Ziliani da Silva Buss
ANÁLISE DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO E/OU ANTIOXIDANTE DA ROSIGLITAZONA E DA PIOGLITAZONA
NO MODELO DE PLEURISIA MURINA INDUZIDA POR CARRAGENINA
Tese submetida ao Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutor em Ciências Médicas
Orientador: Profa. Dra. Tânia Silvia Fröde
Florianópolis 2012
Este trabalho é dedicado às minhas queridas mãe e irmãs.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que sempre me guiou, por um caminho de realizações e muito sucesso, mesmo que, muitas vezes, este caminho tenha parecido sinuoso.
À minha mãe, Zilda Vieira da Silva, irmãs, Jaiciele da Silva Buss Vidal, Carluce e Carlizi da Silva Buss, cunhado, Vilmar Isaurino Vidal, e sobrinho, Igor, pelo amor incondicional, incentivo e apoio, minha gratidão.
Ao Laudir Zacarias Cândido (Nino), meu eterno namorado, pelo carinho, confiança, paciência, companheirismo e amor, sentimentos tão importantes.
À minha orientadora, Profa. Dra. Tânia Silvia Fröde, por sua confiança, pela formação científica impecável, ensinamentos preciosos e amizade sincera.
Às minhas amigas Cileide Brasil da Silva e Raquel Conceição Monteiro, e seus respectivos esposos Felipe Elpídio e Gustavo Monteiro pelo carinho, pelo apoio incondicional, momentos de alegrias e desabafos, fundamentais para mais esta etapa.
À minha amiga Eliana Maria de Almeida mesmo que fisicamente longe, sempre esteve por perto, pelo incentivo, apoio, boas idéias e muito carinho.
Ao grupo de pesquisa da Profa. Dra Tânia Silvia Fröde, do qual faço e farei parte. Em especial aos meus colegas de laboratório: Patrícia, Gustavo, Eduardo, Júlia, Silvana, Rafael, Stella, Jucélia, Vanessa, Geison, Bruno e Marina pelo agradável e inesquecível convívio, pela amizade sincera e pelas fundamentais “troca de experiências”.
À Profa. Dra. Iara dos Santos Medeiros pelas contribuições fundamentais nas publicações referentes a esta Tese.
Aos colegas do curso de Pós-Graduação, pelas aulas enriquecedoras e pela busca de objetivos comuns.
À CAPES pela concessão da bolsa e a Prefeitura Municipal de Florianópolis pela concessão da Licença, para que pudesse dedicar-me integralmente a mais esta etapa da minha formação.
À Universidade Federal de Santa Catarina, aos professores, funcionários do Departamento de Pós-graduação em Ciências Médicas pela oportunidade de conviver e adquirir novos e importantes conhecimentos. Agradeço a todas as pessoas que me dedicaram seu tempo e esforço, pelas críticas que me ajudaram e certamente ainda ajudarão muito. Enfim, a todos que fazem parte de minha vida, o meu muito obrigada.
“O que faz a gente ser grande é ser como o mar: incansável na sua procura pela onda perfeita, até descobrir que a perfeição está na própria busca”
RESUMO
Introdução: As Glitazonas (rosiglitazona e pioglitazona) são fármacos utilizados para o tratamento do diabetes tipo II. Estes fármacos são agonistas do receptor ativados por proliferadores de peroxissomos gama (PPAR- ) e induzem à transcrição de genes relacionados ao metabolismo glicídico e lipídico e à expressão de proteínas produzidas e/ou liberadas no processo inflamatório. Objetivos: 1) Avaliar o efeito anti-inflamatório da rosiglitazona e da pioglitazona administrados por via intraperitoneal (i.p.), na primeira (4 h) e na segunda (48 h) fases da resposta inflamatória induzida pela carragenina (Cg) no modelo da pleurisia murina. 2) Avaliar o efeito antioxidante da pioglitazona utilizando-se o mesmo modelo experimental. Delineamento do estudo: Trata-se de um estudo experimental, prospectivo e controlado. Métodos: Neste estudo foram utilizados camundongos albinos Swiss de 1 mês de idade e pesando de 18-20 g. Diferentes grupos de animais foram tratados previamente com a rosiglitazona (0,5 - 10 mg/Kg) ou a pioglitazona (5 - 50 mg/Kg), em diferentes períodos de tempo (0,5 - 2 h) antes da Cg. Apenas para o grupo de animais destinado a avaliação da exsudação e a contagem total e diferencial dos leucócitos no lavado da cavidade pleural foi administrada 0,2 mL da solução de azul de Evans (25 mg/Kg, i.v.), 10 min antes da administração da Cg. Os parâmetros inflamatórios avaliados no lavado da cavidade pleural para ambos os fármacos foram: leucócitos, exsudação, atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO), adenosina-deaminase (ADA), concentrações do fator de necrose tumoral alfa (TNF- ) e da interleucina-1 beta (IL-1 ). Além disso, para a rosiglitazona avaliou-se também as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx), interleucina-17A (IL-17A) e fator de crescimento endotelial vascular-alfa (VEGF- ), no lavado da cavidade pleural. Para a pioglitazona os parâmetros estudados para avaliar o estresse oxidativo foram: atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST), no sangue total, bem como a peroxidação lipídica (TBARS) no lavado da cavidade pleural. A análise estatística utilizada foi o teste T de Student ou ANOVA (Newman Keuls). Além disso, para avaliar as possíveis correlações utilizou-se o teste de Pearson. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. Resultados: A rosiglitazona, em ambas as fases (4 e 48 h) da pleurisia induzida pela Cg, inibiu os leucócitos (P < 0,01), a exsudação (P < 0,01), a atividade das enzimas ADA e MPO (P < 0,05) e as
concentrações de NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A e VEGF- (P < 0,05). Já a pioglitazona, na pleurisia 4 e 48 h reduziu os leucócitos (P < 0,01), a atividade da ADA (P < 0,01) e as concentrações de TNF- e IL-1 (P < 0,01). A atividade da MPO foi inibida pela pioglitazona somente na pleurisia 4 h (P < 0,01). Na avaliação dos parâmetros relacionados ao estresse oxidativo, a pioglitazona na pleurisia 4 e 48 h reduziu a atividade das enzimas SOD, CAT, GPx e GST (P < 0,05) e as concentrações de TBARS (P < 0,05). Conclusão: A atividade anti-inflamatória da rosiglitazona e da pioglitazona parece estar relacionada com a redução do influxo de células ativadas e consequente redução da liberação e/ou produção de mediadores inflamatórios. Além disso, o efeito antioxidante observado para a pioglitazona deve-se em parte pela inibição de enzimas antioxidantes e marcadores de peroxidação lipídica.
