5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.3 Caracterizações físicas e morfológicas das nanoemulsões
5.3.4 Microscopia de Força Atômica (MFA)
A Microscopia de Força Atômica (MFA) é uma técnica de análise que consiste na varredura da superfície de uma amostra com uma sonda com o objetivo de obter sua imagem topográfica com altíssima resolução.
A FIGURA 23 apresenta as imagens obtidas por MFA das nanoemulsões E15 e E16. Nas imagens é possível observar o formato das nanogotas predominantemente esférico, como já era esperado. Foi possível também verificar a presença de tamanhos variados, o que confirma a polidispersividade das nanoemulsões, este fato também era esperado visto que as nanoemulsões foram anteriormente caracterizadas como moderadamente polidispersas. Suganisi et al. (2017) sintetizaram nanoemulsões de curcumina, variando a fase oleosa e as estruturas observadas também possuiam forma esféricas, semelhantes às das nanoemulsões de curcuminoides desse trabalho.
Figura 23 - Micrografia de MFA: (a) nanoemulsão E15 e (b) nanoemulsão E16.
Fonte: Próprio autor.
5.3.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) das nanoemulsões estão apresentadas na FIGURA 23. A imagem de MET mostrou a presença de gotículas esféricas dentro da faixa nanométrica, confirmando os resultados de tamanho de partícula utilizando o equipamento Zetasizer da Malvern® que usa o método de espalhamento de luz dinâmica (Dynamic Light Scattering, DLS) e também confirmou a forma predominantemente esférica apresentada nas imagens de MFA. Imagens semelhantes, foram relatadas na literatura para nanopartículas de policianoacrilato de butila para carreamento de curcuminoides (MULIK, MAHADIK e PARADKAR, 2009).
Thomas et al. (2017) desenvolveram nanoemulsões de curcumina com quitosana e atribuiu a porção mais clara da imagem da fase de óleo, enquanto que a área mais escura significa a curcumina incorporada. Mesmas características podemos verificar na FIGURA 24(c), imagem da emulsão E15 com curcuminoides incorporados, onde a região central da gotícula apresenta uma coloração mais escura o que pode ser atribuído aos curcuminoides encapsulados.
Figura 24 - Imagem de MET das amostras: (a) emulsão E16 (sem curcuminoides) (b) emulsão E15 (sem curcuminoides) (c) emulsão E15 (com curcuminoides).
Fonte: Próprio autor.
As imagens por MET e MFA são importantes para avaliar a morfologia dos sistemas analisados, já que os tamanhos de partícula obtidos por Espalhamento de Luz Dinâmica (Dynamic Light Scattering, DLS) são feitas considerando as partículas como sistemas esféricos, mas sem comprovação. Portanto é importante e necessário verificar a forma das partículas por microscopia (HEURTAULT et al., 2003).
a b
5.4 Atividade antioxidante in vitro
5.4.1 Ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
A curcumina é conhecida pelo seu potencial antioxidante (JOSHI et al., 2017; LIANG et al., 2017; MARTINEZ-CORREA et al., 2017), porém é de fundamental importância verificar se esta propriedade se mantém mesmo após o seu processo de encapsulação. Os resultados apresentados no FIGURA 25 demonstram que a capacidade antioxidante da curcumina e seus derivados se mantiveram nos sistemas nanoemulsionados.
O trabalho de Yi et al. (2016) desenvolveu sistemas de encapsulação de curcumina (2 mg/mL) com conjugados a-lactalbumina (ALA) e ALA-dextrano. O estudo da atividade antioxidante mostrou que curcumina encapsulada com ALA e ALA-dextrano apresentou uma capacidade de eliminação do radical livre DPPH de 60,2% e 64,1%, respectivamente, em uma concentração de 10 µg/mL. Na mesma concentração, as nanoemulsões obtidas nesse estudo apresentaram a taxa de eliminação do radical livre de 86,4%, resultado superior ao encontrado por Yi et al. (2016). A atividade sequestradora do radical livre DPPH foi satisfatória, demostrando o alto poder antioxidade das nanoemulsões com curcuminoides.
Figura 25 - Efeito das nanoemulsões com curcuminoides no sequestro do radical DPPH .
Fonte: Próprio autor.
Um estudo de Jovanovic e colaboradoes atribui o mecanismo antioxidante da curcumina a transferência de um átomo de hidrogênio, proveniente do metileno alfa, como o
mecanismo mais provável para as propriedades antioxidantes da curcumina, em detrimento dos elétrons provenientes do enolato (JOVANOVIC et al., 1999).
Além da hipótese da liberação do hidrogênio do grupo alfa metilênico a carbonila, outra possibilidade para justificar o potencial antioxidande da curcumina seria a liberação do hidrogênio das hidroxilas fenólicas (FIGURA 26).
Figura 26 - Propostas que justificam o mecanismo antioxidante da curcumina, envolvendo a doação de hidrogênio radicalar.
Fonte: Adaptado de SUETH-SANTIAGO et al. 2015.
