Transformação de E coli

Três diferentes métodos de transformação de bactérias foram utilizados, de acordo com o objetivo do procedimento. Produtos de ligação de DNA entre inserto e vetor eram diretamente submetidos à transformação química ou por choque térmico, pois esses métodos não são prejudicados pelos sais presentes na reação de ligação. Transformações múltiplas (de dois ou mais vetores) eram realizadas por eletroporação, pois esse método promove uma taxa de transformação superior à dos outros procedimentos. Todos os métodos usados estão descritos abaixo.

3.2.1 Choque Térmico

Preparo de Bactérias Competentes pelo Método do Cloreto de Rubídio (RbCl2)

Células de E. coli DH5α eram semeadas em meio LB-ágar e incubadas a 37˚C por 16 h. Em seguida, uma colônia era inoculada em 5,0 mL de meio PSI e incubada sob agitação de 200 rpm a 37°C. Subseqüentemente, esta cultura era inoculada em 200 mL de meio PSI e incubada sob as mesmas condições, até atingir densidade ótica de aproximadamente 0,6 a 600 nm (DO600 = 0,6). Em seguida, a

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cultura era transferida para frascos de centrífuga (previamente resfriados em gelo) e centrifugada a 2000xg,

por 10 min a 4˚C. O sobrenadante era descartado e as bactérias ressuspendidas gentilmente em 25 mL do tampão de transformação I (KOH 30 mmol.L-1; ácido acético 30 mmol.L-1; MgCl2 50 mmol.L-1; CaCl2 10

mmol.L-1; RuCl2 100 mmol.L-1; glicerol 15% v/v; pH 5,8), estéril e gelado. A suspensão era incubada por

15 min no gelo e depois centrifugada a 2000xg, por 15 min a 4˚C. As bactérias eram ressuspensas em 8 mL

do tampão de transformação II (MOPS 10 mmol.L-1; CaCl2 75 mmol.L-1; RbCl2 10 mmol.L-1; glicerol

15% v/v; pH 7,0), estéril e gelado. Alíquotas de 150 L da suspensão bacteriana eram pipetadas em tubos de 0,5 mL e congeladas a - 80˚C, para serem posteriormente utilizadas nas transformações.

Transformação de Bactérias por Choque Térmico

Para cada transformação, adicionaram-se 70 L de célula competente ao microtubo (1,5 mL) onde estava o DNA e a mistura resultante foi incubada em gelo por 30 min. Posteriormente, o microtubo foi incubado a 42˚C por 1min30s e re-incubado no gelo por 1 min. Adicionou-se 1 mL de meio LB líquido às células, que foram imediatamente incubadas a 37˚C, sob agitação de 200 rpm, por 1 h. A cultura resultante foi centrifugada a 1500xg por 10 min à temperatura ambiente. Após essa etapa, 900 L do sobrenadante

foram descartados e o precipitado plaqueado em meio LB-ágar seletivo. A placa foi incubada a 37˚C por aproximadamente 16h.

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3.2.2 Transformação Química

Preparo de Bactérias Competentes para Transformação Química

Para preparar as células competentes, várias culturas sequenciais eram produzidas em meio TYM. Na primeira etapa, o pré-inóculo era incubado a 37˚C e 200 rpm por 16 h. Em seguida, 100 μL do pré- inóculo era adicionado a uma cultura de 10 mL, que deveria crescer nas mesmas condições até atingir DO600 = 0,2 – 0,6 (60 a 120 min de crescimento). Após esse período, os 10 mL da primeira cultura eram

adicionados a 40 mL de meio TYM e incubados até atingir DO600 = 0,5 – 0,9 (60 a 120 min).