Palavras-chave: rosiglitazona, pioglitazona, citocinas, óxido nítrico, enzimas anti-oxidantes
ABSTRACT
Introduction: The glitazones (rosiglitazone and pioglitazone) are drugs used to treat type II diabetes. These drugs are receptor agonists of peroxisome proliferator-activated gamma (PPAR- ) and induce the transcription of genes related to glucose and lipid metabolism and expression of inflammatory proteins produced and/or released in the inflammatory process. Objectives: 1) To evaluate the anti-inflammatory effect of rosiglitazone and pioglitazone administered intraperitoneally (i.p.) in the first (4 h) and second (48 h) phases of the inflammatory response induced by carrageenan (Cg) in the murine model of pleurisy. 2) To evaluate the antioxidant effect of pioglitazone using the same experimental model. Study desings: This is an experimental, prospective and controlled study. Methods: In this study it was used Swiss albino mice, 1 month old and weighing 18-20 g. Different groups of animals were pretrated with rosiglitazone (0.5 -10 mg/Kg) or pioglitazone (5 - 50 mg/Kg) in different periods of time (0.5 – 2 h) prior to Cg. To evaluate the exudation a group of animals received 0.2 mL of Evans blue (25 mg/Kg) 10 min before administration of Cg. The studied inflammatory parameters evaluated were: leukocytes, exudation, activities of myeloperoxidase (MPO) and adenosine deaminase (ADA), concentrations of tumor necrosis factor (TNF- ) and interleukin-1 beta (IL-1 ). In addition for rosiglitazone it was evaluated concentrations of nitric oxide metabolites (NOx), interleukin-17A (IL-17A) and vascular endothelial growth factor-alpha (VEGF- ) in the pleural fluid. For pioglitazone the following parameters of oxidative stress were evaluated: activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), gluthatione S-transferase (GST), whole blood, as well as lipid peroxidation (TBARS) in pleural fluid. The statistical analysis used was Student T test or ANOVA (Newman Keuls). In addition, to evaluate the correlations it was used Pearson. Values of P < 0.05 were considered significant. Results: Rosiglitazone in both phases (4 and 48 h) of pleurisy induced by Cg inhibited leukocytes (P < 0.01), exudation (P < 0.01), activities of ADA and MPO (P < 0.05), and concentration of NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A and VEGF- (P < 0.05). Pioglitazone in pleurisy 4 and 48 h also reduced leukocytes (P < 0.01), activity of ADA (P < 0.01), and concentration of TNF- and IL-1 (P < 0.01). The activity of MPO was inhibited by pioglitazone only in the pleurisy 4 h (P < 0.01). In the evaluation of parametes related to oxidative stress in pleurisy 4 and 48 h, pioglitazone
reduced activities of SOD, CAT, GPx and GST (P < 0.05), and concentrations of TBARS (P < 0.05). Conclusion: The anti-inflamatory effects of rosiglitazone and pioglitazone appears to be related to reducing the influx of activated cells and consequent reduction of release and/or production of inflammatory mediators. The antioxidant effect observed for pioglitazone is may be due to in part by inhibiton of antioxidant enzymes and markers of lipid peroxidation.
Keywords: rosiglitazone, pioglitazone, cytokines, nitric oxide, enzymes antioxidants
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura química da rosiglitazona e pioglitazona ... 25 Figura 2: Protocolo experimental da pioglitazona. ... 41 Figura3: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) (0,5 - 10 mg/kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 4 h, em camundongos. ... 55 Figura4: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) (0,5 - 10 mg/kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 4 h, em camundongos. ... 56 Figura5:Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) (5 - 20 mg/kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 48 h, em camundongos. ... 57 Figura7:Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO). ... 60 Figura 8: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre a atividade da adenosina-deaminase (ADA). ... 62 Figura 9: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). ... 64 Figura 10: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre as concentrações do Fator de necrose tumoral-alfa (TNF- ). ... 66 Figura 11: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre as concentrações da Interleucina-1Beta (IL-1 ). ... 68 Figura 12: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre as concentrações da Interleucina-17A (IL-17A). ... 70 Figura 13: Efeito do maleato de rosiglitazona (ROSI) sobre as concentrações do fator de crescimento endotelial vascular-alfa
(VEGF-). ... 72 Figura 14: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) (5 - 50 mg/kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 4 h, em camundongos ... 76 Figura 15: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) (5 - 50 mg/kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 4 h, em camundongos ... 77 Figura 16: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) (20 mg/kg (1 dose, 2 doses a cada 24 h ou 4 doses a cada 12 h), i.p.) sendo a primeira ou única dose administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 48 h, em camundongos ... 78 Figura 17: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) (20 mg/kg (1 dose, 2 doses a cada 24 h ou 4 doses a cada 12 h), i.p.) sendo a primeira
ou única dose administrada 30 min antes da indução por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 48 h, em camundongos ... 79 Figura 18: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO). ... 80 Figura 19: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre a atividade da adenosina-deaminase (ADA). ... 81 Figura 20: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre as concentrações do Fator de Necrose Tumoral- (TNF- ). ... 83 Figura 21: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre as concentrações da Interleucina 1 (IL-1 ). ... 84 Figura 22: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO 20 mg/Kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução da inflamação por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 4 h sobre a atividade das enzimas antioxidantes. ... 87 Figura 23: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO 20 mg/Kg, i.p.) administrada 30 min antes da indução da inflamação por carragenina (1%/cav.) na pleurisia 4 h sobre a atividade das enzimas antioxidantes. ... 88 Figura 24: Efeito da PIO administrada em 2 doses de 20 mg/kg (i.p.), sendo a primeira dose administrada 30 min antes da indução da inflamação por carragenina (1%/cav.) e a segunda dose 24 h após, na pleurisia 48 h sobre a atividade das enzimas antioxidantes. ... 89 Figura 25: Efeito da PIO administrada em 2 doses de 20 mg/kg (i.p.), sendo a primeira dose administrada 30 min antes da indução da inflamação por carragenina (1%/cav.) e a segunda dose 24 h após, na pleurisia 48 h sobre a atividade das enzimas antioxidantes. ... 90 Figura 26: Efeito do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre as concentrações de TBARS. ... 91 Figura 27: Esquema do efeito anti-inflamatório comum da rosiglitazona e da pioglitazona. ...102 Figura 28: Esquema do efeito anti-inflamatório distinto da rosiglitazona. ...103 Figura 29: Esquema do efeito antioxidante da pioglitazona. ...104
ANEXOS
ANEXO A - Protocolo de aprovação no Comitê de Ética na Experimentação com Animais (CEUA/UFSC) (PP00027)...131 ANEXO B - Protocolo de aprovação no Comitê de Ética na Experimentação com Animais (CEUA/UFSC) (PP00181)...132 ANEXO C - Resumos apresentados em anais de congressos...133 ANEXO D – Artigos publicados...135
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 15D-PGJ2 15-Deoxi Prostaglandina J2
AR Receptor para adenosina
ADA Adenosina-deaminase
AP-1 Fator ativador da proteína 1
CAT Catalase
CBP Proteína ligante em resposta a ativação do AMPc
Cg Carragenina
CCL5/RANTES Quemocina secretada, expressa e regulada sob ativação de linfócitos T normais
CCR Receptor de quemocina CC
CV Coeficiente de Variação
CXCL8 Fator Quimiotático Derivado de Macrófagos CXCR Receptor de quemocinas CXC
