L- Lis ou HO-Lis Acil azida
3. Preparação das membranas
3.6. Mineralização in vivo
A calcificação in vivo foi avaliada por implantação das amostras na parede abdominal, em ratos, durante 30 e 60 dias. Foram estudadas 24 amostras de Ga, 12 amostras de DPPA, 9 amostras de Aga 0,6%, 5 amostras de Aga 1% para 1 mês e 7 amostras de Aga 1% para 2 meses.
Estes ensaios in vivo foram realizados por Eduardo Jorge Herrero na Clínica Puerta de Hierro, Madrid (Espanha) e os resultados foram gentilmente enviados para comparação e fundamentação dos resultados obtidos neste trabalho.
4.1. Grau de inchamento
Os resultados do grau de inchamento encontram-se apresentados na figura 26.
A reticulação reduz o grau de equilíbrio de inchamento do tecido colagénico [8], como
é o caso das membranas de pericárdio bovino.
Grau de inchamento
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Aga 1% Aga 0,6% Ga DPPA Nat
Tecidos (P es o m ol ha do -P es o se co )/P es o se co
Figura 26 - Resultados do Grau de inchamento.
Uma comparação entre o grau de inchamento de todos os tecidos tratados revelou que o DPPA e o Ga apresentaram os menores valores (1,49 e 1,47) respectivamente, enquanto que o Aga 1% apresentou o maior valor (1,84) seguido do Aga 0,6% (1,70). Sendo os agentes de reticulação mais efectivos o Ga e o DPPA, ou seja estes agentes revelaram um maior grau de reticulação.
4.2. Degradação enzimática
Digestão Pronase 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 tempo (horas) pe so r es id ua l m éd io (% ) Ga Aga0,6% Nat Aga 1% DPPA
Figura 27 - Resultados da degradação enzimática.
Nestes ensaios foi determinada a susceptibilidade à degradação com pronase das membranas tratadas e não tratadas.
Durante as experiências, in vitro, de digestão, as membranas de pericárdio foram expostas à pronase em diferentes períodos de tempo e verificou-se que o tecido não tratado foi significativamente mais susceptível ao ataque enzimático do que o tecido tratado, sendo o AGA 1% o mais resistente. Ao fim de 96 horas o tecido tratado com Aga1% apresentou 38% de degradação, enquanto que o tecido não tratado (Nat) apresentou 62% de degradação, no mesmo período de tempo. Ao fim das 120 horas o tecido não tratado apresentou uma solubilização de 69%, o Ga e o DPPA apresentaram uma degradação semelhamte 47% e de 47,3%, respectivamente, e o Aga 0,6% e 1% tiveram solubilizações de 32,4% e 39% respectivamente. Em todos os intervalos de tempo até às 96 horas, e pela observação do gráfico da figura 27, podemos concluir que as membranes de Aga 1% foram as menos degradadas pela pronase, seguido da DPPA, depois da Aga 0,6% e da Ga, sendo a Nat a mais susceptível ao ataque pela pronase.
4.3. Potencial Zeta
Potential Zeta (mV) -5,6 -4,6 -3,6 -2,6 -1,6 -0,6
GA Nat DPPA Aga 0,6% Aga 1%
Tecidos P Z ( m V )
Figura 28 - Resultados do Potencial Zeta.
Várias teorias têm sido propostas para explicar a formação de hidroxiapatite (neste caso concreto o que está em estudo é a calcificação de biopróteses). Uma das hipóteses para a formação de fosfato de cálcio é a carga superficial do material. Esta superfície com carga electricamente negativa pode ser capaz de atrair os catiões Ca2+ e consequentemente os aniões
HPO42- e OH- dissolvidos em solução (neste caso o sangue).
O potencial zeta tem sido tradicionalmente medido por electroforese, porque todas as partículas inorgânicas assumem uma carga quando dispersas em água. Através da inserção de eléctrodos na suspensão e aplicando uma voltagem DC, as partículas com carga são atraídas para o ânodo (eléctrodo positivo). A velocidade das partículas depende da carga superficial da partícula ou potencial zeta e da voltagem aplicada [6].
O objectivo da utilização desta técnica foi a determinação da carga superficial eléctrica do tecido de pericárdio bovino não tratado e tratado com agentes de reticulação.
Os resultados obtidos revelam uma carga eléctrica substancialmente mais negativa para o caso do Ga comparativamente os outros tecidos. O tecido tratado com Ga possui a carga mais negativa (-4,873 mV) enquanto o Nat e o DPPA exibiram as menos negativas (-1,946 mV e - 1,947 mV respectivamente. O tecido tratado com Aga 0,6 e 1% apresentaram potenciais zeta de - 2,216 mV e -2,207 mV. Podemos concluir que a reticulação com DPPA confere o valor de
potencial zeta menos negativo e que as membranas tratadas com Aga 0,6% ou 1% dão origem a valores ligeiramente mais negativos do que com DPPA.
4.4. Difusão
Os resultados relativos à difusão de cálcio através da membrana estão representados na figura 29.
Coeficiente de Permeabilidade mm2/min
( Lei de Fick) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
GA Nat DPPA Aga 0,6% Aga1%
Tecidos C oe fic ie nt e de p er m ea bi lid ad e (m m 2 /m in )
Figura 29 - Resultados do coeficiente de permeabilidade.
