Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Uma caracterização dos poros de um híbrido é necessária a fim de avaliarmos a viabilidade de aplicação do mesmo em meios biológicos. A presença de poros com dimensões controladas é importante do ponto de vista da adesão, proliferação e migração das células cultivadas in vitro ou das células presentes nos tecidos vivos sobre os quais a matriz híbrida será implantada. A interconectividade entre os poros é importante no desenvolvimento de uma adequada vascularização e nutrição das células em migração e proliferação, essencial para a manutenção das mesmas. Entretanto, a complexidade estrutural encontrada no tecido ósseo (porosidade, irregularidade dos poros, variabilidade de tamanho de poros e interconectividade) é um grande desafio durante a produção e caracterização de matrizes que visam mimetizar este tecido.

Apesar da microscopia eletrônica de varredura permitir uma avaliação mais qualitativa que quantitativa da estrutura de poros do material, através dela pode-se estimar o tamanho de poros e a espessura das paredes dos mesmos. Como principais desvantagens, as imagens obtidas são bidimensionais e os campos de visão são mais limitados, permitindo a visualização de apenas uma fração superficial da amostra. Desta forma, o exame do interior da matriz é comprometido, não fornecendo informações adequadas sobre a interconectividade do material (Ho & Hutmacher, 2006; Jones et al., 2007).

A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada neste trabalho com o intuito de se obter uma visualização da estrutura de poros e uma estimativa da faixa de tamanho de poros do material. A técnica de escolha para o nosso trabalho foi a de difração de elétrons retroespalhados, pois fornece informações sobre o mapa composicional das amostras que, apesar de não fornecer os elementos químicos, permite a visualização das diferenças entre eles. Quanto maior a densidade atômica do componente químico, mais brilhante ele aparecerá na imagem. No nosso trabalho, a imagem gerada por esta técnica facilitou a observação da estrutura de poros do material. As imagens obtidas nos híbridos sintetizados com a quitosana Herbarium são mostradas a seguir (Fig. 5.19a a f).

a) b)

c) d)

e) f)

Figura 5.19. Imagens obtidas por MEV de híbridos de sílica e quitosana Herbarium nas diversas composições: a) H10 (aumento de 25x); b) H10 (aumento de 100x); c) H20 (aumento de 25x);

As imagens obtidas mostram que a síntese de híbridos porosos foi possível para as três formulações analisadas quando da utilização da quitosana Herbarium, embora uma análise quantitativa da porosidade do material e da interconectividade não possa ser fornecida adequadamente por esta técnica. Nota-se, entretanto, uma estrutura porosa mais bem definida nos híbridos H10 e H20, onde os mesmos apresentam forma mais regular. Os híbridos H30 apresentaram aspecto mais irregular, embora a presença de poros possa ser observada em todo o material. De fato, à medida que se aumenta a quantidade de solução de quitosana adicionada à solução de vidro, a mistura torna-se mais viscosa e difícil para a formação de espumas. Os híbridos H10 apresentaram uma ampla faixa de tamanho de poros, quando comparado aos outros híbridos, que variou de 80 a 400µm, com poros menores e maiores distribuídos de maneira mais uniforme pelo material. Como mencionado anteriormente, este padrão pode estar relacionado às condições de síntese dos materiais, já que a formação de espuma foi melhor nestes híbridos. Os híbridos H20 apresentaram uma faixa de tamanho de poros parecida que variou de 100 a 400µm, mas com predominância dos poros menores na faixa de 100 a 200µm. A menor faixa de tamanho de poros foi observada em H30, a qual variou de 100 a 250µm, e cujos poros apresentaram um tamanho mais homogêneo ao longo do material e menor conectividade entre eles. A conectividade entre os poros, apesar de não ser avaliada adequadamente pela microscopia, foi observada mais marcadamente nos híbridos H10 e H20.

Híbridos sintetizados com a quitosana Aldrich de médio peso molecular também foram avaliados por microscopia eletrônica de varredura e as imagens obtidas são mostradas a seguir (Fig. 5.20a a f ).

a) b)

c) d)

e) f)

Figura 5.20 Imagens obtidas por MEV de híbridos de sílica e quitosana Aldrich nas diversas composições: a) H10 (aumento de 25x); b) H10 (aumento de 100x); c) H20 (aumento de 25x);

Os híbridos H10 e H20 sintetizados com a quitosana Aldrich mostraram uma estrutura de poros parecida, apresentando uma ampla faixa de tamanho de poros que variou de 100 a 500µm, com predominância de poros na faixa aproximada de 200µm. Apesar da impossibilidade de quantificar por esta técnica, a presença de conectividade entre os poros pôde ser notada. Conectividade entre poros e uma faixa de tamanho de poros significativamente menor (50 a 150µm) foi observada nas amostras H30, o que denota a maior dificuldade de obtenção de espumas com estes híbridos, dificuldade esta também encontrada com a quitosana Herbarium.