CXR Receptor de quemocina CX
DDS Dextran Sulfato de Sódio
DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica
DRIP205 proteína que interage com o receptor da vitamina D E-Selectinas Moléculas de Adesão Endotelial tipo Selectina
ELISA Enzimaimunoensaio
EGF Fator de Crescimento Endotelial ERNs Espécies Reativas de Nitrogênio EROs Espécies Reativas de Oxigênio
GM-CSF Fator estimulante de granulócitos e macrófagos
GPx Glutationa Peroxidase GST Glutationa S-transferase H2O2 Peróxido de hidrogênio i.p. Intra-peritoneal i.pl. Intra-pleural i.v. Intra-venoso
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular tipo 1
IFN- Interferon-gama
IL Interleucina
IL-1Ra Antagonista natural do receptor de IL-1β L-NAME L- nitro arginina metil éster
Linfócitos T Linfócitos T Gama/Delta LPS Lipopolissacarídeo bacteriano
MDA Malondialdeído
MAPK Proteína Quinase Ativada por Mitógeno MMP-9 Metaloproteinase-9
MPO Mieloperoxidase
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NFAT Fator nuclear de ativação de linfócitos T
NF B Fator de transcrição nuclear kappa B
NK Células Natural Killer
NKT Linfócitos T citotóxicos
NO Óxido Nítrico
NOx Metabólitos do Óxido Nítrico
NOSi / I Enzima óxido nítrico sintase induzida ou tipo I NOSe / II Enzima óxido nítrico sintase endotelial ou tipo II NOSn / III Enzima óxido nítrico sintase neuronal ou tipo III NO2 -Nitrito NO3 -Nitrato O2 Oxigênio molecular O2- Ânion superóxido OH- Radical hidroxil ONOO- Peroxinitrito OVA Ovalbumina p/v Peso/volume PMNs Polimorfonucleares
PPAR Receptor ativado por Proliferadores de Peroxissomos PPRE “Peroxisome Proliferator Response Element”
RANTES Quemocina secretada, expressa e regulada sob ativacao de linfocitos T normais
RXR Receptor X para retinoide
SOD Enzima Superóxido Dismutase
SRC-1 proteína co-ativadora 1 do receptor de esteróide STAT-1 Fator estimulador e ativador da transcrição-1 TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico TGF Fator de Crescimento Transformante
TH Linfócitos T helper
TIF-2 fator intermediário da transcrição 2 TNF- Fator de necrose tumoral alfa TReg CélulasT reguladoras
TRAP220 Proteína associada ao receptor do hormônio da tireóide
v/v volume/volume
VCAM-1 Molécula de adesão vascular tipo 1 VEGF- Fator Vascular Endotelial alfa VSR Vírus Sincicial Respiratório 15D-PGJ2 15-Deoxi Prostaglandina J2
AR Receptor para adenosina
ADA Adenosina-deaminase
AP-1 Fator ativador da proteína 1
CAT Catalase
CBP Proteína ligante em resposta a ativação do AMPc
Cg Carragenina
linfócitos T normais
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...23
1.1 RECEPTORES ATIVADOS POR PROLIFERADORES DE PEROXISSOMOS...23
1.2 AGONISTAS DOS PPAR ...24
1.2 O PROCESSO INFLAMATÓRIO...26
1.3 TERAPIA DAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS...34
1.4 MODELOS DE INFLAMAÇÃO...35 1.5 JUSTIFICATIVA...37 1.6 HIPÓTESES...37 2 OBJETIVO GERAL...38 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...38 3 METODOLOGIA...39 3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO...39 3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL...39 3.2.1 Animais...39 3.2.2. Desenho experimental...39 3.2 PROCEDIMENTO ANESTÉSICO...44
3.3 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS...44
3.4 PLEURISIA MURINA INDUZIDA PELA CARRAGENINA...44
3.5 CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DOS LEUCÓCITOS...45
3.5.1 Coloração dos esfregaços celulares...45
3.6 DETERMINAÇÃO DA EXSUDAÇÃO...46
3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE...46
3.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ADENOSINA-DEAMINASE...47
3.9 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DOS METABÓLITOS DO ÓXIDO NÍTRICO...47
3.10 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE
CITOCINAS...48
3.11 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS
ANTIOXIDANTES...48 3.11.1 Determinação da atividade superóxido dismutase...49 3.11.2 Determinação da atividade da catalase...49 3.11.3 Determinação da atividade da glutationa peroxidase...50 3.11.4 Determinação da atividade da glutationa S-transferase...50
3.12 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DAS
SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO...50 3.13 FÁRMACOS E REAGENTES...51 3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA...52 4 RESULTADOS...53 4.1 RESULTADOS DO MALEATO DE ROSIGLITAZONA...53 4.1.1 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre a contagem total e diferencial de leucócitos e exsudação...53 4.1.2 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre a atividade da MPO...59 4.1.3 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre a atividade da ADA...61 4.1.4 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre as concentrações de NOx...63 4.1.5 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre as concentrações do TNF-α...65
4.1.7 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre as concentrações da IL-1β...67 4.1.8 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre as concentrações da IL-17A...69 4.1.9 Efeito do maleato de rosiglitazona sobre as concentrações do VEGF-α...71 4.2 RESULTADOS DO CLORIDRATO DE PIOGLITAZONA...73 4.2.1 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre os leucócitos e a exsudação...73 4.2.2 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre a atividade da MPO...74 4.2.3 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre a atividade da ADA...74 4.2.4 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre as concentrações do TNF-α...82 4.2.5 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre as concentrações de IL-1β...82 4.2.6 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GST...85 4.2.7 Efeito do cloridrato de pioglitazona sobre as concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico...85 5 DISCUSSÃO...92 6 CONCLUSÃO...101 REFERÊNCIAS………...………...105
1 INTRODUÇÃO
1.1 RECEPTORES ATIVADOS POR PROLIFERADORES DE PEROXISSOMOS
Nos últimos anos tem sido bastante estudado os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs), que são membros da família dos fatores de transcrição nuclear, e incluem os receptores hormonais da tireóide, esteróides e ácido retinóico, além de outros receptores denominados de receptores órfãos.1
Os PPARs ativam a expressão gênica por meio da formação de heterodímeros com outro receptor nuclear, o receptor do ácido 9-cis retinóico (RXR).2 O heterodímero PPAR-RXR se liga a sequências específicas do DNA localizadas na região reguladora ou promotora de genes-alvo, conhecidas como elementos responsivos aos PPARs (PPRE - “Peroxisome Proliferator Response Element”), e, quando ativados por agonistas, estimulam a transcrição gênica.3 Este mecanismo mediado pela ligação do receptor à sequência específica de DNA é conhecido como transativação gênica e modula a transcrição de genes envolvidos no controle do metabolismo de lipídeos, na homeostasia da glicose, na diferenciação, na proliferação e na apoptose celular, bem como na resposta inflamatória.2,4,5
Além disso, estudos indicam que os agonistas dos PPARs são agentes que possuem propriedades anti-inflamatórias, uma vez que inibem a expressão de citocinas pró-inflamatórias, quemocinas e moléculas de adesão, entre outros, por meio de outro mecanismo biológico denominado de transrepressão.6-8 A transrepressão também denominada regulação negativa é o mecanismo pelo qual agonistas dos PPARs ativam receptores celulares e inibem a liberação de substâncias como, por exemplo, mediadores pró-inflamatórios.9 Existem diferentes hipóteses que demonstram o efeito da interação entre agonistas dos PPARs e receptores celulares. Dentre estas hipóteses destacam-se: 1) proteínas co-ativadoras como, por exemplo, a proteína ligante em resposta a ativação do AMPc (CBP) e a proteína co-ativadora 1 do receptor de esteróide (SCR1) ligam-se aos PPARs, mas também a outros receptores nucleares compartilhando desta forma o mesmo receptor. Assim, a transcrição mediada pela ativação dos PPARs é prejudicada9, 2) o heterodímero PPAR-RXR liga-se a outros fatores de transcrição tais como o fator nuclear appa-B (NF- B), o fator ativador da proteína 1 (AP-1), o fator estimulador e ativador de transcrição-1 (STAT-1) e o
