Microscopia de Fluorescência

Utilizando um marcador de emissão fluorescente, a tetraciclina, foi pos- sível diferenciar, claramente, o osso regenerado do osso cortical antigo, as-

F/g. 55 - Cimento de Vidro Bioactivo - 1 0 semanas. Presença de tecido ósseo, junto da interface, em fase de maturação avançada. Apesar da menor mineralização da matriz relativamente ao osso cortical antigo, observam-se esboços da formação de sistemas haversianos. (M.O., H+E - 200 X)

Fig. 56 - Cimento de Vidro Bioactivo - 10 semanas. Pormenor da zona de interface.

Identifica-se a matriz óssea com osteócitos, com morfologia característica, e a degradação da camada superficial do cimento. (M.O., H + E - 400 X)

sim como os locais que apresentavam uma maior actividade de formação/ remodelação óssea na altura da administração do marcador, uma semana antes do sacrifício dos animais.

Através da comparação das imagens observadas em microscopia de fluorescência e as imagens de cortes das mesmas amostras obtidas em microscopia óptica convencional, foi possível observar uma concordância nas estruturas identificadas como sendo osso neoformado e a existência de zonas com um processo de formação/remodelação óssea em fase de grande actividade.

Não sendo utilizado qualquer processo de coloração das amostras, a in- cidência da luz UV nas lâminas permitiu apreciar dois tipos de coloração do campo histológico, que vão do verde escuro ao amarelo claro. As zonas com coloração mais escura correspondem aos tecidos mais antigos enquanto que as zonas de coloração mais clara correspondem aos locais de maior deposi- ção de marcador fluorescente e, por conseguinte, às zonas de maior activi- dade metabólica do processo remodelativo do tecido ósseo.

3.2.1. Amostras Metálicas (Aço Inox e Titânio)

As amostras com implantes de aço inox e titânio, observadas através da microscopia de fluorescência, não foram muito elucidativas quanto aos as- pectos fundamentais da estrutura óssea que rodeava os implantes. Este fac- to, observado em todas as lâminas contendo amostras com pinos metálicos, deveu-se, provavelmente, à maior espessura destas amostras (>50 um), que impossibilitou uma boa observação das estruturas por sobreposição de dife- rentes planos de focagem.

Apesar desta significativa limitação, verificou-se a existência de uma ca- mada tecidular, com características de tecido fibroso, interposta entre o osso e a superfície dos implantes de aço inox (Fig. 57). Esta camada de tecido fibroso apresentou diferenças de espessura ao longo do perímetro da interface, parecendo existir, nalguns pontos, um contacto entre o osso e o material.

Nas amostras de titânio pouco mais se observou do que um contacto próximo entre o osso e a superfície dos implantes deste material. Notou-se, ainda, que a camada de tecido formado junto à superfície do material apre- sentava uma maior fluorescência do que o osso cortical antigo. Este fenóme- no pode ser indicador de maior actividade de remodelação óssea a este nível (Fig. 58).

Fig. 57- Aço Inox - 4 semanas. Estrutura do tecido ósseo com pouca nitidez devido

à espessura das amostras. Maior fluorescência junto da interface. Identifica-se te- cido fibroso interposto entre o pino e o osso neoformado. (Microscopia de Fluorescência - 1 0 0 X)

Fig. 58 - Titânio - 4 semanas. Identicamente à figura anterior, observa-se pouca

nitidez na estrutura dos tecidos ósseos e da zona da interface. Maior fluorescência da camada tecidular depositada junto da interface. (Microscopia de Fluorescência -100X)

Pelas razões anteriormente apontadas, a observação das amostras con- tendo os pinos metálicos (duas lâminas para cada tempo seleccionado) não permitiu realizar uma boa caracterização das estruturas destas amostras.