Amostras híbridas contendo como fase orgânica a quitosana Aldrich e a fase inorgânica sílica-cálcia (70%SiO2/30%CaO) foram sintetizadas e também analisadas por microscopia

a) b)

c) d)

e) f)

Figura 5.21 Imagens obtidas por MEV de híbridos de sílica-cálcia (70S) e quitosana Aldrich nas diversas composições: a) H10 (aumento de 25x); b) H10 (aumento de 50x); c) H20 (aumento de

25x); d) H20 (aumento de 50x); e) H30 (aumento de 25x) e f) H30 (aumento de 50x).

Nota-se que o padrão apresentado em relação à faixa de tamanho de poros e conectividade entre eles foi parecido com aquele apresentado pelos híbridos 100S, em relação às várias composições avaliadas, com exceção dos híbridos H30 que apresentaram uma faixa de tamanho de poros e conectividade maiores (100 a 250µm) em relação aos anteriores.

Nas imagens obtidas de vidro bioativo 100S e 70S podem ser observados uma ampla faixa de tamanho de poros e um padrão de interconectividade maior que o apresentado pelos híbridos sintetizados (Fig. 5.22a, b; Fig. 5.23a, b).

a) b)

Figura 5.22 Imagens obtidas por MEV de vidro bioativo 100S: a) aumento de 25x e b) aumento de 50x.

a) b)

Figura 5.23 Imagens obtidas por MEV de vidro bioativo 70S: a) aumento de 25x e b) aumento de 100x.

Diante da visualização das matrizes porosas obtidas neste estudo, observa-se que a matriz produzida via sol-gel possui poros mais esféricos, com forma e tamanho homogêneos, diferentes do osso trabecular, cujos poros são mais irregulares na forma e tamanho. As matrizes possuem poros esféricos porque elas são obtidas a partir da produção de bolhas em uma solução que possui em sua composição um agente surfactante que reduz a tensão superficial e estabiliza as bolhas antes da geleificação. A conectividade acontece quando as bolhas esféricas entram em contato umas com as outras antes da geleificação e ficam separadas apenas por uma fina camada de sol. Após a geleificação e processos térmicos, o filme drena e uma contração ocorre, levando à interconectividade (Jones et al., 2007).

Dependendo da aplicação desejada, o tamanho dos poros deve ser cuidadosamente controlado. Na literatura, é postulado que existe uma correlação entre o tamanho de poros de uma matriz e o crescimento de tecido ósseo no seu interior. O tamanho mínimo de poros necessário para possibilitar crescimento ósseo mineralizado é 100µm (Jones et al., 2004). Grandes poros (100 a 200µm) permitem crescimento ósseo substancial, ao passo que poros menores (75 a 100µm) permitem crescimento de tecido não mineralizado. Poros menores (10 a 75µm) são penetrados apenas por tecido fibroso (Karageorgiou & Kaplan, 2005). A interconectividade entre poros deve situar-se acima de 100µm de diâmetro para permitir a angiogênese (Atwood et al., 2004). Apesar disso, matrizes porosas com diferentes tamanhos de poros (50, 75, 100 e 125µm) foram testadas em defeitos ósseos de ratos e todas elas permitiram crescimento de tecido ósseo mineralizado, sugerindo que 100µm pode não ser o tamanho crítico para crescimento ósseo (Itala et al., 2001). O diâmetro de células em suspensão exige um tamanho mínimo de poros, que pode variar de um tipo celular para outro (Yang et al., 2001; Gross & Rodríguez-Lorenzo, 2004). O efeito do tamanho dos poros do biomaterial é mostrado em outro estudo na literatura que mostra um tamanho de poro ideal de 5µm para permitir revascularização, 5 a 15µm para crescimento de fibroblastos, aproximadamente 20µm para crescimento de hepatócitos, 20 a 125µm para regeneração de tecido epitelial, 40 a 100µm para crescimento de osteócitos e de 100 a 350µm para permitir regeneração óssea (Whang, Joseph & Bonfield, 1998). É importante salientar que o conceito de material poroso, sob a ótica da biocompatibilidade, está fundamentado em dimensões de poros completamente diferentes do que é usualmente utilizado para a Química, onde materiais macroporosos apresentam poros com dimensões maiores que 50nm. Contudo, para que um biomaterial seja considerado macroporoso é

necessário que ele apresente poros da ordem do diâmetro Harvesiano (50 a 250µm) (Kawachi et al., 2000).

Levando-se em consideração estes parâmetros, pode-se concluir que o sistema sílica/sílica- cálcia-quitosana pode ser uma alternativa interessante para produção de matrizes porosas, embora uma análise quantitativa da estrutura de poros e da interconectividade deva ser realizada.