Misturas clonais

de Genótipos

Misturas clonais

Animais INT Animais TNC

Tecidos Tecidos

Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon

19+32 *OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11

+ MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11

19+32 Gamba cl1 + MAS cl1 - - - Gamba cl1 - Gamba cl1

19+32 **OPS21 cl11 + IVV cl4 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11

19+39 *OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11

+ SO3 cl5 OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 +SO3 cl5 OPS21cl11 +SO3 cl5 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11

20+39 *Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1

+SO3 cl5 Cuica cl1 +SO3 cl5 + SO3 cl5 Cuica cl1 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 +SO3 cl5 +SO3 cl5 Cuicacl1 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1

20+39 Cuica cl1 + Bug2148 cl1 Cuica cl1

+ Bug2148 cl1 - + Bug2148 cl1 Cuica cl1 Bug2148 cl1

39+32 **SO3 cl5 + MAS cl1 -

39+32 SO3 cl5 + IVV cl4 - - - ind ind

Figueiredo, L.M. Resultados

85

Não foi observada a presença de ambos os clones do T. cruzi em nenhum dos isolados (0/46) obtidos de animais tratados com BZ e considerados curados (TC). Entretanto, a caracterização dos clones presentes em tecidos de animais não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones em 73% dos isolados (17/23) -

Tabela X. A presença de ambos os clones só não foi observada nos tecidos de animais

infectados com as misturas Gamba cl1 + MAS cl1, OPS21 cl11 + IVV cl4 e Bug2148 cl1 + MAS cl1.

Um animal infectado com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 (ambos 100% susceptíveis ao BZ) foi considerado curado (TC) pelo critério de cura empregado. A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos desse animal demonstrou a presença do OPS21 cl11, pertencente ao genótipo 19, semelhante ao obtido nos tecidos de animais tratados não curados (TNC). Entretanto, o perfil de LSSP- PCR obtido na caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais não tratados (INT) revelou a presença de ambos os clones (Tabela X).

A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de um animal infectado com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 (40% susceptível + 100% susceptível ao BZ) revelou a presença do clone Gamba cl1, ou seja, o mais resistente ao tratamento (Tabela IX). Resultado semelhante foi obtido na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais tratados não curados (TNC) e infectados não tratados (INT) – Tabela X. O perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 está representado na Figura 19.

Figueiredo, L.M. Resultados

86

Figura 19: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos de isolados de animais infectados com diferentes combinações genotípicas do Trypanosoma cruzi e que foram considerados curados pelo critério de cura clássico (ESF, hemocultura, ELISA, AATV e PCR em eluato de sangue) e apresentaram PCR em tecido positiva. TC: isolados de animais tratados com benzonidazol e considerados curados.

A: Combinação 19+32: INT1, TC1 e TC2: Gamba cl1 + MAS cl1; INT2- INT4 e TC3- TC6: OPS21 cl11 + IVV cl4;

B: Combinação 39+32: TC1-TC6: SO3 cl5 + MAS cl1; TC7-TC10: SO3 cl5 + IVV cl4. INT: isolados de animais não tratados com benzonidazol.

Os dois animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + IVV cl4 (100% susceptível + 40% susceptível ao BZ) e tratados foram considerados curados (TC) e a caracterização do clone remanescente nos tecidos positivos na PCR revelou a presença do clone OPS21 cl11, ou seja, do clone mais susceptível ao BZ (Tabela X), semelhante ao observado nos animais não tratados (INT). O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com essa mistura está representado na Figura 19.

A caracterização por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de um animal infectado com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 (ambos 100% susceptíveis ao tratamento) demonstrou a presença do clone OPS21 cl11, pertencente ao genótipo 19

(Tabela IX). Resultado semelhante foi obtido nos tecidos de animais tratados e não

curados (TNC). Por outro lado, nos tecidos de animais infectados não tratados (INT) foi observada a presença de ambos os clones (Tabela X - continuação).

