Teste de citotoxicidade

Antes da utilização da quitosana Herbarium para a síntese dos híbridos deste estudo, um teste preliminar de citotoxicidade foi realizado através do ensaio MTT (“Mosmann Toxicity

Test”), utilizando-se o pó de quitosana proveniente do interior das cápsulas disponíveis na sua formulação comercial, na sua forma in natura, e também solubilizado em solução aquosa de ácido acético a 0,1M numa concentração de 1%. As células foram semeadas em placas de cultura contendo 24 poços (“well”) de 25 ml e mantidas para crescimento em um ambiente contendo 5% de CO2 e 95% de umidade a uma temperatura de 370C. Procedeu-se

ao plaqueamento das células nos nichos em uma quantidade de 1,7x104 células por poço (utilização de células Sho de ovários de camundongos), aguardando a adesão das mesmas no fundo do poço. Em seguida, as amostras previamente imersas em meio de cultura foram colocadas sobre a monocamada de células depositada nos poços, seguido pela adição de MTT (5 mg/ml). As placas foram incubadas por 1 hora em estufa a 37oC e 5% CO2, seguido

pela colocação de dimetilformanamida 50%-SDS-23% e homogeneização. A medida de densidade ótica foi realizada a 595nm. Três grupos foram analisados:

Grupo 1 (controle): meio de cultura + células;

Grupo 2: meio de cultura + células + solução de quitosana; Grupo 3: meio de cultura + células + quitosana in natura.

Os testes de citotoxicidade foram conduzidos in vitro nos híbridos H10 e H30 após esterilização dos mesmos com raios gama. Foram avaliadas a viabilidade celular de osteoblastos, através do ensaio MTT, e a produção de fosfatase alcalina e colágeno pelas células. O protocolo para a realização dos ensaios foi baseado em estudos já realizados na

literatura (Valério et al., 2004; Agathopoulos et al., 2005; Valério et al., 2005; Rocha et al., 2005; Andrade et al., 2006).

Osteoblastos de cultura primária foram isolados da calvária de ratos neonatos Wistar com 1 a 5 dias. Após aplicação letal de lidocaína intra-abdominal, promoveu-se uma incisão coronal que expôs as calvárias, que foram dissecadas, cortadas e lavadas em uma solução de PBS tamponado sem cálcio e magnésio. Os fragmentos da calvária foram incubados em 1% tripsina-EDTA durante 5 minutos e submetidos a 4 banhos em 2% de colagenase a 370C durante 20 minutos cada, com o objetivo de aumentar a desorção dos fibroblastos aderidos e facilitar a liberação dos osteoblastos. A centrifugação das soluções produziram uma suspensão de células com grande proporção de osteoblastos. A centrifugação a 1000rpm por 5 minutos proporcionou a obtenção do “pellet”, concentrado celular depositado no fundo do tubo. A parte líquida foi desprezada e somente o “pellet” foi utilizado no experimento, sendo adicionado meio de cultura celular (RPMI) com adição de antimicótico e antibiótico (1%) e suplementado com 10% de SBF (soro fetal bovino).

Seguindo o protocolo do ensaio MTT anterior, as células osteoblásticas foram semeadas em placas de cultura contendo 24 poços (“well”) de 25 ml e mantidas para crescimento em um ambiente contendo 5% de CO2 e 95% de umidade a uma temperatura de 370C. Procedeu-se

ao plaqueamento das células nos nichos em uma quantidade de 5x104 células por poço, aguardando a adesão das mesmas no fundo do poço. Em seguida, as amostras previamente imersas em meio de cultura foram colocadas sobre a monocamada de células depositada nos poços. O meio foi trocado em intervalos de 48 horas através de aspiração e colocação de novo meio. Após 96 horas de incubação de cada amostra, a viabilidade dos osteoblastos foi avaliada através do ensaio MTT. Este ensaio é baseado na capacidade de células viáveis em metabolizar o sal de tetrazólium para a formação de cristais de formazan arroxeados, que são solúveis e passíveis de medição através de densidade ótica. Portanto, esta redução só acontece quando as mitocôndrias estão ativas e a conversão (absorbância) está diretamente relacionada ao número de células vivas.

O sobrenadante de cada poço foi removido até que somente 200µL do meio de cultura permanecesse no mesmo. Aproximadamente 60µL de MTT (5mg/mL) foi adicionado em cada poço. Após 2 horas, a morfologia celular foi analisada através do microscopia ótica invertida de fluorescência, sendo que os cristais de formazan foram solubilizados com

100µL de solução- tampão de SDS-HCl a 10%. Após 18 horas de incubação, a medida de densidade ótica foi realizada a 595nm. As análises foram feitas em triplicata em 3 ensaios independentes.

A produção de fosfatase alcalina foi avaliada pelo ensaio de BCIP-NBT. Este ensaio (ALP) é baseado na reação cromatogênica iniciada através da clivagem do grupo fosfato do BCIP pela fosfatase alcalina presentes nas células. Esta reação libera um próton que reduz o NBT em um precipitado arroxeado insolúvel (Valério et al., 2005). A fosfatase alcalina é um marcador bioquímico do metabolismo ósseo, onde podemos definir substâncias que retratam a formação ou a reabsorção óssea. Como a formação é dependente da ação de osteoblastos, os marcadores de formação (fosfatase alcalina óssea) medem produtos decorrentes da ação destas células.

Os sobrenadantes presentes nos poços de cultura foram rapidamente removidos e a camada de células foi lavada em PBS. Logo após, 200µL de solução de BCIP-NBT foi adicionada a cada poço. Após 2 horas de incubação as células foram observadas em microscópio ótico e os precipitados arroxeados insolúveis foram solubilizados em 200µL de solução de 10% SDS-HCl e incubados por mais 18 horas. Da mesma forma que o teste anterior, a medida de densidade ótica foi realizada a 595nm e as análises foram feitas em triplicata em 3 ensaios independentes (Andrade et al., 2006).

A produção de colágeno pelos osteoblastos foi avaliada pelo ensaio de SIRCOL no sobrenadante proveniente da cultura celular. Este método é baseado na propriedade de ligação seletiva do corante syrius-red à porção terminal [Gly-X-Y] tripeptídeo da molécula de colágeno de mamíferos. O colágeno solubilizado foi quantificado por análise de densidade ótica a 595nm. A quantidade de colágeno foi calculada baseada na regressão linear da medida de concentração de um padrão do colágeno tipo 1 previamente conhecido.