3 Material e Métodos
5.1 Modelo experimental
Foram utilizados nesta pesquisa 40 ratos Wistar machos, adultos, provenientes do Biotério Central da UNESP – Botucatu criados sob condições uniformes e controladas. Os ratos machos adultos são mais susceptíveis à lesão renal e, por isso, são preferencialmente utilizados nos experimentos envolvendo isquemia/reperfusão61.
Apesar da distribuição aleatória dos animais para a formação dos grupos, a análise estatística do peso da população estudada evidenciou diferença estatisticamente significativa entre os grupos, às custas de uma menor média de peso obtida pelo grupo IR. Salienta-se, entretanto, que todos os animais apresentavam o mesmo grau de maturidade e a dosagem do pantoprazol utilizada foi calculada tomando-se como referência o peso dos animais em mcg/kg.
Os animais foram mantidos durante o experimento com mesma base de dieta. Por tratar-se de experimento envolvendo dosagens de creatinina foi importante a mesma composição alimentar dos animais, evitando-se diferenças na carga proteica oferecida e, portanto, impactos na creatinina plasmática62.
O cuidado em manter o mesmo regime de manutenção e reposição de volume durante o experimento foi respeitado, pois as alterações determinadas por uma hiper ou hipo reposição da volemia podem alterar a leitura dos valores de creatinina63.
Durante experimentos envolvendo modelos de isquemia e reperfusão renal em ratos é essencial o registro e controle da temperatura dos animais. A literatura consubstancia o papel deletério da hipertermia na vigência de um insulto isquêmico, determinando valores aumentados de creatinina e, por outro lado, evidencia, também, o papel protetor da hipotermia64. Zager et al.65 utilizaram um modelo de isquemia e reperfusão em ratos, realizando 25 e 40 minutos de oclusão da artéria renal (bilateral) em três diferentes intervalos de temperatura: 32°C-34°C; 36,7°C-37,2°C e 38°C-39° C e observaram níveis de creatinina de: 0,56 ± 0,06mg/dL, 1,4 ± 0,25mg/dL e 3,2 ± 0,23 mg/dL, respectivamente. Nesse experimento houve o controle da temperatura por meio de termômetro retal e uso de bolsas térmicas no intuito de manter a temperatura na faixa
de 37ºC a 38oC. A temperatura média dos grupos manteve-se sem diferenças estatisticamente significativas quando analisadas dentro dos Tempos 1, 2 e 3. Entretanto, a temperatura média aumentou ao longo do experimento, com diferença significativa, nos grupos P e IR, onde se observou maiores médias. Esses achados não parecem ter interferido nos valores de creatinina observados pelos critérios de RIFLE ou AKIN, já que os estágios de LRA foram menores no grupo P comparados ao grupo Sham e sem diferenças significativas quando comparado os grupos IR e PIR. Salientando-se que Zager et al. afirmam que valores mais elevados de creatinina foram observados com tempos maiores de isquemia (40 minutos), o dobro do utilizado em nosso experimento.
O comportamento da pressão arterial dos animais apresentou padrão semelhante nos grupos PIR, P e IR, onde ocorreu o descenso dos valores aferidos no Tempo 2 e estabilização posterior. Apenas o grupo Sham apresentou descenso no Tempo 2 acompanhado de recuperação ao final do Tempo 3. A monitorização da PAM durante o experimento utilizando modelo de isquemia e reperfusão é fundamental, pois a isquemia ativa mecanismos compensatórios que estão associados à piora da evolução da LRA, devido a maior liberação de noradrenalina66. Apesar das diferenças estatisticamente significativas entre os grupos dentro dos Tempos 1 e 3, notadamente no grupo PIR apresentando menores valores, observa-se que as médias da PAM permaneceram dentro da faixa de autorregulação.
Neste experimento o tempo de isquemia foi de 20 minutos obtida pelo clampeamento da artéria renal esquerda nos grupos PIR e IR. O uso de clamp atraumático é recomendável, pois diminui o risco de lesão vascular, e permite, após sua liberação, a reperfusão do órgão67. O tempo de isquemia determina o grau de lesão e disfunção renal, que podem ser avaliados histologicamente ou com a análise da creatinina. Park et al.60 demonstraram em ratos que 25 minutos de isquemia renal dobram os valores basais da creatinina plasmática, enquanto que 45 minutos resultam em aumento na ordem de sete vezes e determina necrose significante (>75%) do órgão. Os resultados histológicos obtidos nesse experimento, demonstrando lesões com área de necrose > 50% em 70% dos rins esquerdos dos grupos PIR e IR e a ausência de lesão nos demais grupos, evidenciam que o tempo de 20 minutos de isquemia associados a 30 minutos de reperfusão consistem em modelo válido, em concordância com modelos já descritos na literatura23.
Em todos os animais após a nefrectomia direita procedeu-se à administração do pantoprazol e/ou à manobra de isquemia renal, no intuito de evitar uma compensação da função renal global e permitir uma recuperação mais precoce do rim esquerdo68. Esse cuidado se deve em função de pesquisas anteriores, onde se evidenciou que modelos experimentais onde o insulto isquêmico em um rim, com a manutenção da perfusão do rim contra lateral, determina uma resposta exacerbada do sistema renina angiotensina aldosterona pelo rim não isquêmico, levando à vasoconstricção e maior dano ao rim isquêmico69.
A partir dos estudos sobre pré-condicionamento isquêmico publicados por Murry et al.70, onde evidenciou-se o seu papel protetor sobre o miocárdio de cães, muitos estudos atribuíram a alguns fármacos a propriedade protetora de pré- condicionamento, similar ao isquêmico. Denominou-se pré-condicionamento farmacológico. Dentre essas drogas encontram-se os anestésicos inalatórios halogenados.
A técnica anestésica empregada neste estudo foi a anestesia geral inalatória com o uso de isoflurano, tanto na indução anestésica como na manutenção. A opção do isoflurano baseia-se no conhecimento prévio da sua propriedade em diminuir o dano da lesão de isquemia e reperfusão em ratos por reduzir a inflamação71 e sua associação a menores valores de creatinina sérica e atenuação da necrose renal72.