Um animal infectado com a mistura Cuica cl1 + SO3 cl5 (0% susceptível + 100+ susceptível ao tratamento) foi considerado curado (TC) e a caracterização do clone remanescente nos tecidos desse animal demonstrou a presença do clone Cuica cl1, mais

G a m b a c l1 T C 3 IV V c l4 A O P S 2 1 c l1 1 T C 6 IN T 3 T C 3 T C 1 IN T 1 T C 2 IN T 2 IN T 4 T C 4 T C 5 IV V c l4 M A S c l1 B T C 1 T C 2 T C 4 T C 5 T C 6 T C 7 T C 8 T C 9 T C 1 0 M A S c l1 S O 3 c l5

Figueiredo, L.M. Resultados

87

resistente da mistura, semelhante ao observado nos animais tratados não curados (TNC) – Tabela X. Entretanto, o perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones (Tabela X - continuação).

A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos foi realizada em um animal infectado com a mistura Cuica cl1 + Bug2148 cl1 (ambos 0% susceptíveis ao BZ) e considerado curado (TC) e revelou a presença do clone Bug2148 cl1 (Tabela X). O mesmo clone foi encontrado nos tecidos de animais TNC (Tabela X – continuação). Entretanto, a caracterização dos clones nos tecidos de animais infectados não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones (Tabela X- continuação).

A caracterização por LSSP-PCR de clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura SO3 cl5 + MAS cl1 (ambos 100% susceptíveis ao BZ) e considerados curados (TC) revelou um perfil genético distinto dos clones inoculados

(Tabela X), semelhante ao observado nos tecidos de animais tratados não curados

(TNC) – Tabela X - continuação. Não foi possível fazer a caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais não tratados (INT) – Tabela X - continuação.

A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura SO3 cl5 + IVV cl4 (100% susceptível + 40% susceptível ao BZ) e considerados curados (TC) revelou um perfil genético distinto dos dois clones utilizados na inoculação (Tabela X). O mesmo perfil indeterminado foi encontrado nos tecidos de animais TNC (Tabela X – continuação). Não foi possível identificar os clones presentes nos tecidos de animais INT (Tabela X – continuação).

O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones remanescentes nos tecidos de animais TC e infectados com as misturas SO3 cl5 + MAS cl1 e SO3 cl5 + IVV cl4 está representado na Figura 19.

Os dois animais infectados com a mistura Bug2148 cl1 + MAS cl (0% susceptível + 100% susceptível ao BZ) foram considerados curados (TC) pelo critério de cura utilizado. A caracterização por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos desses animais demonstrou a presença do clone Bug2148 cl1, ou seja, do clone mais

Figueiredo, L.M. Resultados

88

resistente ao tratamento (Tabela X). Resultado semelhante foi obtido nos tecidos de animais não tratados (INT) – Tabela X - continuação.

Figueiredo, L.M. Discussão

90

7.1) Avaliação da positividade da PCR em camundongos com infecção monoclonal pelos genótipos principais de T. cruzi não tratados e tratados com o benzonidazol