fator nuclear de ativação de linfócitos T (NFAT) promovendo o que denomina-se de antagonismo ou acoplamento cruzado e desta forma a transcrição mediada pela ativação dos PPARs também é inibida9-13 e 3) o heterodímero PPAR-RXR é capaz de inibir a fosforilação de algumas proteínas kinases (MAPKs) promovendo a inibição da cascata de ativação destas e consequente inibição da transcrição de mediadores promovida pela ativação dos PPARs.9
Até o presente 3 subtipos de PPARs foram identificados e designados de: alfa (PPAR ), beta/delta (PPAR / ) e gama (PPAR ).14 Os PPAR são expressos em diversos tipos celulares incluindo as células vasculares endoteliais, da musculatura lisa e cardíaca, hepáticas, pancreáticas, e mesangiais renais, do tecido epitelial do endométrio, do cólon e das vias aéreas, bem como, células hematopoiéticas e adipócitos.15-17 Devido ao fato de estarem presentes em diferentes células, a ativação do PPAR por agonistas pode desencadear efeitos tóxicos, como por exemplo, infarto agudo do miocárdio.18-19
1.2 AGONISTAS DOS PPAR
Os PPAR possuem ligantes endógenos e exógenos, o principal ligante endógeno é o derivado da prostaglandina D2 [15-Deoxi-Delta-12,14-prostaglandina J2 (15D-PGJ2)].20 E, dentre os ligantes exógenos (sintéticos), destacam-se as tiazolidinedionas (glitazonas) que são fármacos antidiabéticos utilizados na clínica no controle do diabetes tipo II.21 O fármaco pioneiro deste grupo, a troglitazona, foi retirada do mercado devido à sua hepatotoxicidade.22 Outros dois fármacos desta classe são a rosiglitazona e a pioglitazona, estas apresentam como característica química comum um anel diona, que confere as mesmas a atividade anti-hiperglicêmica e o restante da molécula é responsável pela especificidade, farmacodinâmica e farmacocinética21 (Fig. 1). Ambas glitazonas ligam-se em torno de 99% às proteínas plasmáticas. A rosiglitazona apresenta um tempo de meia-vida plasmática (t½) de 100-150 h, incluindo seus metabólitos, enquanto a pioglitazona apresenta t½ de 16-24 h, incluindo seus metabólitos.23
rosiglitazona pioglitazona Figura 1: Estrutura química da rosiglitazona e pioglitazona
As glitazonas têm como mecanismo de ação a ligação aos receptores nucleares PPAR promovendo uma mudança conformacional no receptor, que permite a ligação com o RXR e recrutamento de co-ativadores tais como: SRC-1, CBP, fator intermediário da transcrição 2 (TIF2), proteína associada ao receptor do hormônio da tireóide (TRAP220) e proteína que interage com o receptor da vitamina D (DRIP205).24
A interação deste complexo heterodímero com regiões nucleares responsivas determinará a transcrição de aproximadamente 500 genes que estão relacionados principalmente ao metabolismo lipídico, glicídico e diferenciação celular.25 Outro mecanismo de ação do PPAR independeria de ligação direta com regiões responsivas do DNA e resultaria em repressão à transcrição gênica. Este mecanismo de ação estaria associado à atividade inflamatória e potencialmente anti-aterogênica do PPAR pela repressão do NF- B. Este fator é responsável pela transcrição de diferentes citocinas, moléculas de adesão, metaloproteinases e outras proteínas que participam do processo aterosclerótico.26 Alguns dos efeitos fisiológicos das glitazonas já estão bem descritos, e incluem a redução da resistência a insulina27, a indução da diferenciação de adipócitos28, a inibição do fator vascular endotelial (VEGF)29, alteração nas concentrações de leptina30 e adiponectina31, inibição de citocinas pró-inflamatórias32-33, incluindo o fator de necrose tumoral α (TNF-α), e interleucina- 6 (IL-6).34
E neste contexto, os PPAR são ativados tanto em processos fisiológicos, como em doenças. Dentre os eventos pelos quais há ativação dos PPAR citam-se: disfunção microvascular e diabetes35, diabetes e síndrome metabólica36-37, aterosclerose38, câncer de próstata e cólon39, câncer de mama40, asma e doença pulmonar obstrutiva crônica41, entre outras.
Vários outros estudos in vivo e in vitro demonstraram que agonistas do PPAR [(15PGE2 - ligante endógeno), ciglitazona e troglitazona] possuem propriedades anti-inflamatórias dentre eles
citam-se a inibição: da liberação do TNF- , do fator estimulador do crescimento de granulócitos e macrófagos (GM-CFS), da IL1- , da IL-6 e de quemocinas CXCL8 (IL-8) e CCL5 (RANTES), em células do epitélio pulmonar humano (A 549) infectadas com vírus sincicial respiratório (VSR).42
Tendo em vista que os resultados destes estudos demonstraram que a ativação dos PPAR parece ser importante na patogênese de doenças envolvendo mecanismos inflamatórios, vale a pena comentar sobre este evento fisiológico, que em algumas situações pode levar a lesão tecidual e a disfunção de órgãos.
1.2 O PROCESSO INFLAMATÓRIO
O conhecimento nos últimos anos de características distintas do processo inflamatório, em relação à participação de diversos mediadores, resultou no desenvolvimento de novos fármacos mais eficazes de acordo com a fisiopatogenia do processo.
A resposta inflamatória é um evento complexo que está relacionado com doenças de caráter agudo (alergias), diversas manifestações que abrangem desde alterações metabólicas (diabetes), auto-imunes (artrite reumatóide), neurogênica (enxaqueca) e degenerativas (aterosclerose). A reação envolve o reconhecimento do agente ou estímulo lesivo, para sua posterior destruição e tentativa de reconstruir o tecido lesado.43 O reconhecimento desencadeia resposta imune que resulta na ativação de células e na liberação de diversos mediadores responsáveis pela resposta inflamatória. No entanto, se a destruição do agente agressor e o processo de reparo não ocorrerem de maneira eficiente e sincronizada, a resposta inflamatória pode levar a uma lesão tecidual persistente induzida pelo acúmulo de leucócitos, colágeno entre outras substâncias que podem ser prejudiciais ao organismo.44
Na resposta inflamatória ocorre uma cascata de eventos. Inicialmente ocorre uma fase aguda, de duração variável, na qual há vasodilatação local e aumento da permeabilidade capilar, seguida de uma caracterizada por infiltração de leucócitos e de células fagocíticas e posteriormente, regeneração tecidual ou fibrose.44
De acordo com o estímulo poderá ocorrer resposta sistêmica que envolve a participação de outros órgãos e/ou sistemas. O exemplo
típico destes casos é o choque séptico cuja evolução, se não tratada adequadamente gera uma resposta inflamatória que resultará em falência múltipla de órgãos.44 Após estímulo, a resposta inflamatória é caracterizada por uma série de eventos na tentativa de reconstituir o tecido lesado por meio da ativação de células mesenquimatosas, incluindo hipertrofia, hiperplasia e ativação de matriz extracelular. Posteriormente, a injúria inflamatória é mantida e induz o processo de cicatrização que frequentemente reconstitui o tecido lesado com tecido fibroso não especializado.44
Durante o processo inflamatório, diversas células abandonam o compartimento vascular e migram para os tecidos não-linfóides, onde exercem inúmeras funções biológicas que auxiliam na defesa do hospedeiro.45
O sistema fagocítico mononuclear é composto por macrófagos e os monócitos que participam na defesa do sistema imune do hospedeiro, desenvolvendo funções distintas. Os macrófagos têm a função de remover antígenos particulados e atuar como células apresentadoras de antígeno, por meio da internalização e apresentação de antígenos aos linfócitos T.46 Os monócitos encontram-se circulando no sangue e, quando necessário, migram para diferentes órgãos e cavidades do corpo em reposta a um estímulo lesivo, diferenciando-se em macrófagos.47
Os leucócitos do tipo polimorfonucleares (PMN) são as primeiras células ativadas na defesa imune do hospedeiro contra a infecção. Estas células migram e infiltram-se no sítio inflamatório por gradientes quimiotáticos, onde juntamente com os macrófagos, fagocitam e destroem o agente agressor.48-49 A destruição do agente estranho ocorre por meio da liberação de enzimas hidrolíticas, proteínas bactericidas e espécies reativas de oxigênio (EROs), muitas vezes, estocadas nos grânulos dos polimorfonucleares.49 Dentre estas enzimas hidrolíticas, pode-se destacar a mieloperoxidase (MPO), uma protease presente nos grânulos azurófilos de neutrófilos e em menor quantidade nas células mononucleares.49-52