3.2.2. Osteopatite®

As imagens das amostras contendo os grânulos de Osteopatite®, obser- vadas através da microscopia de fluorescência, evidenciaram linhas de gran- de deposição do marcador utilizado. Nas zonas do tecido ósseo regenerado, em posição mais próxima da superfície dos grânulos, nos vasos e nos pontos correspondentes à localização das células osteoblásticas, identificou-se uma intensa coloração amarelo clara, correspondente às zonas de maior activida- de metabólica e de deposição da tetraciclina (Fig. 59).

Em todas as amostras analisadas, observou-se a localização preferencial de zonas de maior intensidade fluorescente nos locais onde a formação/re- modelação óssea foi mais intensa. Foi possível identificar, de forma clara, a orientação concêntrica das lamelas ósseas que envolviam os vasos, posicio- nados centralmente, com disposição e orientação característica do sistema haversiano do osso cortical. No tecido ósseo depositado nos espaços entre os grânulos foram evidentes os sinais identificativos de um estado precoce de diferenciação estrutural. Notou-se uma organização de osso lamelar que contactava directamente a superfície dos grânulos.

Um indicador do processo evolutivo da reparação óssea é o facto do tecido ósseo regenerado, a partir do periósteo e endósseo, apresentar maior fluorescência comparativamente ao tecido depositado na parte central do osso cortical. Isto permitiu considerar que o tecido formado nestes locais apresentava um estado de desenvolvimento mais tardio no processo de for- mação/remodelação óssea. A evolução deste processo reparador do defeito ósseo preenchido pelos grânulos não é semelhante ao que ocorre durante o processo fisiológico de reparação de fracturas ósseas, onde o crescimento mais precoce se inicia a partir do periósteo e endósseo.

3.2.3. Cimento de Vidro Bioactivo

As amostras de cimento de vidro bioactivo estudadas com esta metodologia mostraram a existência de grande actividade de formação/re- modelação do tecido ósseo que envolvia o material (Fig. 60).

Fig. 59 - Osteopatite® - 4 semanas. Maior deposição do marcador fluorescente junto dos

vasos, no tecido ósseo formado entre os grânulos e na linha de separação entre o osso cortical e o neoformado. De evidenciar as linhas lamelares de células osteoblásticas activas que constituem os sistemas haversianos do osso cortical. (M. de Fluorescência - 100X)

Fig. 60 - Cimento de Vidro Bioactivo - 4 semanas. Maior fluorescência do osso neoformado

a partir do crescimento do periósteo que recobre a parte externa do material. O osso forma- do na interface é mais fluorescente do que o osso cortical antigo. Maior fluorescência do tecido vascular e de algumas células osteoblásticas. (M. de Fluorescência - 100 X)

apresentou estados distintos de diferenciação e maturação em função da sua localização. O osso que recobriu parte da superfície externa do material ti- nha um aspecto trabecular, com linhas limítrofes de grande fluorescência, indicativa de um fenómeno de crescimento activo dessas estruturas a partir do periósteo antigo. Estas trabéculas do osso esponjoso encontravam-se en- volvidas por tecido medular.

Na zona da interface do osso cortical com a superfície do material, foi evidente a formação de uma camada fina de tecido ósseo em fase de organi- zação lamelar, com espessura superior a 50 um, interposta entre a superfície do material e o osso cortical. Este tecido apresentou características que o diferenciaram perfeitamente do osso cortical antigo, havendo mesmo uma linha nítida de separação entre estes dois tecidos. Nesta zona verificou-se a existência de linhas de intensa fluorescência nos tecidos vasculares e em alguns locais da matriz óssea, que correspondiam a células osteoblásticas em fase de grande actividade metabólica. A distinção entre o osso cortical antigo e o osso formado junto da interface estabeleceu-se não só pela dife- rença de coloração mas também devido à presença de sistemas haversianos bem definidos no osso cortical, que não se visualizaram no osso neoformado. Em algumas amostras observou-se o aparecimento de uma linha de frac- tura, com localização na interface formada entre a camada superficial e o nú- cleo do cimento. Esta linha resultou de um artefacto induzido durante o pro- cesso de preparação histológica, possivelmente na fase de desidratação (Fig. 60), que origina fenómenos de contracção diferentes para cada material.