A determinação dos fatores envolvidos no potencial patogênico das diferentes populações do T. cruzi tem sido objeto importante de investigação e interesse para os estudiosos da doença de Chagas (Tarleton, 2000; Macedo et al., 2004; Manoel-Caetano & Silva, 2007). Embora grandes avanços já tenham sido alcançados em relação aos mecanismos envolvidos na patogênese da doença, várias lacunas ainda permanecem para serem elucidadas. Nesse contexto, a variabilidade genética do T. cruzi é apontada como um dos principais fatores envolvidos na patogênese da doença de Chagas, uma vez que diferentes populações do parasito podem apresentar diferentes tropismos teciduais (Bice & Zeledon, 1970; Melo & Brener, 1978; Andrade et al., 1985) e conseqüentemente ocasionarem diferentes formas clínicas da doença (Macedo & Pena, 1998). A prevalência, a distribuição geográfica das formas clínicas e a morbidade da doença de Chagas variam dependendo da área geográfica em estudo (Dias, 1992). Por exemplo, em países como a Venezuela e da América Central, a prevalência de megaesôfago é extremamente baixa ou praticamente ausente (Brener, 1987). No Brasil, cerca de 50 a 60% dos pacientes chagásicos crônicos apresentam a forma indeterminada da doença, 20 a 30% apresentam a forma cardíaca, 8 a 10% apresentam a forma digestiva e cerca de 2% apresentam as formas clínicas combinadas. Entretanto, a ocorrência da forma digestiva (megaesôfago e/ou megacólon) parece ser predominante na região central (Luquetti et al., 1986; Dias, 1992).

Apesar de diversos trabalhos tentarem estabelecer, por diferentes metodologias, correlação entre esse polimorfismo genético do parasito e suas propriedades biológicas e clínicas, poucos conseguiram demonstrar tal associação (Apt et al, 1987; Brenière et

al., 1989; Munoz et al., 1994; Montamat et al., 1996; Vago et al., 2000; Baptista et al.,

2006; D’Avila et al., 2006; Lages-Silva et al., 2006; D´Avila et al., 2009). Provavelmente, a dificuldade de estabelecer essa correlação é decorrente do fato deste ser um processo multifatorial em que tanto fatores do parasito quanto do hospedeiro estão envolvidos (revisado por Macedo & Pena, 1998).

Sabe-se que as lesões e conseqüentemente as alterações clínicas observadas na fase crônica da doença de Chagas, são por natureza de evolução tardia e progressiva, sendo o parasitismo muito escasso e muitas vezes difícil de ser identificado pelos

Figueiredo, L.M. Discussão

91

exames histopatológicos convencionais (Prata, 2001). Assim, diferentes metodologias moleculares têm sido desenvolvidas e empregadas com a finalidade de detectar o parasito diretamente de tecidos do hospedeiro infectado. Nesse sentido, trabalhos empregando a PCR, com o objetivo de analisar tecidos de animais experimentalmente infectados pelo T. cruzi (Zhang & Tarleton, 1999; Andrade et al, 1999; Cruz, 2002; Vera-Cruz et al., 2003; Andersson, 2004; Veloso, 2007; Martins, 2008) e de humanos (Vago et al., 2000; Lages-Silva et al., 2002; Freitas et al., 2005) têm sido de grande importância para o estudo do tropismo tecidual de diferentes populações deste parasito bem como para o entendimento da patogenia da doença. A utilização da técnica de PCR em detectar o kDNA do T. cruzi em tecidos do hospedeiro especialmente quando estes apresentam baixa quantidade de parasito, ressalta o seu valor em relação à sua elevada sensibilidade e especificidade (Jones et al., 1993; Añez et al., 1999; Cruz, 2002), permitindo realizar, além do diagnóstico da infecção o estudo do tropismo tecidual (Andrade et al., 2000; Vago et al., 2000; Cruz, 2002; Vera-Cruz et al., 2003; Elias et

al., 2003; Andersson, 2004; Veloso et al., 2008).

Nesse sentido, um dos objetivos desse trabalho foi avaliar pela técnica de PCR o tropismo tecidual de clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais (19, 20, 39 e 32) na fase crônica da infecção e verificar se há correlação entre essa propriedade e a genética do parasito. Para isso, foram utilizados camundongos BALB/c experimentalmente infectados nos quais foi avaliada a positividade para o kDNA do T. cruzi em seis tecidos (coração, músculo, baço, bexiga, cérebro e cólon). Além disso, os resultados obtidos desses animais (INT) foram comparados com aqueles encontrados em animais infectados nas mesmas condições tratados (IT) com benzonidazol (BZ).

