Capítulo I – Avaliação da interação de fármacos com a amiodarona em células
1.3. Modelos experimentais para estudos de metabolismo
A avaliação da indução ou inibição das isoenzimas do CYP e a previsão de interações farmacológicas são considerações de grande importância não só no desenvolvimento de novos agentes candidatos a fármacos como também na seleção dos regimes farmacoterapêuticos mais adequados [82].
Durante os últimos anos foram desenvolvidos vários modelos in vitro e ex vivo para o estudo do metabolismo hepático de fármacos, pois o fígado é o principal órgão de metabolização [82-84]. Entre os vários modelos in vitro destacam-se as fatias de tecido hepático, os hepatócitos isolados ou em cultura, as linhas celulares hepáticas e as
preparações sub-celulares como os microssomas, as enzimas hepáticas e a fração S9 [85-87]. No entanto, apenas os modelos in vitro que envolvam células hepáticas humanas retêm a capacidade de expressar as vias metabólicas completas suscetíveis de ocorrerem in vivo [85- 88]. Desta forma, são extremamente necessários sistemas celulares in vitro confiáveis e estáveis que mantenham as funções específicas do fígado importantes para o metabolismo [89]. Como os hepatócitos representam cerca de 70-80% da população hepática celular e expressam um grande número de sistemas enzimáticos que participam no metabolismo de xenobióticos, os hepatócitos primários humanos têm vindo a assumir-se como um modelo chave na avaliação in vitro do metabolismo de fármacos [84, 85]. Efetivamente, os hepatócitos primários isolados para além de constituírem um modelo in vitro ideal para o metabolismo de fármacos [82, 84, 90, 91], permitem avaliar também o potencial para a ocorrência de interações farmacológicas [92], sendo o modelo “gold standard” para os estudos metabólicos e toxicológicos [86, 87, 91, 93] e o mais aproximado ao fígado em condições in vivo [85, 94]. Contudo, a utilização dos hepatócitos primários humanos em estudos metabólicos parece ser limitada pela sua disponibilidade errática e escassa [82, 84, 87, 88, 90, 93, 95], pela fraca estabilidade das suas funções quando em cultura [84, 90], atividade de crescimento e tempo de vida limitados [87, 90-94], existência de alterações fenotípicas precoces e variáveis [84, 85, 87, 88, 90, 92, 93] e ausência de divisão celular em culturas primárias [92]. São também documentadas grandes variações entre populações de hepatócitos na atividade funcional [82, 84, 85, 90, 94, 96], tanto no que diz respeito aos níveis de expressão de isoenzimas CYP, quanto à magnitude da sua indução após tratamento com indutores [90]. Consequentemente, linhas celulares imortalizadas de hepatócitos, principalmente derivadas de tumores (células HepG2 e as células Huh-7) têm vindo a ser usadas em alternativa aos hepatócitos primários, possuindo, ainda assim, várias limitações [90, 97]. Em particular, os hepatócitos imortalizados não expressam ou expressam em níveis muito reduzidos uma série de enzimas específicas do fígado humano, tornando-as inadequadas enquanto representativas das células do parênquima hepático in vivo [90].
Recentemente foram desenvolvidas as células HepaRG que parecem ser muito promissoras enquanto modelo in vitro para avaliar a metabolização hepática de fármacos, quer pelo que diz respeito tanto às suas funções quanto à sua estabilidade fenotípica [84]. As células HepaRG são derivadas de um carcinoma hepatocelular humano [86, 90, 98-100]. Esta linha celular apresenta capacidade metabólica similar aos hepatócitos primários humanos e potencial de proliferação indefinido característico das células tumorais [92]. Esta é uma linha celular bipotente que se diferencia progressivamente em células tipo-hepatócito e células tipo-biliares, expressando funções altamente diferenciadas [5, 85, 88, 91, 93, 97, 101-103]. Segundo Andersson et al. (2010), quando diferenciadas, a linha celular apresenta uma expressão estável das proteínas chave no metabolismo de fármacos e nas funções específicas do fígado por mais de 6 meses [84]. As células HepaRG expressam várias funções hepáticas tal como as principais isoenzimas do sistema CYP: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2E [83, 86, 87, 91, 93, 99], CYP2C19 [91] e CYP3A4 [83, 87, 91, 93, 99, 104]; enzimas da fase II do
metabolismo [82, 83, 85-89, 91-93, 97]; transportadores de influxo e efluxo [82-84, 86-89, 92, 93, 95], transportadores apicais e canaliculares ABC [86]; e todos os recetores nucleares [82, 92], em níveis comparáveis aos existentes nos hepatócitos primários humanos [82, 86, 89, 94, 100]. Desta forma, estas células constituem a primeira linha celular de hepatoma humano que expressa altos níveis das isoenzimas do CYP [90]. Cerca de 85% dos genes expressos constitutivamente nos hepatócitos humanos primários são também expressos nas células HepaRG [88]. Assim, quando estas células atingem uma morfologia diferenciada tipo- hepatócito retêm um conjunto único de enzimas metabolizadoras em níveis comparáveis aos dos hepatócitos humanos normais em culturas primárias [90]. As células HepaRG apresentam, desta forma, uma capacidade metabólica que reflete o observado em hepatócitos humanos em culturas primárias [82], representando hoje uma alternativa aos hepatócitos primários humanos de grande interesse, quer no que respeita à avaliação in vitro do metabolismo de fármacos [82, 84, 86, 88, 90, 91, 99, 101], quer no que se refere a estudos toxicológicos [82, 88, 90, 91, 98].
2. Objetivos
O tratamento com múltiplos fármacos é uma prática comummente utilizada em vários esquemas terapêuticos. Assim, perante a escassez de estudos existentes na literatura que documentem o envolvimento da AM enquanto fármaco alvo de interações farmacológicas, o objetivo principal do presente trabalho de investigação consistiu no desenvolvimento e aplicação de metodologias experimentais capazes de virem a ser utilizadas de forma generalizada em programas de screening e de avaliação in vitro do potencial de interferência de fármacos convencionais no metabolismo da AM.
Concretamente, os objetivos parcelares traçados ao delinear o trabalho conducente a esta componente de investigação consistiram:
• No desenvolvimento e validação de uma técnica analítica para quantificação de AM e MDEA no lisado de células HepaRG;
• Na avaliação da citotoxicidade celular para a AM, MDEA e todos os fármacos selecionados como exemplos para os estudos metabólicos (rifampicina, fenitoína, cimetidina, varfarina e verapamil);
• Na realização de estudos metabólicos de indução e de inibição com o intuito de demonstrar a aplicação da técnica analítica e dos procedimentos experimentais desenvolvidos na avaliação do potencial de interação metabólica de fármacos convencionais com a AM.