A atividade antioxidante nas duas reações propostas (FIGURA 26) está relacionada à doação de hidrogênio radicalar, que ao reagir com espécies reativas de oxigênio neutraliza possíveis danos a célula, decorrentes da presença desses intermediários. Apesar do equilíbrio ceto-enólico da curcumina estar normalmente deslocado para a forma enólica, a forma dicetônica pode estar presente em quantidade relevante em locais com pH ácido, como é o caso de tecidos com processos inflamatórios (JOVANOVIC et al., 1999), desta forma melhorando o processo de cicatrização.
5.4.2 Ensaio de quelação do íon ferroso
A habilidade de quelação se resume na capacidade de um composto capturar íons metálicos presentes no meio, impossibilitando que o mesmo reaja com outras substâncias. Evidências indicam que os íons metálicos podem atuar como catalisadores na deterioração oxidativa de macromoléculas biológicas (CHEW et al., 2008; STOHS; BAGCHI, 1995).
O ferro possui importante papel biológico (GUTOWSKI; KOWALCZYK, 2013), visto que no ambiente celular, mais da metade das enzimas são metaloproteínas, e uma parte
delas formam complexos com Fe2+ ou Fe3+ (WALDRON et al., 2009). Em células com metabolismo aeróbico o ferro constantemente está variando seu estado de oxidação para produzir Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Enquanto este metal estiver ligado às proteínas, tudo estará seguro, não obstante, quando desprotegido, o ferro produz muitas espécies reativas e danosas de radicais do O2, além de radicais hidroxilas através do estímulo da lipoperoxidação via reação de Fenton (GUTOWSKI; KOWALCZYK, 2013; WONG; DUCE, 2015).
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + ●OH Reação de Fenton
A capacidade das nanoemulsões quelar o íon ferroso está representado na FIGURA 27. Os resultados mostram que as nanoemulsões exibem alta atividade quelante de ferro com 64,3% de quelação férrica na concentração de 10 µg/mL. Já o controle EDTA apresentou 100% de quelação férrica numa concentração mais elevada de 1 mg/mL. A atividade avaliada comportou-se de forma concentração-dependente. Essa capacidade de quelação pode ser explicada pela natureza nucleofílica dos elétrons livres das hidroxilas e carbonilas da curcumina e seus derivados que podem reagir com íons metálicos, deficientes de elétrons.
Figura 27 - Habilidade das nanoemulsões na quelação do íon ferroso.
Fonte: Próprio autor.
Ao compararmos a habilidade de quelação férrica obtida nesse estudo (64,3%) numa concentração de 10 µg/mL de emulsão, podemos constatar que foi maior do que a encontrada por Ak e Gülçin (2008) para a curcumina pura (56,7%) 15 μg/mL, 20 mM. Os resultados
demonstram a propriedade doadora de elétrons da curcumina e seus derivados para neutralizar os radicais livres pela formação de produtos estáveis. In vivo, o resultado da reação de redução é encerrar as reações em cadeia de radicais que podem ser muito prejudiciais.
5.5 Atividade antimicrobiana
A curcumina já possui atividade antimicrobiana relatada frente a vários microorganismos (MOGHADAMTOUSI et al., 2014). Com esse intuito de verificar se a atividade antimicrobiana da curcumina se manteve mesmo após o encapsulamento, as nanoemulsões foram testadas sobre microrganismos de interesse. Staphylococcus aureus que é responsável por vários tipos de infeções, sendo as infeções de pele as mais comuns, Listeria monocytogenes e Salmonella entérica, também responsáveis por infecções, principalmente alimentares e Escherichia coli também responsável por infecções alimentares e cutâneas.
Das 4 concentrações das nanoemulsões testadas nessa análise, para todos os microrganismos, não houve diferença entre a concentração inibitória e bactericida. Em todas as análises a menor alíquota (25µL) conseguiu inibir 100% do crescimento das bactérias, o que indica que a concentração mínima inibitória é ainda menor que as concentrações testadas. Esse dado é importante, pois mostra que mesmo se a emulsão for diluída quatro vezes, continuará apresentando ação bactericida, frente as bactérias gram-negativas Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes e gram-negativas Escherichia coli e Salmonella entérica, da mesma forma que a nanoemulsão sem diluição.
Substâncias com atividade antimicrobiana são importante para tratamento de feridas visto que leitos abertos de feridas podem se tornar um ambiente propício para o desenvolvimento de microrganismos e uma porta de entrada para o sistema circulatório. É necessário haver um equilíbrio da carga bacteriana no leito da ferida para que todo o processo de cicatrização se desenvolva e culmine no encerramento da ferida. Além de dificultar o processo de cicatrização, alguns microrganismos podem causar dor, umas das bactérias causadores de dor é Staphylococcus aureus, estudos mostram que 70% das infecções em úlceras são causadas por essa bactéria (TADDEUCCI et al., 2004).
Para feridas crónicas infetadas, os indicadores mais específicos de colonização crítica (quando o crescimento microbiano atinge um nível onde as defesas do hospedeiro não conseguem mais combater a proliferação) são: dor aumentada; níveis de exsudado aumentado; descoloração do tecido de granulação; odor fétido e deterioração da ferida (CUTTING, 2005; GARDNER et al., 2001).