Os resultados obtidos demonstraram que todos os tecidos analisados de animais INT foram positivos na PCR, sendo as maiores taxas de positividade observadas no coração (100%), músculo esquelético (81%), cólon (75%) e baço (69%). Quando considerados por genótipos, foi observado que os animais infectados com clones pertencentes aos genótipos 19 e 20 (T. cruzi I) apresentaram as maiores taxas de positividade global em todos os tecidos, ao contrário dos animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 32 (T. cruzi II) que apresentaram as menores taxas. Os camundongos infectados com clones pertencentes ao genótipo 39 (T. cruzi) apresentaram taxas de positividade global na PCR intermediárias. Esses resultados são

Figueiredo, L.M. Discussão

92

concordantes com outros estudos que avaliaram o parasitismo sangüíneo desses clones tanto por meio da hemocultura como do exame a fresco, verificando que em geral clones dos genótipos 19/20 são mais virulentos e clones do genótipo 32 menos virulentos, enquanto os pertencentes ao genótipo 39 apresentam propriedades intermediárias entre esses grupos (Toledo et al., 2002; Toledo et al., 2003; Martins et

al., 2006).

Alguns autores também verificaram por meio da histopatologia convencional a presença de clones pertencentes aos genótipos principais em tecidos de animais na fase aguda (Diego et al., 1998; Toledo et al., 2002; dos Santos 2007), mas escassez ou ausência de parasitismo na fase crônica da infecção. Toledo et al., (2002) demonstraram que apenas clones pertencentes ao genótipo 39 apresentaram parasitismo tecidual nessa fase da infecção. Por outro lado, este trabalho demonstrou elevadas taxas de positividade na PCR em tecidos de animais infectados com todos os genótipos, variando de 58 a 75% coletados na fase crônica da infecção. Isto sugere que os resultados histopatológicos não podem ser extrapolados e/ou diretamente comparados com os obtidos pela PCR realizada em tecido para todos os genótipos. Essa diferença nos resultados provavelmente se deve à maior sensibilidade apresentada pela técnica de PCR, como demonstrado por Miyamoto et al., (2006) avaliando amostras de sangue de animais infectados com esses grupos genéticos, detectando 100% de positividade independente da fase infecção e do genótipo.

De acordo com o modelo de estrutura e evolução clonal proposto por Tibayrenc & Ayala, (1988) uma boa correlação entre propriedades biológicas e a genética do parasito seria esperada. Desse modo, clones pertencentes aos genótipos 19 e 20, filogeneticamente mais próximos, apresentariam propriedades biológicas ou clínicas mais semelhantes do que os genótipos 39 e 32, filogeneticamente mais próximos entre si e distantes dos genótipos 19 e 20. Essa hipótese foi confirmada em diversos trabalhos tanto em cultura acelular (Laurent et al, 1997) como celular (Revollo et al., 1998), em vetores (Lana et al., 1998) e em camundongos (Toledo et al, 2002; Martins et al., 2006). No presente trabalho não foram observadas claramente diferenças quanto ao tropismo tecidual do kDNA dos clones pertencentes aos quatro genótipos principais. Entretanto, clones dos genótipos 19 e 20 foram os únicos que apresentaram durante a fase crônica, positividade na PCR no cérebro e maior positividade na bexiga. Esses resultados

Figueiredo, L.M. Discussão

93

corroboram outros estudos que correlacionam divergências filogenéticas, alterações histopatológicas e tropismo tecidual associando o genótipo 20 (T. cruzi I) à invasão do sistema nervoso central. Diego et al., (1998) verificaram que apenas camundongos Swiss infectados por clones do genótipo 20 apresentaram comprometimento encefálico e presença destes parasitos a áreas de inflamação e necrose. Por outro lado, dos Santos, (2007) observou um processo inflamatório mais intenso no cérebro de camundongos infectados com clones pertencentes ao T. cruzi II, enquanto Toledo et al., (2002) não observaram parasitismo tecidual nesse tecido em animais infectados com qualquer um desses genótipos.

