Modelos C. elegans para a Doença de Huntington

O modelo C. elegans também não possui ortólogos para a proteína Huntingtina, assim, os modelos para a Doença de Huntington são animais que expressam fragmentos da proteína Huntingtina com expansões variáveis de glutamina nos neurônios, além de animais que expressam apenas repetições poliglutamínicas fusionadas a proteínas fluorescentes amarelas (YFP) no músculo ou intestino (Dimitriadi e Hart, 2010). Esses transgênicos são suficientes para reconstruir as características patológicas das doenças poliQ, incluindo o surgimento dos agregados proteicos, perda de função e morte celular (Morley e cols., 2002).

Diversos estudos já foram feitos utilizando transgênicos poliQ em C. elegans.

Morley et al. (2002) demonstraram que o limiar para o surgimento de agregados proteicos em animais jovens adultos está entre 35 e 40 glutaminas e que o envelhecimento influencia a agregação e toxicidade poliQ, recapitulando duas das principais características da maioria das doenças poliQ que é ter o início dos sintomas dependente da idade e apresentar de 31 a 38 repetições de glutamina em sua proteína específica (Morley et al., 2002; Zoghbi e Orr, 2000). A análise de células neuronais demonstrou que C. elegans transgênicos expressando 19 glutaminas (Q19::YFP) apresentam a distribuição das proteínas Q19 difusa, enquanto os transgênicos expressando 82 glutaminas (Q82::YFP) apresentam as proteínas Q82 distribuídas em forma de agregados. Proteínas com expansões de

19 glutaminas são solúveis, enquanto as que expressam 82 glutaminas são insolúveis, sugerindo que a solubilidade dos focos poliQ são consistentes com a agregação (Brignull e cols., 2006).

Em C. elegans, mais de 60 neurônios inervam células musculares. A disfunção destes neurônios resulta em perda de coordenação ou paralisia. Faber et al. (1999) descreveram a construção de animais transgênicos que expressavam fragmentos da proteína Huntingtina humana, de diferentes comprimentos, nos neurônios sensoriais e bilaterais ASH. A construção contendo 150 repetições (Htn-Q150) permitiu a observação de uma neurodegeneração progressiva e dependente da idade, mas não foi observada morte celular significativa, como acontece na doença humana. Além disso, foi possível observar que a proteína Htn-Q150 forma agregados celulares e ativam mecanismos envolvidos na apoptose sugerindo que este pode ser o mecanismo responsável pela morte celular (Faber et al., 1999).

Em estudo posterior, Faber et al. (2002) descrevem que o silenciamento da proteína PQE-1 (“poliQ-enhancer protein”) aumenta a toxicidade da proteína HtnQ150, e propõem o uso de animais mutantes para esta proteína como

background para obtenção de uma neurodegeneração mais acentuada e mais

rápida nestes modelos (Faber et al., 2002). A cepa proposta (HA759) contém, além da construção contendo a proteína HtnQ150, o gene repórter osm-10::gfp, que permite acompanhar a neurodegeneração nestes animais como a perda da fluorescência bilateral nos neurônios ASH. Esta cepa foi utilizada em outros estudos na triagem de compostos com potenciais propriedades protetoras contra a toxicidade de proteínas poliglutamínicas (Voisine et al., 2007; Xiao et al., 2015; Zhang et al., 2012).

Morley et al. (2002) descreveram a construção de cepas transgênicas que expressavam diferentes expansões poliglutamínicas (que variavam de 19 a 82 repetições CAG) fusionadas ao gene da proteína amarela fluorescente (YFP), sob o controle do promotor do gene unc-54, que direcionava a expressão para o tecido muscular do animal. Os autores puderam demonstrar que a agregação das proteínas poliglutamínicas é dependente do comprimento das repetições, uma vez que havia uma transição entre a observação de uma fluorescência

difusa para focal com o aumento do número de repetições poliglutamínicas que o animal apresentava. Além disso, foi possível observar que a toxicidade destes agregados se expressava como diminuição da motilidade, bem como que havia uma correlação positiva entre o aumento da idade e o aumento do número de agregados para algumas das cepas.