A MPO juntamente com o sistema nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase estão envolvidas na liberação de EROs. O NADPH oxidase reduz o oxigênio molecular ao radical ânion superóxido.49 A seguir, a enzima superóxido dismutase (SOD) converte o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio, o qual destroi as bactérias diretamente ou após sua conversão em íons hidroxila ou ácido hipocloroso.49,53 Além disso, o ácido hipocloroso é considerado potente agente microbicida que possui papel importante na defesa do hospedeiro contra a invasão de bactérias, fungos e vírus.51,54 Em
algumas doenças inflamatórias, como na artrite reumatoide, observa-se aumento da infiltração de neutrófilos com consequente aumento da atividade da MPO.55 Estudos demonstraram também que a MPO pode ser utilizada como marcador de neutrofilia em condições de inflamação e sepse.56 Além disso, observou-se que a concentração de MPO também está elevada no escarro induzido e no lavado bronco-alveolar de pacientes asmáticos.57,58 Neste contexto, o aumento do influxo de polimorfonucleares, em especial de neutrófilos ativados pode promover importante lesão tecidual e vascular.59
Outro mediador enzimático importante e que também está envolvido na resposta inflamatória é a adenosina-deaminase (ADA). Esta enzima é liberada principalmente por linfócitos ativados60 e também possui papel importante na maturação e na ativação de monócitos e linfócitos.61 A ADA participa do metabolismo das purinas catalisando irreversivelmente a deaminação da desoxiadenosina e adenosina em desoxinosina e inosina, respectivamente. A atividade desta enzima ocorre por meio da ação das isoenzimas denominadas ADA-1 e ADA-2.62
As respostas biológicas para esta enzima são mediadas por quatro receptores distintos (A1, A2A, A2B e A3) que estão acoplados a proteína G e a estimulação de cada receptor induz a uma resposta biológica distinta, podendo desencadear uma ação pró ou anti-inflamatória.63-65 Os receptores para adenosina são expressos em neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastócitos, linfócitos T e B, monócitos, plaquetas, macrófagos, células dendríticas, células do epitélio brônquico, células da musculatura lisa dos brônquios, fibroblastos e células endoteliais.66 O fato desses receptores estarem presentes em muitos tipos de células envolvidas na inflamação, principalmente das vias aéreas deixa claro o envolvimento desta enzima na resposta inflamatória da asma e da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).65,67 Além disso, a ADA em concentrações elevadas no fluído pleural humano, pode estar relacionada com a gravidade do quadro clínico de doenças como: tuberculose, linfoma, artrite reumatóide, lupus eritematoso sistêmico e doenças infecciosas como brucelose.68-71
No processo inflamatório, além da migração de leucócitos e da liberação dos seus mediadores químicos, também ocorre a vasodilatação induzida por diferentes agentes flogísticos [bradicinina, histamina, substância P e pelo óxido nítrico (NO)].72-73 O NO é um gás solúvel derivado do metabolismo da L-arginina pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), possui função importante na sinalização celular e
está envolvido no relaxamento vascular, na modulação da agregação plaquetária e na inibição da adesão leucocitária.74 Os efeitos deletérios do NO são decorrentes da sua interação com as EROs, formando espécies reativas de nitrogênio (ERNs). Estas espécies são capazes de lesar o ácido desoxirribonucléico (DNA), os lipídeos microbianos e as células vizinhas saudáveis, sendo esse o mecanismo responsável pela maioria dos processos inflamatórios observados em doenças auto-imunes.75
O estresse oxidativo induzido por EROs como o ânion superóxido, peróxido de hidrogênio (H2O2) e os radicais hidroxila parece ser um dos fatores primários na etiologia de diversas doenças.76
As células ativadas como os macrófagos e neutrófilos, envolvidas na patogênese de doenças liberam EROs, que podem reagir com várias biomoléculas importantes levando dano protéico, lipídico e do DNA de células vizinhas.77
O excesso de espécies reativas no organismo é inibido por antioxidantes produzidos pelo organismo ou absorvidos da dieta. De acordo com Halliwell (2000), antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa concentração comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne significativamente a oxidação do mesmo. No organismo existem quelantes fisiológicos que reduzem o excesso de espécies reativas.78 Algumas enzimas antioxidantes destacam-se neste processo de quelação, como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa S-transferase (GST).79 A SOD corresponde a uma família de enzimas com diferentes grupos prostéticos em sua composição. Nos seres eucariontes existem duas formas de SOD. A forma SOD-cobre-zinco está presente principalmente no citosol, enquanto que SOD-manganês está localizada na mitocôndria. Esta enzima também tem papel antioxidante, já que catalisa a dismutação do radical superóxido em H2O2 e oxigênio (O2), na presença do próton H+.80,81 A CAT é uma hemoproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a água (H2O) e O2, e esta enzima é encontrada no sangue, na medula óssea, nas mucosas, no rim e no fígado.82 A GPx catalisa a redução do H2O2 e peróxidos orgânicos para seus correspondentes alcoóis às custas da conversão da glutationa reduzida (GSH) a glutationa oxidada (GSSG). Embora a GPx tenha ação fundamentalmente citosólica, in vitro ela é capaz de reduzir hidroperóxidos de membrana.83 A GST neutraliza carbono eletrofílico e é considerada a principal enzima detoxificante da fase 2 da biotransformação hepática (reações de conjugação), desempenha papel fisiológico na detoxificação de agentes alquilantes,
incluindo compostos farmacologicamente ativos. A GST torna os xenobióticos menos tóxicos e mais solúveis em água, o que facilita sua excreção.84
O balanço das EROs, em termos de sobrevivência celular e proliferação, assim como na morte celular, recentemente ganhou destaque da comunidade científica e dos médicos envolvidos no estudo de diversas doenças. Além disso, existem evidências demonstrando que as reações inflamatórias possuem um importante envolvimento das EROs e das ERNs, como o ânion superóxido, NO entre outros, que promovem a peroxidação lipídica ou a degeneração dos lipídios. Estudos revelam que o estresse oxidativo exerce um papel fundamental em diversas doenças como o câncer, a aterosclerose, o diabetes, as doenças degenerativas, bem como nas doenças inflamatórias como a artrite reumatóide e a asma.85,86 Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação das EROs frente ao estresse oxidativo, porém a membrana é um dos elementos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica, que acarreta alterações na sua estrutura e permeabilidade.87
Desta forma, quando células e tecidos são expostos a um estresse oxidativo induzido por poluentes ambientais, infecções, reações inflamatórias ou diminuição das concentrações de antioxidantes, concentrações elevadas de EROs e ERNs podem induzir diversas doenças, como câncer, aterosclerose e doenças neuro-degenerativas.75
Atualmente sabe-se que o estresse oxidativo está envolvido em diversos processos inflamatórios, agudos e crônicos. Em algumas doenças, como por exemplo, as pneumonias e a asma brônquica, ocorre aumento significativo na peroxidação lipídica.77 Além disso, em outras doenças de caráter inflamatório, como o diabetes, a aterosclerose e as doenças degenerativas, também se observa redução na capacidade antioxidante do organismo, promovendo desequilíbrio na liberação de EROs e ERNs.88 Estes fatos evidenciam a importância do equilíbrio na produção/liberação de EROs e ERNs, para que ocorra controle da severidade das doenças e consequentemente redução nas possíveis lesões teciduais.
