Várias doenças de caráter inflamatório induzem a formação de edema, infiltração de leucócitos e liberação de vários mediadores pró- inflamatórios. Dentre as doenças das vias aéreas, cujas características fisiopatológicas envolvem reconhecidamente a resposta inflamatória, destaca-se a asma brônquica.
Algumas espécies de animais têm sido utilizadas em modelos experimentais de asma, incluindo cobaia, cão, camundongos e ratos. Estes modelos experimentais permitem avaliar as alterações morfológicas, imunológicas e fisiológicas nas vias respiratórias que podem mimetizar alguns eventos que ocorrem na asma brônquica humana. Desta forma, modelos em camundongos podem proporcionar uma oportunidade para estudar vários aspectos da doença, devido à facilidade de avaliar-se a resposta imunológica e farmacológica.153
Dentre os diversos modelos experimentais para indução de inflamação pulmonar pode-se citar o modelo de indução de inflamação eosinofílica. Esse modelo utiliza camundongos BALB/C ou C57BL/6, que são sensibilizados com ovalbumina (OVA) e o adjuvante hidróxido de alumínio. As vias aéreas dos camundongos sensibilizados com este agente flogístico apresentam resposta alérgica imediata e tardia similar à asma alérgica, que ocorre em humanos. Nesse modelo experimental, o lavado bronco-alveolar é coletado um ou dois dias após o desafio, permitindo a avaliação de parâmetros inflamatórios, e dessa forma, o estudo da asma eosinofílica.154
Outro modelo experimental utiliza a inoculação de vírus, como por exemplo, o vírus sincicial respiratório (VSR), pois infecções virais do trato respiratório são comuns em todas as idades, e, em especial os pacientes com asma brônquica apresentam exacerbações destas doenças quando acometidos por infecções virais. Os modelos experimentais em camundongos após exposição intranasal do vírus permitem avaliar parâmetros imunológicos sistêmicos e locais como o estudo do remodelamento das vias aéreas, a liberação de diversos mediadores inflamatórios, além da celularidade. O maior inconveniente da utilização desse modelo é que o uso de vírus necessita de maiores investimentos laboratoriais, considerando que o cultivo e os métodos de infecção, em geral, são mais complexos.155,156
Existem ainda modelos combinados, nos quais os camundongos são expostos a alérgenos e a vírus, pois estudos demonstraram que os pacientes com asma alérgica, quando expostos a infecções virais, apresentam episódios de hiperresponsividade das vias aéreas e exacerbação da doença. Esses modelos também permitem a avaliação da resposta inflamatória local e sistêmica.157
Além disso, existem modelos experimentais em camundongos que mimetizam a asma neutrofílica. Nesta condição clínica, a resposta inflamatória pulmonar apresenta o predomínio do influxo de neutrófilos. Dentre os modelos utilizados, destacam-se a indução de infecção pulmonar com Pseudomonas aeruginosa vivas e o uso de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para estimular a resposta imune inata.158-159
Outro modelo que permite a avaliação da inflamação na cavidade pleural e no pulmão é o modelo da pleurisia que foi originalmente desenvolvido em ratos160, reproduzido em cobaias161, e também descrito em camundongos.162 A pleurisia murina induzida pela carragenina (Cg) é um modelo que mimetiza a asma brônquica neutrofílica. Neste modelo, observa-se uma resposta do tipo bifásica, sendo que na primeira fase (4 h) da resposta inflamatória ocorre aumento da exudação e do influxo de neutrófilos na cavidade pleural dos camundongos. E na segunda fase (48 h) da resposta inflamatória, observa-se também exsudação elevada, bem como o aumento do influxo de células mononucleares. A pleurisia induzida pela Cg em camundongos possui vantagens em relação aos outros modelos citados anteriormente, pois, a partir da coleta do exsudato da cavidade pleural, é possível analisar e quantificar diversos parâmetros inflamatórios como celularidade, exsudação e mediadores inflamatórios.162,163
Neste trabalho, optou-se pelo modelo experimental da pleurisia induzida pela Cg, em camundongos. A escolha deste modelo foi baseada na facilidade de execução da técnica, depois de adequado treinamento. Além disso, o agente indutor da pleurisia, a carragenina, é um derivado vegetal com ação inflamatória e pró-oxidante, o que possibilita a avaliação e quantificação de parâmetros relacionados a estes eventos.164
1.5 JUSTIFICATIVA
A busca por substâncias capazes de prevenir, amenizar e curar vem desde os primórdios da existência humana.