Os modelos C. elegans citados já foram utilizados para compreender melhor os mecanismos envolvidos na Doença de Huntington. Jia et al. (2014) demonstraram o envolvimento dos mecanismos de degradação proteica na patogênese das doenças poliglutamínicas ao observar que o silenciamento de três genes envolvidos no processo de autofagia acelerou e aumentou a agregação de proteínas em animais que expressam expansões poliQ no músculo, além de aumentar o número de agregados e a neurodegeneração causada pela proteína HtnQ150 (Jia et al., 2014). As chaperoninas 70, HSP-1 e HSF-HSP-1 já foram associadas à atenuação da toxicidade de proteínas poliglutamínicas, uma vez que o knock-down de ambas antecipou e aumentou a agregação em modelos que as expressam no músculo (Nollen et al., 2004). O mesmo estudo identificou, ainda, através de RNAi, que além de chaperonas, genes envolvidos em muitas outras vias como de degradação proteassômica, síntese e processamento de RNA e síntese de proteínas e de subunidades ribossomais estão envolvidos na toxicidade das proteínas poliglutamínicas.

A via semelhante à insulina de C. elegans também foi correlacionada com a toxicidade das proteínas poliglutamínicas, uma vez que o knock-down de age-1

foi capaz de reduzir a formação de agregados de uma maneira dependente de

daf-16 (Morley et al., 2002). AGE-1 é ortólogo de uma fosfatidil-inositol-3-quinase

(PI3-quinase) em C. elegans, que atua na via de sinalização da insulina, e cujo

knock-down já foi correlacionado com o aumento da longevidade (Morris et al.,

1996). Estes dados sugerem que, assim como para o Mal de Alzheimer, existe uma ligação entre os mecanismos que controlam o envelhecimento e aqueles que influenciam o surgimento de doenças neurodegenerativas.

2.9 Justificativa

por numerosos agentes endógenos e exógenos. As consequências de uma resposta defeituosa ao dano no DNA são bem estudadas nas células em proliferação, especialmente no desenvolvimento do câncer, mas seus papéis precisos no sistema nervoso são relativamente pouco compreendidos. Segundo estimativas da Alzheimer’s Disease International (2018), as demências afetam mais de 47 milhões de pessoas em todo o mundo. No Brasil, são estimados 55 mil novos casos de demências todos os anos, a maioria decorrente do Alzheimer. A Sociedade Brasileira de Geriatria e Gerontologia (SBGG) chama atenção para o fato de a população brasileira estar envelhecendo de forma acelerada. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, havia 28 milhões de pessoas acima dos 60 anos em 2018. Até 2060 este número subirá para 73 milhões. A projeção da Alzheimer’s Disease International (2018) é de que já foram gastos mais de 818 bilhões de dólares para o tratamento de demências no mundo, soma que deve chegar a 1 trilhão nos próximos anos. No Brasil, não há dados oficiais sobre quanto que é gasto para tratar o Alzheimer ou outras doenças cognitivas, porém a tendência é que os custos aumentem nos próximos anos.

Ortólogos da maior parte das proteínas conhecidas da BER e NER já foram identificados no C. elegans (Fensgard et al., 2010; Lans et al., 2010; Papaluca et al., 2018). Estudos usando mutantes de perda de função e knock-down mediados por RNAi de vários genes da NER mostrou que estes são mais sensíveis a UV e confirmou o seu papel na resposta à irradiação ultravioleta e reparação de fotolesões da UV (Meyer et al., 2007). Além disso, outros processos biológicos também são afetados nestes mutantes tais como a embriogênese, desenvolvimento, crescimento, longevidade e apoptose (Lans et al., 2010).

Neste trabalho, nós utilizamos o Caenorhabiditis elegans como modelo para investigar o efeito da inibição dos sistemas de reparo do DNA (BER e NER) no balanço redox e verificar como a ausência dessas vias de reparo aceleram o desenvolvimento de fenótipos neurodegenerativos e afeta a integridade neuronal. Conhecer a importância das proteínas de reparo no desenvolvimento de DN pode elucidar os mecanismos utilizados pelas células e abrir novas portas que permitam a produção de novos biofármacos.

3 OBJETIVOS