Vários estudos experimentais e clínicos enfatizam a presença marcante de grandes concentrações de EROs e ERNs em lesão pulmonar inflamatória.89,90 A asma é um exemplo de doença inflamatória pulmonar na qual ocorre aumento significativo de espécies reativas como o ânion superóxido, H2O2 e radical hidroxila, devido a ativação de leucócitos por mediadores pró-inflamatórios como as citocinas.91
Neste contexto, salienta-se que as defesas antioxidantes exercem papel fundamental. Dentre os componentes antioxidantes destacam-se as defesas antioxidantes não-enzimáticas como os tocoferóis, os carotenóides, o ácido ascórbico, a bilirrubina e a transferrina, e as defesas antioxidantes enzimáticas como destaque para a SOD, CAT, GPx e GST, que atuam no balanço redox dos processos fisiológicos e inflamatórios.92
Na prática clínica os marcadores do estresse oxidativo que estão relacionados ao grau de acometimento das vias aéreas é bastante limitado. No entanto, alguns autores evidenciam que as espécies aumentadas na asma podem ser em parte controladas pelas enzimas antioxidantes, como por exemplo, o ânion superóxido que é convertido em H2O pelas enzimas SOD e GPx.93 Além disso, o excesso de EROs produzidas no pulmão de pacientes asmáticos é correlacionado com o grau de hiperresponsividade das vias aéreas, o qual pode ser avaliado por ensaio clínico utilizando-se metacolina.93
Outros mediadores que participam do processo inflamatório e merecem destaque são as citocinas. Estas também estão envolvidas em inúmeros processos biológicos, que incluem o desenvolvimento embrionário, a resposta não-específica à infecções, a resposta específica a antígenos, patogênese de doenças virais, bacterianas e auto-imunes, bem como o envelhecimento celular e a rejeição a enxertos.94
As citocinas são produzidas e liberadas por diferentes células incluindo linfócitos T helper 1 (TH1), T helper 2 (TH2), T helper 17 (TH17) e T reguladoras (Treg), células T citotóxicas, linfócitos B, mastócitos, células fagocíticas mononucleares, neutrófilos e células dendríticas, entre outras.95,96
De forma geral, as citocinas são classificadas em subgrupos, como: interleucinas, fator de necrose tumora l alfa (TNF-α), fatores de crescimento transformante (TGF), quemocinas (CCR1, CCR5, CXCR2), interferons (IFN) e fatores estimuladores de colônia ou ainda, podem ser classificadas conforme sua atividade biológica como: pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, fator de crescimento transformante do tipo beta: TGF-β) e anti-inflamatórias (antagonista natural da interleucina -1: IL-1Ra, IL-4, IL-10, IL-13).97 Um balanço inadequado entre as citocinas pró e anti-inflamatórias durante uma resposta imune é crítico na resolução, ou não, do processo inflamatório.95,98-101
Nas doenças inflamatórias das vias aéreas como a asma brônquica e a DPOC as citocinas modulam as alterações estruturais das vias aéreas, bem como a resposta inflamatória crônica.
Destacam-se as seguintes alterações das vias aéreas, que são amplamente mediadas por citocinas: o remodelamento das vias aéreas, que incluem metaplasia das células epiteliais, fibrose subepitelial, hipertrofia/hiperplasia da musculatura lisa, alterações na função mucociliar, hipersecreção de muco, alterações na permeabilidade vascular e angiogênese. Dentre as citocinas envolvidas na asma brônquica e DPOC destacam-se: as citocinas liberadas pelas células Treg (IL-4, IL-5, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-25 e IFN- ), as citocinas pró-inflamatórias (IL-1 , IL-6 e TNF- ), fatores de crescimento [fator de crescimento endotelial (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), GM -CSF, TGF- ], as quemocinas (CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CXCR2 e CXCR3) e as citocinas anti-inflamatórias (IL-10 e IL-1Ra).102,103
A família da IL-1 (IL-1 , IL-1 e IL-1Ra) desempenha importante papel no desenvolvimento da resposta imune e do processo inflamatório por meio da liberação de outras citocinas e quemocinas, além de estimular a síntese de eicosanóides como a prostaglandina E2, aumentar a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (NOSi) e de metaloproteinases.104,105 A IL-1 é sintetizada principalmente por monócitos e macrófagos, age sinergicamente com o TNF- amplificando a resposta inflamatória, promovendo a expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais e nos leucócitos, e desta forma a diapedese celular.105 A IL-1 está associada a patogênese da asma brônquica e DPOC103, além de outras doenças de caráter inflamatório crônico como a artrite reumatóide104, a sepse106 e a pielonefrite.107
O TNF-α é outra citocina pró-inflamatória liberada por neutrófilos, macrófagos, células T e B, células natural killer (NK), mastócitos, células endoteliais, células musculares cardíacas e lisas, fibroblastos, osteoclastos e células do estroma, entre outras.108,109 Esta citocina é um importante ativador de neutrófilos, indutor da expressão da molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM-1), da molécula de adesão vascular do tipo 1 (VCAM-1) e das Selectinas E (E-Selectinas) em células endoteliais. As moléculas de adesão, por sua vez, estimulam a quimiotaxia de leucócitos para o local da inflamação.109 Além disso, o TNF-α também é capaz de induzir a sua própria liberação ou a liberação de outras citocinas, como a IL-1β.108,109 O TNF- está envolvido em diversas doenças inflamatórias, dentre elas citam-se: a espondilite anquilosante110, o infarto agudo do miocárdio111, a artrite reumatóide112,113, entre outros. Estudos in vivo têm demonstrado que a
terapia com anti-TNF- inibe a resposta inflamatória em pacientes com artrite reumatóide e insuficiência cardíaca crônica114, bem como, promove a redução da hiperresponsividade brônquica, da freqüência e exacerbação dos sintomas da asma, contribuindo para a melhoria da qualidade de vida dos pacientes acometidos por esta doença.115
As células TH17, subpopulação de células T helper CD4+, são
assim denominadas por produzirem/liberarem preferencialmente a citocina denominada IL-17. Dentre os subtipos de IL-17, destacam-se a IL-17A e a IL-17F que são produzidas por células TH17, células T
CD8+, células T gama/delta (γδ), células NK, monócitos e neutrófilos
ativados.116-120
Destacam-se ainda, outros subtipos da citocina IL-17 [IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (também denominada como IL-25) e IL-17F] que foi reconhecida como pró-inflamatória e está envolvida na resposta inflamatória crônica, como por exemplo na angiogênese, no recrutamento de células inflamatórias, e na indução de mediadores
inflamatórios pelas células endoteliais.121 As IL-17A e IL-17F atuam
sinergicamente com outras citocinas como TNF-α, IL-1, e IFN- na
ativação celular.122 Estudos in vitro e in vivo sugerem ainda que a
citocina IL-17 está relacionada a patogênese da asma brônquica.123-125 Além disso, IL-17A e IL-17F induzem a granulopoiese e a quimiotaxia
de neutrófilos para o local da infecção.126,127 Estas citocinas ainda estão
relacionados a defesa do hospedeiro118 contra patógenos infecciosos128 e
contribuem para a patogênese de doenças auto-imunes como artrite
reumatóide129,130, esclerose múltipla131, doença inflamatória intestinal132
e psoríase.133
O VEGF foi originalmente descrito como um fator de permeabilidade vascular por estar relacionado ao extravasamento de proteínas plasmáticas para os tecidos, e consequente formação de edema, bem como com a hiperresponsividade das vias aéreas.134,135 Análises imunoistoquímicas mostram que em biópsias das vias aéreas de pacientes com asma, mastócitos, eosinófilos, fibroblastos e células da musculatura lisa são capazes de produzir VEGF.136-139
O VEGF possui ainda papel importante na formação de novos vasos sanguíneos nas vias aéreas de pacientes com asma brônquica.136,140,141 Além disso, o aumento da expressão de VEGF no pulmão de pacientes com asma ocorre pela liberação de mediadores pró-inflamatórios como TNF- e NO.142,143
A liberação de VEGF por eosinófilos também contribui para o remodelamento vascular na asma brônquica.144 Estudo em pacientes
com asma demonstrou concentrações elevadas de VEGF no escarro induzido e este fato foi associado ao grau de obstrução das vias aéreas.145
1.3 TERAPIA DAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS
As doenças como asma brônquica, artrite reumatóide e doenças alérgicas, além da rejeição de enxertos, são de difícil tratamento, desta forma vários estudos têm sido realizados na tentativa de melhor estudar a fisiopatologia destas doenças, bem como desenvolver novos fármacos mais eficazes e com menos efeitos colaterais.
Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) são os
medicamentos mais comumente utilizados no tratamento de doenças inflamatórias, uma vez que são eficazes contra os efeitos decorrentes da liberação de mediadores pró-inflamatórios, tais como dor, febre, edema, entre outros. Os AINEs exercem seu efeito anti-inflamatório na via do ácido araquidônico, por meio da inibição da enzima ciclooxigenase (COX), impedindo, desta forma, a síntese de eicosanoides, incluindo
principalmente a prostaglandina E2 (PGE2).