Existem evidências de que as espécies reativas, e consequentemente o estresse oxidativo, podem ser a causa ou a conseqüência de doenças inflamatórias humanas. Apesar do grande arsenal terapêutico disponível para o tratamento de doenças inflamatórias, muitas destas ainda possuem terapia limitada. Além disso, muitos pacientes apresentam tolerância aos tratamentos convencionais e alta frequência de efeitos adversos.
Fármacos e outras substâncias que demonstrem efeito anti- inflamatório e redução da produção de espécies reativas constituem-se como importante objeto de estudo para o tratamento de doenças de caráter inflamatório.
1.6 HIPÓTESES
H1: Os fármacos rosiglitazona e pioglitazona apresentam efeito anti- inflamatório e/ou antioxidante, no modelo experimental da pleurisia murina induzida por Cg;
H0: Os fármacos rosiglitazona e pioglitazona não apresentam efeito anti- inflamatório e/ou antioxidante, no modelo experimental da pleurisia murina induzida por Cg.
2 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos anti-inflamatório e/ou antioxidante do maleato de rosiglitazona e do cloridrato de pioglitazona, administrados por via intra-peritoneal (i.p.) na primeira (4 h) e segunda (48 h) fases da resposta inflamatória induzida pela carragenina (Cg).
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Avaliar os efeitos do maleato de rosiglitazona (ROSI) e do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre a migração de leucócitos e a exsudação no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
II. Verificar o efeito dos fármacos sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e adenosina-deaminase (ADA) no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
III. Estudar o efeito dos fármacos sobre as concentrações das citocinas fator de necrose tumoral-alfa (TNF- ) e interleucina-1 beta (IL-1 ) no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
IV. Avaliar o efeito da rosiglitazona sobre as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx), da interleucina-17A (IL-17A) e do fator de crescimento vascular endotelial-alfa (VEGF- ) no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
V. Verificar o efeito da pioglitazona sobre a atividade das enzimas Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutationa Peroxidase (GPx) e Glutationa S-transferase (GST) no sangue dos camundongos;
VI. Analisar o efeito da pioglitazona sobre as concentrações de Substâncias Reativas do Acido Tiobarbitúrico (TBARS) no lavado da cavidade pleural dos camundongos.
3 METODOLOGIA
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Este trabalho é um estudo experimental, prospectivo e controlado.
3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
3.2.1 Animais
Para a técnica de pleurisia foram utilizados camundongos albinos suíços, 1 mês de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18 e 25 g, fornecidos pelo Biotério Central da UFSC.
Os animais mencionados foram acomodados em gaiolas plásticas com serragem, sob temperatura ambiente e a luz natural. Estes animais receberam alimentação e água durante todos os experimentos.165 Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) sob protocolos № PP00181 e PP00027/06 (Anexos 1 e 2).
3.2.2. Desenho experimental
Para investigar o efeito das glitazonas estudadas sobre os parâmetros inflamatórios primeiramente realizaram-se curvas dose e tempo-resposta para ambos os fármacos.