Após 2 horas de difusão, a quantidade crescente de cálcio que se difundiu através do tecido foi determinada.
O coeficiente de difusão mais elevado verificou-se para o tecido tratado com Ga (0,125 mm2/min), seguido do Nat com (0,086 mm2/min) e do Aga 1% com (0,079 mm2/min), enquanto que os valores mais baixos foram para o Aga 0,6% (0,059 mm2/min) e para o DPPA (0,062 mm2/min). Estes resultados estão em concordância com os valores de potencial zeta, pois os menores valores de coeficiente de permeabilidade são para o DPPA e Aga0,6% e 1%.
4.5. Microscopia óptica
A visualização de cortes transversais das membranas permitiu fazer uma análise qualitativa à permeabilidade dos tecidos.
Figura 30 - Nat, camada interna, corte transversal, ampliação 10×. Ver se aparece a
escala na imagem
Figura 32 - Aga 0,6%, camada interna, corte transversal, ampliação 10×.
Figura 34 - DPPA, camada interna, corte transversal, ampliação 10×.
As imagens obtidas do tecido tratado com diferentes tratamentos encontram-se apresentados nas figuras 30, 31, 32, 33 e 34, e dizem respeito a cortes transversais de uma camada interna da membrana, com uma ampliação de 10×.
Estes resultados mostram um maior desmembramento das fibrilas e colagénio em algumas partes da superfície do tecido, no caso do tecido tratado com DPPA (figura 34) e no caso do tecido não tratado (Nat) (figura30).
As membranas tratadas com GA e Aga 0,6% e 1% apresentaram uma estrutura mais compacta das fibrilas de colagénio, sendo por isso menos permeáveis (figuras 31, 32 e 33).
Embora o tecido tratado com DPPA seja relativamente mais permeável em algumas áreas, apresentou um coeficiente de difusão muito baixo, o que sugere que o coeficiente de permeabilidade não está relacionado com a permeabilidade do tecido mas com outros factores, possivelmente com a carga superficial eléctrica do tecido.
É aceitável dizer-se que os tratamentos dos tecidos de pericárdio bovino tratados com Aga 0,6%, 1% e DPPA possam ser mais favoráveis à prevenção da calcificação do que com Ga, pois para além de terem apresentado valores de potencial zeta mais baixos, também apresentaram coeficientes de difusão mais baixos. O tecido tratado com Ga apresentou os maiores valores de potencial zeta assim como de coeficiente de difusão sendo a permeabilidade deste tecido também baixa quando comparada com o Nat e o DPPA.
Isto pode ser uma razão para a calcificação que se verifica com a reticulação com o glutaraldeído, podendo significar que o tratamento com Ga interage com os iões cálcio por atracção de cargas eléctricas.
4.6. Mineralização in vivo
Os resultados in vivo disponibilizados por Jorge Herrero encontram-se na figura 35.
Calcificação em pericárdio bovino
0 20 40 60 80 100 120 140 160 G a D P P A A ga 0 ,6 % A ga 1 % Ga D P P A A ga 0 ,6 % A ga 1 % 30 dias 60 dias Tecido tratado C al ci fic aç ão m g C a 2+ /g d e pe so se co d e te ci do
Figura 35 - Resultados da mineralização in vivo.
A calcificação é a principal causa das falhas das válvulas cardíacas, e esta conclusão foi tirada a partir de experiências em modelos circulatórios e a nível da subderme [62] e [63].
A viabilidade deste método para estudar a calcificação de tecido de pericárdio bovino com diferentes agentes de reticulação é um método para avaliar a propensão destas membranas para calcificarem.
Existem inúmeras limitações do modelo in vitro comparativamente ao modelo in vivo em condições de implantação subcutâneas. Contudo, corpos em hemostase geram quantidades relativamente ilimitadas de fosfato de cálcio a nível da subderme [10].
Nestes estudos in vivo, os tecidos tratados com Aga 0,6%, Aga 1% parecem retardar o significativamente o transporte de iões cálcio através da membrana.
Em conclusão, este estudo sugere a possibilidade da utilização de Aga 0,6% e 1% como agentes de reticulação do pericárdio bovino e o seu efeito na inibição da calcificação, sendo o Aga 1% o melhora agente, por não ser tão susceptível ao ataque enzimático.
Embora o papel exacto do processo de anticalcificação seja ainda obscura, com este trabalho coloca-se a hipótese de que a carga superficial eléctrica to tecido possa ter uma forte influência na atracção dos iões Ca2+.
Como hipótese, o tratamento com Aga em tecido de pericárdio bovino talvez modifique a carga nos potenciais locais de ligação com o cálcio, tornando a carga electricamente menos negativa.
O tratamento com DPPA talvez seja menos eficaz para algumas aplicações, nomeadamente em aplicações que requeiram maior actividade mecânica, já que o DPPA parece ser muito mais permeável e também mais frágil do que o tecido tratado com Aga e GA.
Quanto ao ataque enzimático também se pode concluir que o tratamento com Aga1% é o que sofre menor degradação pela pronase.
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