Quando foram comparados os grupos de animais INT e IT com BZ, foi observada maior redução na positividade da PCR no coração e no baço dos animais tratados. Entretanto, nestes animais a bexiga apresentou taxa de positividade para o kDNA do T. cruzi superior ao grupo de animais INT. Esse resultado curioso pode ser justificado por alguns dados encontrados na literatura que demonstram a presença do T. cruzi na bexiga, bem como aumento de tamanho e alteração funcional nesse órgão (Scremin et al., 1999; Cabrine-Santos et al., 2003; Boczko et al., 2005). Além disso, já está demonstrado que a urina humana estimula o crescimento “in vitro” de alguns parasitos como T. cruzi (Ferreira et al., 2007), T. rangeli (Ferreira et al., 2007) e Leishmania (Iqbal et al., 2006), bem como em triatomíneos vetores (Schaub et al., 1988; Carvalho-Moreira et al., 2003) o que poderia explicar a sua permanência nesse tecido. Essa maior positividade da PCR na bexiga ocorreu nos animais submetidos ao tratamento com BZ. Esses resultados corroboram os resultados encontrados por Martins

et al., (2007) que ao avaliarem a positividade da PCR nos animais com infecção mista

pelos genótipos principais durante a FA e FC, verificaram alta positividade para o kDNA do T. cruzi na bexiga e apenas na FC, quando os tecidos foram coletados longo período após o término do tratamento, sugerindo então a presença efetiva do parasito nesse tecido e não apenas de seu DNA residual. Estudando esses mesmos genótipos, Toledo et al., (2004) demonstraram que o tratamento com BZ pode exercer efeito negativo no curso da infecção em animais infectados com o genótipo 39, nos quais se constatou aumento no parasitismo tecidual e processo inflamatório em diferentes tecidos dos animais tratados.

Figueiredo, L.M. Discussão

94

Quanto ao perfil de susceptibilidade a fármacos, diversos trabalhos “in vivo” e “in vitro” têm demonstrado que as cepas pertencentes ao grupo T. cruzi I apresentam uma tendência maior de resistência ao BZ, enquanto as cepas do grupo T. cruzi II são em geral mais susceptíveis a este fármaco e outros como o Nifurtimox e Itraconazol (Andrade et al., 1985a; Andrade & Magalhães, 1997, Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2003; Coronado et al., 2006), embora variações intra-grupos sejam observadas. Por exemplo, no genótipo 39 foram encontrados clones totalmente sensíveis ao lado de clones totalmente resistentes ao BZ e nos genótipos 19 e 32 clones parcialmente susceptíveis e totalmente susceptíveis ao BZ (Toledo et al., 2003).

Esse padrão de susceptibilidade foi indiretamente confirmado nesse trabalho por meio do encontro de positividade para o kDNA do T. cruzi em tecidos, quando se verificou que os animais infectados com clones pertencentes aos genótipos 19 e 20 (T. cruzi I) e submetidos ao tratamento com BZ apresentaram uma menor redução na positividade da PCR na maioria dos tecidos avaliados em comparação com os animais infectados com os genótipos 39 (T. cruzi) e 32 (T. cruzi II), respectivamente. Estes dados são compatíveis com o observado por Toledo et al., (2003) em camundongos BALB/c infectados com estes mesmos genótipos e tratados com BZ onde a resistência a este fármaco seguiu esta mesma tendência (20 > 19 > 39 > 32).

