Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

Lesões maiores em uma fita do DNA que distorcem substancialmente a hélice do DNA são reparadas por NER. O NER repara as lesões cortando um pedaço da fita de DNA danificada e preenchendo a lacuna por síntese de DNA. Em outro sentido, a via NER, de forma canônica, é responsável por corrigir danos na dupla fita do DNA. Porém, a literatura vem mostrando que esta via também apresenta importante papel no reparo de danos oxidados no DNA juntamente com a via BER (D’errico et al.,2006; Mellis et al., 2008).

A via NER pode ser classificada em duas subvias: o reparo acoplado à transcrição (do ingles: transcription-coupled repair-TC-NER) repara apenas a região transcricional do DNA, e o reparo do genoma global (do inglês: Global

genomic repair - GG-NER) remove lesões encontradas em qualquer região do

genoma (Rapin, 2013). A via NER envolve a interação de mais de 30 proteínas responsáveis pelo reparo do DNA. Mutações nos genes que codificam esses fatores são responsáveis pelos fenótipos associados a algumas doenças raras como Xeroderma pigmentosum (XP), Síndrome de Cockayne (CS) e Tricotiodistrofia, estando, provavelmente, envolvidas com fenótipo dessas síndromes (Kalia e Lang, 2015; Noyce et al., 2012). Além disso, é conhecido que pacientes deficientes em Xeroderma pigmentosum grupo A (XPA) apresentam atividade redox alterada, como a maior propensão ao acúmulo de ERO, e consequente instabilidade genômica. Nesse contexto, estudar os mecanismos moleculares associados às manifestações observadas em pacientes com Xeroderma pigmentosum e Síndrome de Cockayne são fundamentais para o desenvolvimento de terapias gênicas que visem à melhoria da qualidade de vida desses pacientes (Parlanti et al., 2012).

A subvia TC-NER tem início a partir do bloqueio da atividade da RNA polimerase II (RNA-Pol II) sobre a fita de DNA danificada na região da lesão. Por conseguinte, CSB (do inglês: Cockayne syndrome B) apresenta a importância de recrutar CSA (do inglês: Cockayne syndrome A), remodeladores da cromatina, como p300 (E1A Binding Protein P300), para o local da RNA-Pol II, exigindo a função de XPA e RPA, que, por sua vez, recrutam as proteínas que formam o complexo multi-proteína TFIIH e as proteínas Xeroderma pigmentasum grupo G (XPG) e ERCC1-XP (Figura 3) (Iyama e Wilson, 2016; May et al., 2010; Rapin, 2013).

TFIIH é um complexo transcricional formado por cerca de 10 proteínas, dentre elas XPD (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação D) e XPB (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação B), que apresentam atividade helicase dependente de trifosfato de adenosina (ATP). Dentre as proteínas que formam este complexo, p52 (keratin 18 pseudogene 52) estimula a função de XPB e p44 (ribosomal protein L21 pseudogene 44) e estimula a função

de XPD, que são extremamente importantes para a abertura da dupla hélice e a ligação do complexo pré-incisão. Apenas a atividade de ATPase de XPB é necessária para que NER aconteça e, por conseguinte, XPD deve apresentar a atividade de ATPase e helicase e atua na detecção da lesão quando seu movimento sofre algum impedimento. Dentre todas as proteínas que formam este complexo, XPD e XPB promovem a abertura do DNA para a formação de uma bolha de 30 nucleotídeos em média (Figura 3) (Spivak, 2015).

No GG-NER, o complexo XPC-hHR23B é responsável pelo reconhecimento do dano. A partir daí, as subvias passam a compartilhar a mesma etapa, quando a fita de DNA sofre uma abertura pela ação das XPD e XPB, presentes no complexo de reparo/transcricional TFIIH, juntamente com XPA e RPA, que promovem a estabilização da fita simples, permitindo a ação das endonucleases específicas: XPG (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação G) e ERCC1-XPF (Xeroderma pigmentosum grupo de complementação F) (Figura 3). XPG é recrutada por meio de sua interação com TFIIH no lado 3’ da fita e seu posicionamento na região em que a incisão deve ser feita depende do auxílio de RPA. A interação entre ERCC1 e XPA estimula o recrutamento de ERCC1-XPF na região 5’ da lesão. A lacuna, gerada pela retirada do oligonucleotídeo é preenchida pelos DNA polimerases replicativas δ e ε ou pelo DNA polimerase de síntese translesão k, na presença de PCNA, RFC e RPA (May et al., 2010; Spivak, 2015). Por fim, a última ligação fosfodiéster entre o novo nucleotídeo inserido e o DNA já existente é realizada pela Lig1 ou pela Lig3α juntamente com XRCC1 (May et al., 2010).

