Migração celular durante a colite induzida pelo DSS

Com o objetivo de estudar as populações celulares de linhagem mielóide nas fases aguda e crônica da colite induzida pelo DSS, realizou-se as medidas das atividades enzimáticas para MPO, EPO e NAG, para determinar indiretamente as populações de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos, respectivamente. Como demonstrado na figura 10 A, cinco dias após o início do tratamento com DSS 2 %, a atividade da MPO aumentou, de forma significativa, em comparação ao grupo controle. Após a primeira fase de recuperação, os níveis de MPO não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo controle. Entretanto, ao final do segundo ciclo de DSS, ocorreu aumento marcante na atividade da MPO, a qual diferiu significativamente do grupo controle e dos resultados obtidos do primeiro ciclo de DSS, indicando agravação da migração de neutrófilos para o tecido colônico. Ademais, ao final de 30 dias, os cólons dos animais com colite experimental apresentaram aumento significativo da atividade da MPO em relação ao grupo controle, sugerindo a cronificação da inflamação intestinal ou possíveis falhas no processo de resolução da inflamação.

De modo semelhante, foi observado aumento significativo para a atividade da enzima EPO ao final do primeiro e segundo ciclo de DSS, quando comparado ao grupo controle, evidenciando a participação de eosinófilos principalmente nas fases de surto (ciclo 1 e 2) da colite experimental induzida pelo DSS (Figura 10 B). Por outro lado, nas fases de recuperação (5-15 e 20-30 dias), não foi observado nenhuma diferença importante nos níveis teciduais da enzima EPO. Interessantemente, e de forma diferente dos resultados observados para as atividades das enzimas MPO e EPO, não foi verificado aumento na atividade da NAG após o primeiro e segundo ciclos de DSS, sendo este aumento observado apenas 30 dias após o início do tratamento com DSS (segunda fase de recuperação). Esse dado sugere que células mononucleares parecem ter participação significativa principalmente em estágios crônicos da colite induzida pelo DSS (Figura 10 C).

Figura 10. Atividade das enzimas MPO, EPO e NAG nas fases aguda e crônica da colite induzida pelo DSS. A infiltração de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos para o tecido do

cólon foram indiretamente avaliadas pela medida das atividades das enzimas MPO, EPO e NAG, respectivamente. (A) A atividade da MPO apresentou aumento após o primeiro e segundo ciclo de DSS, o qual continuou significativo ao final de 30 dias de protocolo experimental. (B) A enzima EPO apresentou níveis elevados, ao final de cinco (5) e vinte (20) dias da colite induzida pelo DSS, a qual caracteriza os pontos finais de dois ciclos de DSS. (C) A atividade da NAG apresentou aumento apenas 30 dias após o início do tratamento com DSS. Os resultados representam a média de 6-10 animais por grupo e as linhas verticais o erro padrão da média. # p<0,05 quando comparado ao controle, * p<0,05 quando comparado aos grupos selecionados (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Student Newman- Keuls).

Além da medida indireta de migração de células de linhagem mielóide, foi realizada a quantificação de linfócitos T CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo, nos linfonodos mesentéricos dos animais com colite induzida pelo DSS. Os animais foram sacrificados nos dias 5, 15, 20 ou 30, como descrito anteriormente, e tiveram os linfonodos mesentéricos removidos para análise. A figura 11 A apresenta a população de linfócitos T CD4+ e CD8+ nos diferentes grupos experimentais. Nota-se

que apenas 30 dias após o início do protocolo experimental, foi possível verificar aumento significativo da população de linfócitos T CD4+ e CD8+. A quantificação desses resultados demonstrou que de fato, ocorreu aumento de células T CD4+ e CD8+ ao final da segunda fase de recuperação (30º dia), sugerindo envolvimento dessas células inflamatórias nas fases tardias do modelo de colite induzida pelo DSS (Figura 11 B e C).

Além disso, a fim de verificar a população de linfócitos T CD4+ e CD8+ ativados, ou seja, com co-expressão do marcador celular CD25, foi realizada a dupla marcação para células T CD4+CD25+ e CD8+CD25+, entre os diferentes grupos experimentais como exposto anteriormente. Como pode ser observado na figura 12 A e B, a população de linfócitos T CD4+ encontra-se ativada significativamente apenas 30 dias após o início da indução da colite, ou seja, quando a população dessas células encontra-se elevada no linfonodo mesentérico.

Diferentemente dos resultados encontrados na quantificação de linfócitos T CD4+CD25+, a marcação de linfócitos T CD8+CD25+ demonstrou que, mesmo ocorrendo aumento de células T CD8+ 30 dias após o início da indução da colite (Figura 11 C), essas células não se encontram ativadas (Figura 13 A e B). A quantificação da população celular demonstrou que os linfócitos T CD8+CD25+ não apresentaram diferença significativa entre os grupos experimentais (Figura 13 B).

Figura 11. População de linfócitos T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico de camundongos durante a colite experimental induzida pelo DSS. Os animais tiveram o

linfonodo mesentérico removido nos períodos de 5, 15, 20 e 30 dias, de acordo com o protocolo experimental exposto na seção de materiais e métodos e figura 10. (A) Apresentação da população de linfócitos T CD4+ (eixo y) e T CD8+ (eixo x). (B) Quantificação dos linfócitos T CD4+ no diferentes períodos de tempo, onde pode ser observado aumento significativo desta população celular 30 dias após o início do protocolo experimental. (C) Quantificação dos linfócitos T CD8+ no diferentes períodos de tempo, onde pode ser observado aumento significativo desta população celular 30 dias após o início do protocolo experimental. Os resultados representam a média de 4-6 animais por grupo e as linhas verticais o erro padrão da média. # p<0,05 quando comparado ao controle (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Student Newman-Keuls).

Figura 12. População de linfócitos T CD4+CD25+ no linfonodo mesentérico de camundongos durante a colite experimental induzida pelo DSS. Os animais tiveram o

linfonodo mesentérico removido nos períodos de 5, 15, 20 e 30 dias, de acordo com o protocolo experimental exposto na seção de materiais e métodos e figura 10. (A) Apresentação da população de linfócitos T CD4+ (eixo y) e CD25+ (eixo x). (B) Quantificação dos linfócitos T CD4+CD25+ no diferentes períodos de tempo, onde pode ser observado aumento significativo da ativação dos linfócitos T CD4+ 30 dias após o início do protocolo experimental. Os resultados representam a média de 4-6 animais por grupo e as linhas verticais o erro padrão da média. # p<0,05 quando comparado ao controle (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Student Newman-Keuls).

Figura 13. População de linfócitos T CD8+CD25+ no linfonodo mesentérico de camundongos durante a colite experimental induzida pelo DSS. Os animais tiveram o

linfonodo mesentérico removido nos períodos de 5, 15, 20 e 30 dias, de acordo com o protocolo experimental exposto na seção de materiais e métodos e figura 10. (A) Apresentação da população de linfócitos T CD8+ (eixo y) e CD25+ (eixo x). (B) Quantificação dos linfócitos T CD8+CD25+ no diferentes períodos de tempo, onde não foi observado aumento significativo da ativação dos linfócitos T CD8+ entre nenhum dos grupos avaliados. Os resultados representam a média de 4-6 animais por grupo e as linhas verticais o erro padrão da média. # p<0,05 quando comparado ao controle (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Student Newman-Keuls).

4.1.4 Produção de citocinas durante as fases aguda e crônica da