Na primeira fase (4 h) da pleurisia induzida pela Cg, em camundongos, diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses da rosiglitazona (ROSI 0,5 - 10 mg/Kg, i.p.) ou pioglitazona (PIO 5 - 50 mg/kg, i.p.) 30 min antes da aplicação da Cg e a inflamação foi analisada após 4 h. Após a escolha da melhor dose que inibiu o influxo de leucócitos e/ou a exsudação procedeu-se a análise da curva tempo-resposta para ambos os fármacos. Desta forma, uma das doses acima foi escolhida e administrada em diferentes grupos de
animais em diferentes períodos de tempo (1 - 4 h) antes da aplicação do agente flogístico e a inflamação foi analisada 4 h após (Fig. 2A).
Na segunda fase (48 h) da resposta inflamatória induzida pela Cg, também realizou-se curvas dose e tempo-resposta. Desta forma, na análise da curva dose-resposta diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses da ROSI (5 - 20 mg/Kg, i.p.) ou PIO (10 - 50 mg/Kg, i.p.) 30 min antes da aplicação da Cg e a inflamação foi analisada após 48 h. Em seguida, após a escolha da melhor dose que inibiu o influxo celular e/ou a exsudação, esta dose foi administrada em outros grupos de animais em diferentes períodos de tempo (1 - 24 h) antes da aplicação do agente flogístico e a inflamação foi analisada 48 h após (Fig. 2B).
Uma vez que a pioglitazona nas doses avaliadas, quando administrada 30 min antes da Cg não foi efetiva na inibição de leucócitos e/ou a exsudação, outro protocolo foi realizado para este fármaco. Desta forma, outros grupos de animais foram tratados com a PIO (10 e 20 mg/Kg, i.p.), administrada em duas doses, a primeira 30 min antes da aplicação da Cg e a segunda dose 24 h após (Fig. 2D). Além disso, também outros diferentes grupos de animais foram tratados com a PIO (10 e 20 mg/Kg, i.p.), administrada em quatro doses, a primeira 30 min antes da aplicação da Cg e as outras 3 doses administradas com intervalo de 12 h. A inflamação foi analisada 48 h após a aplicação do agente flogístico (Fig. 2C).
Para avaliar a exsudação os animais foram tratados com solução corante azul de Evans (25 mg/kg, i.v) 10 min antes dos experimentos.
Finalmente, após a escolha da melhor dose e tempo de tratamento prévio pelo qual os fármacos inibiram o influxo de leucócitos e a exsudação, estudou-se o efeito da ROSI sobre a atividade das enzimas MPO e ADA, e sobre as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx), do TNF-α, da IL-1β, da IL-17A e do VEGF-α, bem como avaliou-se o efeito da PIO sobre a atividade das enzimas MPO, ADA, SOD, CAT, GPx e GST e sobre as concentrações de TBARS. O efeito dos fármacos sobre estes parâmetros foi observado 4 e 48 h após a indução da pleurisia.
Para todos os parâmetros inflamatórios estudados, paralelamente, grupos de animais foram tratados com: 1) salina estéril (NaCl 0,9%) (grupo-controle negativo), 2) carragenina 1% (grupo- controle positivo), 3) dexametasona (0,5 mg/Kg, i.p.) + Cg e 4) indometacina (5 mg/Kg, i.p.) + Cg. Estes últimos grupos foram utilizados para compararmos o efeito das glitazonas com os fármacos de referência.
Figura 2: Protocolo experimental da pioglitazona. (A) Pioglitazona (PIO) admininistrada nas doses de 5 a 50 mg/kg, i.p. 30 min antes da aplicação da carragenina e a inflamação foi analisada após 4 h. (B) PIO administrada nas doses de 10 a 50 mg/Kg, i.p., 30 min antes da aplicação da carragenina e a inflamação foi analisada após 48 h. (C) PIO administrada nas doses de 10 ou 20 mg/Kg, i.p., em quatro doses, a primeira 30 min antes da aplicação da carragenina e as outras 3 doses administradas com intervalo de 12 h, e a inflamação foi analisada 48 h após. (D) PIO administrada nas doses de 10 ou 20 mg/Kg, i.p., em duas doses, a primeira 30 min antes da aplicação da carragenina e a segunda dose após 24 h, e a inflamação foi analisada 48 h após. (↓) Indica os intervalos de tratamento com a pioglitazona, (▲) tempo da indução da pleurisia (0) aplicação da carragenina (Cg).