146,147
. O efeito dos AINEs na produção de prostaglandinas é também a principal causa da sua toxicidade, refletindo na alteração da função renal, risco de doenças
cardiovasculares148 e úlcera péptica.149 A indometacina, fármaco
utilizado como anti-inflamatório não esteroidal de referência neste
estudo, é classificada como um inibidor não seletivo da COX.146
Assim como os anti-inflamatórios não-esteroidais, os glicocorticoides também são fármacos utilizados mundialmente como agentes anti-inflamatórios, uma vez que atuam em diversos tipos de
células e tecidos.150 No presente estudo, utilizou-se a dexametasona
como representante dos glicorticoides a fim de estabelecer comparações de efeito com as glitazonas alvo do estudo em questão. O mecanismo de ação anti-inflamatória dos glicocorticoides pode ser classificado em
genômico e não-genômico.150 Seu efeito genômico ocorre por meio da
ligação a um receptor específico presente na membrana citoplasmática, seguida da translocação do complexo glicocorticoide-receptor para o núcleo, onde o mesmo atua como um fator de transcrição, ligando-se a elementos responsivos aos glicocorticoides na região promotora de diversos genes alvos e, desta forma, modula a expressão gênica por
transrepressão ou transativação.151 Por meio da transrepressão gênica, o
tais como de citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento, moléculas de adesão, óxido nítrico, prostanoides, autacoides, entre
outros.152 Por outro lado, a transativação gênica promove a transcrição
de genes, tais como da interleucina-10 (IL-10), do antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-1Ra), da anexina 1, entre outras moléculas
que exercem ação anti-inflamatória.152 Além dos efeitos nucleares, os
glicocorticoides promovem também os efeitos não-genômicos, os quais podem ser classificados em 4 mecanismos: 1) sinalização por meio de um receptor de membrana, 2) efeito direto na membrana, 3) interação do receptor de glicocorticoide com outras proteínas sinalizadoras no citoplasma e 4) translocação do receptor de glicocorticoide para a
mitocôndria.151
1.4 MODELOS DE INFLAMAÇÃO
Várias doenças de caráter inflamatório induzem a formação de edema, infiltração de leucócitos e liberação de vários mediadores pró-inflamatórios. Dentre as doenças das vias aéreas, cujas características fisiopatológicas envolvem reconhecidamente a resposta inflamatória, destaca-se a asma brônquica.
Algumas espécies de animais têm sido utilizadas em modelos experimentais de asma, incluindo cobaia, cão, camundongos e ratos. Estes modelos experimentais permitem avaliar as alterações morfológicas, imunológicas e fisiológicas nas vias respiratórias que podem mimetizar alguns eventos que ocorrem na asma brônquica humana. Desta forma, modelos em camundongos podem proporcionar uma oportunidade para estudar vários aspectos da doença, devido à facilidade de avaliar-se a resposta imunológica e farmacológica.153
Dentre os diversos modelos experimentais para indução de inflamação pulmonar pode-se citar o modelo de indução de inflamação eosinofílica. Esse modelo utiliza camundongos BALB/C ou C57BL/6, que são sensibilizados com ovalbumina (OVA) e o adjuvante hidróxido de alumínio. As vias aéreas dos camundongos sensibilizados com este agente flogístico apresentam resposta alérgica imediata e tardia similar à asma alérgica, que ocorre em humanos. Nesse modelo experimental, o lavado bronco-alveolar é coletado um ou dois dias após o desafio, permitindo a avaliação de parâmetros inflamatórios, e dessa forma, o estudo da asma eosinofílica.154
Outro modelo experimental utiliza a inoculação de vírus, como por exemplo, o vírus sincicial respiratório (VSR), pois infecções virais do trato respiratório são comuns em todas as idades, e, em especial os pacientes com asma brônquica apresentam exacerbações destas doenças quando acometidos por infecções virais. Os modelos experimentais em camundongos após exposição intranasal do vírus permitem avaliar parâmetros imunológicos sistêmicos e locais como o estudo do remodelamento das vias aéreas, a liberação de diversos mediadores inflamatórios, além da celularidade. O maior inconveniente da utilização desse modelo é que o uso de vírus necessita de maiores investimentos laboratoriais, considerando que o cultivo e os métodos de infecção, em geral, são mais complexos.155,156
Existem ainda modelos combinados, nos quais os camundongos são expostos a alérgenos e a vírus, pois estudos demonstraram que os pacientes com asma alérgica, quando expostos a infecções virais, apresentam episódios de hiperresponsividade das vias aéreas e exacerbação da doença. Esses modelos também permitem a avaliação da resposta inflamatória local e sistêmica.157
Além disso, existem modelos experimentais em camundongos que mimetizam a asma neutrofílica. Nesta condição clínica, a resposta inflamatória pulmonar apresenta o predomínio do influxo de neutrófilos. Dentre os modelos utilizados, destacam-se a indução de infecção pulmonar com Pseudomonas aeruginosa vivas e o uso de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para estimular a resposta imune inata.158-159
Outro modelo que permite a avaliação da inflamação na cavidade pleural e no pulmão é o modelo da pleurisia que foi originalmente desenvolvido em ratos160, reproduzido em cobaias161, e também descrito em camundongos.162 A pleurisia murina induzida pela carragenina (Cg) é um modelo que mimetiza a asma brônquica neutrofílica. Neste modelo, observa-se uma resposta do tipo bifásica, sendo que na primeira fase (4 h) da resposta inflamatória ocorre aumento da exudação e do influxo de neutrófilos na cavidade pleural dos camundongos. E na segunda fase (48 h) da resposta inflamatória, observa-se também exsudação elevada, bem como o aumento do influxo de células mononucleares. A pleurisia induzida pela Cg em camundongos possui vantagens em relação aos outros modelos citados anteriormente, pois, a partir da coleta do exsudato da cavidade pleural, é possível analisar e quantificar diversos parâmetros inflamatórios como celularidade, exsudação e mediadores inflamatórios.162,163
Neste trabalho, optou-se pelo modelo experimental da pleurisia induzida pela Cg, em camundongos. A escolha deste modelo foi baseada na facilidade de execução da técnica, depois de adequado treinamento. Além disso, o agente indutor da pleurisia, a carragenina, é um derivado vegetal com ação inflamatória e pró-oxidante, o que possibilita a avaliação e quantificação de parâmetros relacionados a estes eventos.164
1.5 JUSTIFICATIVA
A busca por substâncias capazes de prevenir, amenizar e curar vem desde os primórdios da existência humana.
Existem evidências de que as espécies reativas, e consequentemente o estresse oxidativo, podem ser a causa ou a conseqüência de doenças inflamatórias humanas. Apesar do grande arsenal terapêutico disponível para o tratamento de doenças inflamatórias, muitas destas ainda possuem terapia limitada. Além disso, muitos pacientes apresentam tolerância aos tratamentos convencionais e alta frequência de efeitos adversos.
Fármacos e outras substâncias que demonstrem efeito anti-inflamatório e redução da produção de espécies reativas constituem-se como importante objeto de estudo para o tratamento de doenças de caráter inflamatório.
1.6 HIPÓTESES
H1: Os fármacos rosiglitazona e pioglitazona apresentam efeito anti-inflamatório e/ou antioxidante, no modelo experimental da pleurisia murina induzida por Cg;
H0: Os fármacos rosiglitazona e pioglitazona não apresentam efeito anti-inflamatório e/ou antioxidante, no modelo experimental da pleurisia murina induzida por Cg.
2 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos anti-inflamatório e/ou antioxidante do maleato de rosiglitazona e do cloridrato de pioglitazona, administrados por via intra-peritoneal (i.p.) na primeira (4 h) e segunda (48 h) fases da resposta inflamatória induzida pela carragenina (Cg).
