Modelagem do Complexo Formado por Calsarcina-1 e Calcineurina A

As análises de bioinformática que resultaram no modelo do complexo Calsarcina-1:Calcineurina A foram realizadas no Laboratório de Bioinformática do LNBio, sob coordenação do pesquisador Dr. Paulo Sérgio Lopes de Oliveira. As predições computacionais foram realizadas em programas de outros autores ou em algoritmos desenvolvidos no próprio LNBio, ainda não publicados. Em linhas gerais, a modelagem envolveu três etapas principais: (1) modelagem individual dos polipeptídeos do complexo; (2) docking dos polipeptídeos modelados; (3) agrupamento dos modelos de acordo com seu TM-score; (4) simulação de dinâmica molecular de modelos do complexo. Cada uma dessas etapas é subdividida em várias outras etapas, que propõem filtros geométricos e energéticos aos modelos inicialmente gerados, a fim de selecionar somente os melhores candidatos. O fluxograma do processo completo está esquematizado na Figura 17.

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Figura 17 – Fluxograma da modelagem do complexo Calsarcina-1:Calcineurina A.

Energético

1) Cálculo da Energia de Ligação das Poses 2) Seleção das Poses de

Menor Energia

Docking

Modelagem Individual dos Polipeptídeos

Local Threading Homologia

CnA

CS1

Geométrico Orientado

CS1:CnA

Agrupamento por TM-score

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Na primeira etapa, as estruturas terciárias dos polipeptídeos foram modeladas a partir da estrutura primária dos mesmos. A estrutura da Calcineurina A murina (isoforma α) foi modelada por homologia com o pacote de programas Yasara Model (KRIEGER et al., 2002; KRIEGER et al., 2003; KRIEGER et al., 2009). O molde utilizado foi a estrutura cristalográfica da homóloga humana (código de acesso no Protein Data Bank: 1AUI), cuja sequência aminoacídica é 99,6% idêntica à murina. Para efeito de modelagem, as sequências aminoacídicas das proteínas homólogas devem ter 30% ou mais de identidade com a sequência a ser modelada. Não foram modeladas a subunidade B e a α-hélice da subunidade A (Met347 a Ser373) que se liga permanentemente à B, pois essas regiões não participam da interface de

interação com Calsarcina-1 (FREY et al., 2000).

A Calsarcina-1, por sua vez, não possui homologia com estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Por essa razão, sua modelagem foi realizada no programa I-TASSER (ZHANG, 2008; ROY et al., 2010), que realiza o processo de threading. Esse algoritmo asssume que, evolutivamente, a estrutura tridimensional protéica é mais conservada que a sequência aminoacídica. Portanto, embora haja muitas estruturas primárias na natureza, o número de enovelamentos possíveis é limitado. Logo, existem sequências razoavelmente diferentes com estruturas semelhantes. No threading, uma biblioteca de enovelamentos (moldes tridimensionais) é criada a partir do PDB. Em seguida, cada resíduo de aminoácido da sequência a ser modelada é “posicionado” dentro dos moldes, no lugar dos aminoácidos originais, e uma série de cálculos é realizada para verificar a compatibilidade estrutural entre o molde e a sequência. Os cálculos de compatibilidade podem considerar diversos critérios, como termodinâmica, acessibilidade ao solvente, informação de estrutura secundária, polaridade do meio e tantos outros. Esse processo é iterativo, pois os “posicionamentos” são realizados com diferentes moldes, até que a compatibilidade entre sequência e estrutura seja máxima. Posteriormente, os enovelamentos de melhor compatibilidade com segmentos da sequência inicial são “montados” em simulações de Monte

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Carlo, orginando um ou mais modelos tridimensionais completos para essa sequência (ZHANG, 2008; ROY et al., 2010).Ao fim da predição, o I-TASSER confere um índice de confiabilidade (C-score) para o modelo gerado, baseado no nível de significância dos “posicionamentos” e nos parâmetros de convergência das simulações de montagem do modelo. O C-score tipicamente pertence ao intervalo [-5,2]. Os modelos mais confiáveis possuem índices mais próximos de 2.

Após a modelagem dos polipetídeos, a estrutura quaternária do complexo foi predita por meio de docking, com programa desenvolvido no LNBio (dados não publicados). Inicialmente, ambos os polipetídeos foram testados quanto à sua complementaridade espacial (docking geométrico). Nesta fase, as restrições de distância provenientes dos íons de crosslinking intermoleculares foram utilizadas para orientar os polipeptídeos entre si, reduzindo o número de possibilidades de acoplamento entre as duas estruturas. As poses geradas na fase geométrica foram submetidas à fase energética, em que a energia de ligação de cada uma é calculada. Somente as poses que se encontram no primeiro percentil da distribuição energética (isto é, em níveis de energia) foram utilizadas nas próximas etapas do algoritmo.

Após os docking, os modelos foram agrupados hierarquicamente em classes estruturais, utilizando o software R com o módulo pvclust (SUZUKI et al., 2006), de acordo com um índice de similaridade estrutural denominado TM-score (ZHANG et al., 2013). Este índice é calculado a partir da distância média entre todos os pares de resíduos de dois modelos, mas atribui um peso maior aos pares mais próximos, o que o torna mais robusto em relação aos “erros locais”. Esses erros ocorrem quando duas estruturas de mesmo padrão de enovelamento são colocadas em diferentes classes estruturais, em razão de diferenças na orientação espacial das cadeias laterais de resíduos próximos (os erros locais).

Finalmente, modelos do complexo de diferentes classes estruturais foram submetidos a simulações de dinâmica molecular, com o objetivo de avaliar seus níveis de estabilidade. Desses, o modelo mais coerente foi visualmente selecionado, levando em consideração a orientação das cadeias laterais dos

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resíduos envolvidos no crosslinking. Este foi o modelo final de todo o processo. Vale ressaltar que a própria simulação de dinâmica molecular melhora a qualidade dos modelos, pois reorienta as cadeias laterais de forma a privilegiar a realização de interações químicas. Isso possui especial importância para a predição da interface de interação entre os dois polipeptídeos. As simulações de dinâmica molecular foram realizadas com o pacote de programas Yasara Dynamics (KRIEGER et al., 2004).

Os resíduos da interface de interação do modelo final foram submetidos à substituição in silico por resíduos de alanina. A energia de ligação decorrente da interação proteína-proteína foi calculada para os modelos com e sem substituições, utilizando o campo de força YAMBER3 (KRIEGER et al., 2004). Se a contribuição energética calculada fosse positiva ou próxima de zero, a substituição desfavorecia a interação, portanto, o resíduo anterior à mutação para alanina contribuía para a estabilização do complexo. Se fosse mais negativa que a energia calculada para o modelo nativo, a conclusão era inversa: a substituição favorecia a interação e o resíduo original desestabilizava o complexo. Finalmente, se a energia calculada fosse negativa e próxima à energia do complexo selvagem, a substituição não interferia na estabilidade da estrutura quaternária – ou seja, o resíduo original exercia pouca ou nenhuma influência sobre a integridade da interface de interação. Dessa forma, avaliaram-se os resíduos da interface quanto à sua contribuição à estabilidade da interação. A substituição de resíduos in silico também foi realizada em programa desenvolvido no LNBio (dados não publicados).

3.15 Co-imunoprecipitação das Construções Mutantes e Selvagens de Calcineurina e