Microscopia de força atómica (AFM)

A microscopia de força atómica foi desenvolvida com o objectivo de medir forças interactivas entre moléculas à escala do átomo [51]. Este objectivo foi atingido e, hoje em dia, é uma potente ferramenta com elevada relevância nas ciências biológicas, permitindo o estudo da carga e hidrofobicidade superficiais, assim como, de propriedades mecânicas de moléculas através da utilização de espectroscopia de força. Esta técnica permite ainda a obtenção de imagens tridimensionais da superfície de moléculas com uma resolução a nível molecular, em tempo real, sob condições aproximadamente fisiológicas [52]. De forma a obter estas imagens tridimensionais uma tip que se encontra na ponta de um cantilever percorre a superfície da amostra em estudo. À medida que esta tip é repelida ou atraída pela superfície da amostra, o mesmo ocorre com o cantilever. Uma vez que um raio laser se encontra reflectido na ponta do

cantilever, ocorrerá deflecção. A magnitude desta deflecção será registada pela mudança de

direcção do raio e detectada por um conjunto de fotomultiplicadores, podendo então construir-se a imagem (figura 6). De forma a obter estas imagens poder-se-iam utilizar dois métodos: o método de contacto, em que a tip se encontra em contacto com a amostra, ou o método de contacto intermitente, em que a tip oscila rapidamente por cima da amostra. As imagens tridimensionais da superfície das bactérias E. coli e S. aureus foram obtidas utilizando o método de contacto intermitente, já que este método exerce menos força lateral sobre a amostra, não danificando as células bacterianas [51, 53].

Figura 6 – Esquema do modo de funcionamento da microscopia de força atómica. Um raio laser incide

sobre a ponta do cantilever. Uma vez que o cantilever irá oscilar, com a oscilação da tip sobre a amostra, ocorrerá a deflecção deste raio laser. O conjunto de fotomultiplicadores irá detectar a magnitude desta deflecção, dando as informações necessárias para a construção da imagem pelo computador. Imagem adaptada de [51].

2.3.1. Preparação das amostras

As suspensões de E. coli e S. aureus foram obtidas seguindo o mesmo protocolo descrito na secção Crescimento bacteriano (pág.14), sendo MHA o meio sólido e MHB o meio líquido utilizados. Após atingirem a OD pretendida, 1 mL de suspensão bacteriana foi centrifugado três vezes (Eppendorf mini spin), sendo de cada uma das vezes substituído com tampão PBS 1 (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4) filtrado à

chama (filtros VWR, com membrana de polietersulfona com um poro de 0,22 m e seringas estéreis de 5 mL BD DiscarditTM _{II). As centrifugações decorreram durante 8 minutos para a E.}

coli e 30 minutos para a S. aureus a 13 000 rpm. Após ressuspender o último precipitado em

tampão foram preparados tubos eppendorf com 15 L de péptido, ou água no caso do controlo, e com 135 L da suspensão bacteriana com aproximadamente 2107cfu/mL. As concentrações de BP100, PepRYL, PepRWL e Sub3 utilizadas foram de 1, 10 e 100 M.

As amostras incubaram durante duas horas na estufa (Inculine IL53) e, posteriormente, 100 L de cada amostra foram depositados sobre slides de vidro revestidos com poli-L-lisina (Sigma-Aldrich). Este revestimento confere uma carga positiva ao slide, permitindo a fixação das células bacterianas que possuem carga superficial negativa. Deixou-

se sedimentar durante 20 minutos a 25ºC, lavando-se, de seguida, por 10 vezes a amostra com água millipore. Deixou-se secar ao ar.

2.3.2. Obtenção e tratamento das imagens

As imagens foram obtidas utilizando um aparelho JPK Nano Wizard II, montado sobre um microscópio invertido Zeiss Axiovert 200, utilizando cantilevers de silicone, não revestidos ACL (Applied NanoStructure). Estes cantilevers possuem uma frequência entre 145 e 230 kHz e uma constante de oscilação de 45 N/m. O modo de obtenção de imagens utilizado foi o modo de contacto intermitente e foram guardadas as imagens de altura, erro e de mudança de fase. Em média, foram obtidas cinco imagens provenientes de duas zonas diferentes de cada amostra, com uma área total de 44 m2.As imagens de altura foram tratadas no programa JPK data processing, sendo posteriormente realizadas projecções ortogonais das mesmas no programa Gwyddion (versão 2.24). Informações sobre altura e tamanho foram também obtidas por recurso ao programa JPK data processing.

2.3.3. Tratamento dos dados de rugosidade e inchaço

Para tratar os dados de rugosidade foram utilizadas as imagens de altura. Deste modo, no programa Gwyddion foi empregue um filtro de valores médios para estimar a forma da bactéria. Este filtro permite estimar a forma geral da bactéria pois assume como valor, o valor da média dos valores vizinhos, isto é, para cada ponto avaliado este será substituído pelo valor da média dos pontos vizinhos, dando origem à forma geral da bactéria. Por subtracção da imagem obtida à imagem de altura original, obteve-se uma imagem achatada em que as únicas elevações são as rugosidades existentes na bactéria. A rugosidade de uma parte da imagem, neste caso de toda a bactéria, foi então calculada através do desvio padrão da altura, isto é do valor da média quadrática ou root mean square da altura (Rrms), segundo a equação 3:

) 1 ( ) ( 2 1      _N z z R N i m i rms

em que , N é o total de imagens consideradas, zi é a altura do ponto i e zm é a média da altura

[5]. A rugosidade foi determinada em áreas com uma dimensão fixa de 125125nm2. A média dos valores de rugosidade para cada amostra foi calculada no programa GraphPad Prism®, utilizando uma ANOVA unidireccional para determinar estatisticamente a variância

das médias entre os diferentes grupos. De modo a determinar quais os grupos de médias cuja diferença observada é significativa foi utilizado o teste de Bonferroni, que permite a comparação de diversos conjuntos de dados, que podem ou não possuir o mesmo tamanho. Este teste permite ainda a eliminação de falsos positivos [54, 55]. O tratamento para os dados de inchaço foi idêntico, com omissão do passo de subtracção da imagem submetida ao filtro à imagem de altura original, sendo utilizada a imagem da forma geral da bactéria ao invés da imagem achatada. Desta forma, apenas será avaliado o inchaço da bactéria, já que ao submeter a imagem ao filtro, a rugosidade deixa de ser um factor.