Alterações na integridade genômica e na via NER podem causar algumas síndromes, como é o caso das doenças: Síndrome de Cockayne (CS) e Xeroderma Pigmentosum (XP). A primeira é caracterizada por hipersensibilidade a luz UV, defeitos na síntese de RNA após exposição à radiação, anomalias graves no neurodesenvolvimento, envelhecimento precoce, catarata, alterações na glicemia, comprometimento hepático e renal e alterações na locomoção (Nance e Berry, 1992; Ozdirim et al., 1996). Entretanto, XP é uma das doenças mais estudadas que afetam NER, tendo em vista sua gama de mutações e classificações. Essa doença é classificada como Xeroderma Pigmentosum grupo

Figura 3: Reparo de excisão de nucleotídeos.

Lesões de DNA volumosas que desestabilizam a hélice dupla de DNA são alvo de NER. O reconhecimento de danos é realizado por transcrição acoplada a NER (TC-NER) e global genome NER (GG-NER). Sugere-se que, antes do reconhecimento de danos, a cromatina tenha que ser modificada. As lesões na cadeia transcrita de genes ativos são detectadas pela RNA polimerase II (RNAP2) e estabilizam a interação com CSB (etapa 1b). Dentro de GG-NER, as lesões são reconhecidas pelos complexos UV-DDB e XPC (etapa 1a). Estes intermediários carregam o fator de transcrição TFIIH juntamente com a endonuclease XPG (etapas 2a e 2b). No TC-NER, o CSA também é recrutado para modificar e reposicionar o RNAP2 lesionada (etapa 2b). Após os dois modos de detecção da lesão, os dois processos se fundem numa via comum de montagem do fator NER recrutando o XPA e a proteína de replicação A (RPA) (etapa 3). Este intermediário NER carrega e orienta adequadamente o complexo endonuclease específico da estrutura ERCC1/XPF (etapa 4). Após a incisão dupla por XPG (3´ da lesão) e ERCC1/XPF (5´ da lesão), uma cadeia única de 25-29 nucleotídeos é criada (etapa 5). A XPG está provavelmente envolvida no recrutamento do grampo deslizante PCNA, que é carregado por RFC e forma a plataforma para os enchimentos da DNA polimerases ϐ, ɛ ou k (etapa 6). Descobriu-se que cada uma destas polimerases participa no preenchimento de lacunas dependente de NER. PCNA ou RFC estão também provavelmente envolvidos no recrutamento das ligases (isto é, Ligase I e III/XRCC1, dependendo da capacidade de proliferação da célula) para selar o nick (etapa 7). O PCNA também desempenha um papel na atração da histona chaperona CAF1 (etapa 8) para restaurar a estrutura da cromatina após o reparo (etapa 9). Fonte: Adaptada de Giglia-Mari et al. (2011).

de complementação de A a G e ainda apresenta um grupo variante, o XP-V, cujos indivíduos não apresentam defeitos no NER, mas sim no mecanismo de reparo por síntese translesão. Dentre os fenótipos clássicos de indivíduos com XP, essa doença também apresenta sensibilidade à radiação UV, provocando diversas alterações cutâneas como atrofia, hiperpigmentação da pele, angioma, sardas e fotofobia (Tang et al., 2000). Em alguns pacientes XPA, de forma pontual, as células do gânglio da raiz dorsal morrem seletivamente, provocando neuropatia axonal sensitivo-motora com perda de propriocepção, fraqueza e atrofia muscular (Mantha et al., 2014).