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Avaliar os efeitos do maleato de rosiglitazona (ROSI) e do cloridrato de pioglitazona (PIO) sobre a migração de leucócitos e a exsudação no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
II. Verificar o efeito dos fármacos sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e adenosina-deaminase (ADA) no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
III. Estudar o efeito dos fármacos sobre as concentrações das citocinas fator de necrose tumoral-alfa (TNF- ) e interleucina-1 beta (IL-1 ) no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
IV. Avaliar o efeito da rosiglitazona sobre as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx), da interleucina-17A (IL-17A) e do fator de crescimento vascular endotelial-alfa (VEGF- ) no lavado da cavidade pleural dos camundongos;
V. Verificar o efeito da pioglitazona sobre a atividade das enzimas Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutationa Peroxidase (GPx) e Glutationa S-transferase (GST) no sangue dos camundongos;
VI. Analisar o efeito da pioglitazona sobre as concentrações de Substâncias Reativas do Acido Tiobarbitúrico (TBARS) no lavado da cavidade pleural dos camundongos.
3 METODOLOGIA
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Este trabalho é um estudo experimental, prospectivo e controlado.
3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
3.2.1 Animais
Para a técnica de pleurisia foram utilizados camundongos albinos suíços, 1 mês de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18 e 25 g, fornecidos pelo Biotério Central da UFSC.
Os animais mencionados foram acomodados em gaiolas plásticas com serragem, sob temperatura ambiente e a luz natural. Estes animais receberam alimentação e água durante todos os experimentos.165 Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) sob protocolos № PP00181 e PP00027/06 (Anexos 1 e 2).
3.2.2. Desenho experimental
Para investigar o efeito das glitazonas estudadas sobre os parâmetros inflamatórios primeiramente realizaram-se curvas dose e tempo-resposta para ambos os fármacos.
Na primeira fase (4 h) da pleurisia induzida pela Cg, em camundongos, diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses da rosiglitazona (ROSI 0,5 - 10 mg/Kg, i.p.) ou pioglitazona (PIO 5 - 50 mg/kg, i.p.) 30 min antes da aplicação da Cg e a inflamação foi analisada após 4 h. Após a escolha da melhor dose que inibiu o influxo de leucócitos e/ou a exsudação procedeu-se a análise da curva tempo-resposta para ambos os fármacos. Desta forma, uma das doses acima foi escolhida e administrada em diferentes grupos de
animais em diferentes períodos de tempo (1 - 4 h) antes da aplicação do agente flogístico e a inflamação foi analisada 4 h após (Fig. 2A).
Na segunda fase (48 h) da resposta inflamatória induzida pela Cg, também realizou-se curvas dose e tempo-resposta. Desta forma, na análise da curva dose-resposta diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses da ROSI (5 - 20 mg/Kg, i.p.) ou PIO (10 - 50 mg/Kg, i.p.) 30 min antes da aplicação da Cg e a inflamação foi analisada após 48 h. Em seguida, após a escolha da melhor dose que inibiu o influxo celular e/ou a exsudação, esta dose foi administrada em outros grupos de animais em diferentes períodos de tempo (1 - 24 h) antes da aplicação do agente flogístico e a inflamação foi analisada 48 h após (Fig. 2B).
Uma vez que a pioglitazona nas doses avaliadas, quando administrada 30 min antes da Cg não foi efetiva na inibição de leucócitos e/ou a exsudação, outro protocolo foi realizado para este fármaco. Desta forma, outros grupos de animais foram tratados com a PIO (10 e 20 mg/Kg, i.p.), administrada em duas doses, a primeira 30 min antes da aplicação da Cg e a segunda dose 24 h após (Fig. 2D). Além disso, também outros diferentes grupos de animais foram tratados com a PIO (10 e 20 mg/Kg, i.p.), administrada em quatro doses, a primeira 30 min antes da aplicação da Cg e as outras 3 doses administradas com intervalo de 12 h. A inflamação foi analisada 48 h após a aplicação do agente flogístico (Fig. 2C).
Para avaliar a exsudação os animais foram tratados com solução corante azul de Evans (25 mg/kg, i.v) 10 min antes dos experimentos.
Finalmente, após a escolha da melhor dose e tempo de tratamento prévio pelo qual os fármacos inibiram o influxo de leucócitos e a exsudação, estudou-se o efeito da ROSI sobre a atividade das enzimas MPO e ADA, e sobre as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx), do TNF-α, da IL-1β, da IL-17A e do VEGF-α, bem como avaliou-se o efeito da PIO sobre a atividade das enzimas MPO, ADA, SOD, CAT, GPx e GST e sobre as concentrações de TBARS. O efeito dos fármacos sobre estes parâmetros foi observado 4 e 48 h após a indução da pleurisia.
Para todos os parâmetros inflamatórios estudados, paralelamente, grupos de animais foram tratados com: 1) salina estéril (NaCl 0,9%) controle negativo), 2) carragenina 1% (grupo-controle positivo), 3) dexametasona (0,5 mg/Kg, i.p.) + Cg e 4) indometacina (5 mg/Kg, i.p.) + Cg. Estes últimos grupos foram utilizados para compararmos o efeito das glitazonas com os fármacos de referência.
Figura 2: Protocolo experimental da pioglitazona. (A) Pioglitazona (PIO) admininistrada nas doses de 5 a 50 mg/kg, i.p. 30 min antes da aplicação da carragenina e a inflamação foi analisada após 4 h. (B) PIO administrada nas doses de 10 a 50 mg/Kg, i.p., 30 min antes da aplicação da carragenina e a inflamação foi analisada após 48 h. (C) PIO administrada nas doses de 10 ou 20 mg/Kg, i.p., em quatro doses, a primeira 30 min antes da aplicação da carragenina e as outras 3 doses administradas com intervalo de 12 h, e a inflamação foi analisada 48 h após. (D) PIO administrada nas doses de 10 ou 20 mg/Kg, i.p., em duas doses, a primeira 30 min antes da aplicação da carragenina e a segunda dose após 24 h, e a inflamação foi analisada 48 h após. (↓) Indica os intervalos de tratamento com a pioglitazona, (▲) tempo da indução da pleurisia (0) aplicação da carragenina (Cg).
Os diferentes grupos de animais utilizados para contemplar o desenho experimental deste estudo estão descritos a seguir:
Rosiglitazona
a) Pleurisia 4 h
Grupos 1-5: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de rosiglitazona (ROSI 0,5 - 10 mg/kg), administrada 30 min antes da carragenina (n = 5 para cada grupo). Grupo positivo [carragenina (Cg 1%)) (n = 3), grupo controle-negativo (salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 6-8: Curva tempo-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com uma única dose de rosiglitazona administrada em diferentes períodos de tratamento prévio (2, 4, e 8 h) n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 9-16: Efeito da rosiglitazona [ROSI (5 mg/Kg) administrada 30 min antes da Cg] sobre a atividade das enzimas MPO e ADA, e sobre as concentrações de NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A e VEGF- na inflamação induzida pela Cg (n = 5 para cada parâmetro). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril - NaCl 0,9% (S)] (n = 3).
b) Pleurisia 48 h
Grupos 17-19: Curva dose-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com diferentes doses de rosiglitazona (ROSI 5 - 20 mg/kg), administrada 30 min antes da carragenina (n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 20-22: Curva tempo-resposta: Diferentes grupos de animais foram tratados com uma única dose de rosiglitazona administrada em diferentes períodos de tratamento prévio (2, 4, e 8 h) n = 5 para cada grupo). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
Grupos 23-29: Efeito da rosiglitazona (ROSI 10 ou 20 mg/Kg) administrada 30 min antes da Cg sobre a atividade das enzimas MPO e ADA, e sobre as concentrações de NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A e VEGF- na inflamação induzida pela carragenina (n = 5 para cada parâmetro). Grupo controle-positivo [carragenina (Cg 1%)] (n = 3), grupo controle-negativo [salina estéril – NaCl 0,9%) (S)] (n = 3).
