordem dos nanogramas (James et al., 1998; Dahlmann et al., 2001), requer instrumentação especializada, cuidados na preparação das amostras e a comparação com padrões de toxina (existem apenas 3 padrões no mercado: microcistina-LR, -YR e –RR) (Rivasseau et al., 1999).

3.3. Métodos Bioquímicos

3.3.1. Ensaio do Imunoadsorvente Ligado à Enzima

Ensaio do Imunoadsorvente Ligado à Enzima ou ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) em inglês, é um método que utiliza anticorpos que foram desenvolvidos contra a microcistina-LR (Chu et al., 1989). Quando os anticorpos são fixados às toxinas, as enzimas podem ser usadas para produzir uma reação promovendo uma alteração de cor; esta é a base do ELISA. Segundo Pearson (1990) este método tem se mostrado mais sensível que o bioensaio com camundongos. Apresenta as vantagens de ser altamente sensível e, adicionalmente, possibilitar a análise de grande quantidade de amostras num único dia, o que reduz custos por análise. Como desvantagens pode-se dizer que há alguma dificuldade de obtenção de anticorpos específicos para microcistinas e podem ocorrer interferências de outros componentes da amostra, possibilitando falsos positivos e falsos negativos, além do custo dos kits e do leitor de placas (Calijuri et al., 2006).