Os diferentes grupos de animais utilizados para contemplar o desenho experimental deste estudo estão descritos a seguir:
Rosiglitazona
a) Pleurisia 4 h
Grupos 1-5: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de rosiglitazona (ROSI 0,5 - 10 mg/kg), administrada 30 min antes da carragenina (n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)) (n = 3), grupo controle- negativo (salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 6-8: Curva tempo-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com uma única dose de rosiglitazona administrada em diferentes períodos de tratamento prévio (2, 4, e 8 h) n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 9-16: Efeito da rosiglitazona [ROSI (5 mg/Kg) administrada 30 min antes da Cg] sobre a atividade das enzimas MPO e ADA, e sobre as concentrações de NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A e VEGF- na inflamação induzida pela Cg (n = 5 para cada parâmetro). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
b) Pleurisia 48 h
Grupos 17-19: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de rosiglitazona (ROSI 5 - 20 mg/kg), administrada 30 min antes da carragenina (n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 20-22: Curva tempo-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com uma única dose de rosiglitazona administrada em diferentes períodos de tratamento prévio (2, 4, e 8 h) n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 23-29: Efeito da rosiglitazona (ROSI 10 ou 20 mg/Kg) administrada 30 min antes da Cg sobre a atividade das enzimas MPO e ADA, e sobre as concentrações de NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A e VEGF- na inflamação induzida pela carragenina (n = 5 para cada parâmetro). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Pioglitazona a) Pleurisia 4 h
Grupos 30-33: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de pioglitazona (PIO 5 - 50 mg/kg), administrada 30 min antes da carragenina (n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg1%)] (n = 3), grupo controle- negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
Grupos 34-36: Curva tempo-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com uma única dose de pioglitazona (i.p.) administrada em diferentes períodos de tratamento prévio (2, 4, e 8 h) n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [Carragenina (Cg1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
Grupos 37-45: Efeito da pioglitazona (PIO 20 mg/Kg), administrada 30 min antes da Cg sobre a atividade das enzimas MPO, ADA, SOD, CAT, GPx e GST e sobre as concentrações de TNF- , IL-1 e TBARS na inflamação induzida pela carragenina (n = 5 para cada parâmetro). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle- negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
b) Pleurisia 48 h
Grupos 46-48: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de pioglitazona (PIO 10 - 50 mg/kg), administrada 30 min antes da carragenina (n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril - NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 49-50: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com pioglitazona administrada em 4 doses (PIO 10 ou 20 mg/kg), a primeira dose administrada 30 min antes da carragenina e as outras 3 doses com intervalo de 12 h (n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle- negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
Grupos 51-52: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com pioglitazona administrada em 2 doses (PIO 10 ou 20 mg/kg), a primeira dose administrada 30 min antes da carragenina e a segunda dose com intervalo de 24 h (n = 5 para cada grupo). Grupo
controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle- negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
Grupos: 53-61: Efeito da pioglitazona (PIO 20 mg/Kg (i.p.) administrada 30 min antes da Cg, e mais uma segunda dose de 20 mg/Kg, 24 h após a primeira) sobre a atividade das enzimas MPO, ADA, SOD, CAT, GPx e GST e sobre as concentrações de TNF- , IL- 1 e TBARS na inflamação induzida pela carragenina (n = 5 para cada parâmetro). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
3.2 PROCEDIMENTO ANESTÉSICO
Neste protocolo experimental, foi utilizado para a anestesia, pentobarbital (60 mg/Kg, i.p.). A anestesia foi realizada para a administração da solução de azul de Evans (25 mg/kg, i.v.).