7.2) Tropismo tecidual de clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais em camundongos com infecção mista e monoclonal não tratados e tratados com benzonidazol e identificação nos tecidos que apresentaram alteração na positividade da PCR

Ainda permanece inexplicável porque diferentes pacientes desenvolvem as formas cardíacas, digestivas, cardio-digestivas ou a forma indeterminada da doença de Chagas, mas acredita-se que tanto a variabilidade genética do parasito quanto do hospedeiro são importantes para estabelecer o curso clínico da doença (Russo et al., 1996; Vago et al., 1996b, 2000; Macedo et al., 1998, 2002; Andrade et al., 1999, 2002; Andersson et al., 2003; Freitas et al., 2009). No entanto, a associação entre a genética

Figueiredo, L.M. Discussão

95

do parasito isolado dos pacientes e as formas clínicas da doença neles observadas não puderam ainda ser estabelecidas.

Indivíduos em áreas endêmicas podem ser infectados por diversos triatomíneos, que por sua vez, podem se alimentar em diversos hospedeiros vertebrados infectados, o que propiciaria a formação nestes de populações multiclonais. Conseqüentemente, uma cepa em particular pode apresentar uma coleção de clones que poderiam competir entre si na adaptação e sobrevivência no hospedeiro. Além disso, o polimorfismo biológico do parasito representado por clones distintos em uma mesma cepa poderia resultar em tropismos teciduais distintos, o que acarretaria diferentes formas clínicas no hospedeiro infectado. É, portanto razoável supor que estudar a associação entre a genética dos parasitos e o desenvolvimento da infecção em hospedeiros com infecções mistas ou policlonais será ainda muito mais complexo.

Vários autores já demonstraram que em infecções mistas experimentais ocorrem interações entre as subpopulações da mistura, resultando em importantes alterações nas propriedades biológicas do parasito (Deane et al., 1984a; Pinto et al., 1998; Lana et al., 2000; Martins et al., 2006, 2007; Araújo et al., 2007). Desse modo, infecções mistas podem apresentar importantes conseqüências na dinâmica de transmissão do parasito, resposta à quimioterapia e, inclusive, em sua patologia, o que poderia ocasionar as diferentes manifestações clínicas da doença.

Nesse contexto, este estudo comparou o tropismo tecidual do kDNA de clones de T. cruzi pela técnica de PCR em camundongos BALB/c com infecção monoclonal e mista pelos genótipos principais, a fim de verificar se nessas infecções ocorrem também alteração nessa propriedade biológica.

Os resultados obtidos nesse trabalho demonstraram alteração no tropismo tecidual do kDNA dos clones na maioria das misturas estudadas, exceto Cuica cl1 + SO3 cl5 (20+39), quando os resultados foram comparados às suas respectivas infecções monoclonais. Franco et al (2003) também demonstraram claramente em relação ao tropismo tecidual, que as infecções mistas apresentaram comportamento distinto do observado nas infecções monoclonais. Os autores infectaram ratos com duas populações de T. cruzi: com a cepa monoclonal JG (isolada de um paciente com megaesôfago) e com o clone CL-Brener (miotrópico) e demonstraram que nos animais com infecção

Figueiredo, L.M. Discussão

96

mista, o clone CL-Brener foi eliminado do coração ou reduzido a níveis indetectáveis. Além disso, apenas a cepa JG foi encontrada no músculo cardíaco, enquanto o kDNA do clone CL-Brener estava presente no esôfago e no músculo esquelético dos animais

inoculados com 104 tripomastigotas sanguíneos de cada população.

A maioria dos tecidos de animais INT e IT com infecção mista apresentou PCR negativa, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal, o que sugere uma redução da presença do parasito nos tecidos em relação ao observado nas infecções monoclonais quando se pesquisou o kDNA dos clones componentes da mesma. Efeito benéfico de infecções mistas também foi observado por Franco et al., (2003) que verificaram taxa nula de mortalidade em ratos infectados com a mistura de um clone de alta virulência combinado a um de baixa virulência, sugerindo uma interação favorável ao hospedeiro entre os clones da mistura capaz de alterar esse importante parâmetro. Resultados semelhantes foram observados por Martins et al., (2006) em 11/24 misturas aqui estudadas em relação ao parâmetro parasitemia durante a fase aguda da infecção.