Porteriormente, os 50 mL da segunda cultura eram adicionados a 200 mL de meio TYM e incubados até atingir DO600 = 0,6 (90 a 150 min). Finalmente, a terceira cultura era resfriada em banho de gelo e

centrifugada a 3220xg e 4˚C por 15 min. O sobrenadante era descartado, o precipitado de bactérias era

ressuspendido em 100 mL de meio TFB1 gelado (acetato de potássio 0,03 mol.L-1; MnCl2.4H2O 0,05

mol.L-1; KCl 0,1 mol.L-1; CaCl2.2H2O 0,01 mol.L-1; glicerol 15% m/v) e novamente centrifugado por 8

min a 3220xg e 4˚C. O sobrenadante era novamente descartado, o precipitado era ressuspendido em 10 mL

de meio TFB2 gelado (MOPS 0,01 mol.L-1; KCl 0,01 mol.L-1; CaCl2.2H2O 0,075 mol.L-1; glicerol 15%

m/v com adição de KOH até pH = 7,0) e aliquotado em microtubos estéreis gelados (alíquotas de 100 μL). As células competentes eram estocadas a - 80˚C.

Transformação Química de Bactérias Competentes

Alíquotas de 2μL do DNA eram misturadas a 18 μL de tampão de transformação (KCl 0,1 mol.L-1

; CaCl2.2H2O 0,03 mol.L-1; MgCl2 0,1 mol.L-1; PEG 8000 1,5% m/v) e adicionadas a uma alíquota de 100

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incubação à temperatura ambiente por 10 min. Posteriromente, a mistura era adicionada de 900 μL de meio LB.e incubada a 37˚C e 200 rpm por 50 – 60 min.

3.2.3 Eletroporação

Preparo de Bactérias Competentes para Transformação por Eletroporação

Um volume de 10 mL de pré-inóculo fresco era utilizado para a inoculação de uma cultura líquida de 1,0 L de meio LB. A cultura era incubada a 37˚C e 200 rpm até que atingisse DO600 de 0,6. Após o

período de crescimento, a cultura era resfriada em banho de gelo durante 15 a 30 min e centrifugada a 1500xg, por 10 min a 4˚C, em frasco de centrífuga estéril. O sobrenadante era descartado; as células

sedimentadas eram ressuspendidas em 1,0 L de água deionizada, estéril, gelada e centrifugadas novamente, nas mesmas condições descritas anteriormente. As células eram recuperadas e lavadas com solução de glicerol por duas vezes. Na primeira lavagem, as bactérias eram ressuspendidas em 20 mL de glicerol 10% v/v gelado e centrifugadas nas mesmas condições anteriores. Na segunda lavagem, eram ressuspendidas em 2 a 3 mL de glicerol 10% v/v gelado, para uma concentração final de 1x106 a 3x106 células.mL-1. Esta

suspensão de células era dividida em alíquotas de 50 L em microtubos de 0,5 mL, em banho de gelo, e estocadas a - 80˚C. Todas as etapas desse protocolo eram realizadas em ambiente estéril.

Transformação por Eletroporação

Esse procedimento demanda o uso de equipamentos específicos, um eletroporador e cubetas de metal (Gene Pulser Xcell, da Bio-Rad – Hercules, Califórnia). As cubetas eram previamente preenchidas com etanol 70% v/v por 5 min. Depois, o etanol era retirado em capela de fluxo laminar, onde as cubetas eram deixadas para secar. Todo o procedimento a partir de então era realizado em capela de fluxo laminar.

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Posteriormente, as cubetas eram colocadas em banho de gelo até resfriar. De modo semelhante, a alíquota de células competentes era retirada do estoque a - 80˚C e incubada em banho de gelo, por 1 min. Rapidamente, 40 L de suspensão de células eram misturados a 0,3 – 2,0 L de DNA, de acordo com a concentração, em microtubo estéril resfriado. Eram realizadas transformações únicas, com apenas um tipo de vetor, além de duplas e triplas. A mistura de DNA e células era transferida para a cubeta, com cuidado para evitar a formação de bolhas, a qual era acoplada ao eletroporador. O aparelho era ajustado para o protocolo de amostras bacterianas, com um pulso de 1800 V ou 2500 V. Dado o pulso, o material era misturado a 1,0 ml de meio LB, em microtubo estéril, em capela de fluxo laminar. Essa cultura era incubada a 37˚C e 200 rpm por 1 h. Após o crescimento, 50 – 200 L de cultura foram plaqueados em LB- ágar seletivo, com auxílio de uma alça de Drigalski. A placa era incubada a 37˚C por 16h.