8. RESULTADOS [PARTE 2]
8.5 Modelos polinomiais
A Tabela 18 apresenta os coeficientes obtidos na modelagem dos dados experimentais apresentados na Tabela 17. Observa-se que não houve falta de ajuste significativa e que os valores experimentais obtidos a partir da
formulação de um ponto aleatório (x1= -0,25, x2= 0,34 e x3= 0,83) não diferiram
estatisticamente dos valores estimados pelos respectivos modelos
Baseado nos modelos polinomiais apresentados na Tabela 18, a variação observada da lipoxigenase foi significativa somente para a resposta da tonalidade amarela (b).
Tabela 18. Regressão linear, coeficientes de interação quadrática e interação linear-linear para os modelos polinomiais de segunda ordem.
Fatores Volume específico Qualidade Sensorial Tonalidade (b) Constante ( 0) 7,5 ± 0,04 7,8 ±0,1 13,6 ±0,1 LOX ( 1) - - -1,2 ±0,1 W ( 2) 0,9 ± 0,07 0,7 ± 0,1 -0,5 ±0,1 Tempo ( 3) 1,2 ± 0,05 -0,2 ±0,1 -0,2 ±0,1 LOX x LOX ( 11) - - 0,9 ±0,1 W x W ( 23) - -0,4 ±0,1 - T x T( 33) - -0,6 ±0,1 - LOX x W ( 12) - - -0,3 ±0,1 LOX x T ( 13) - - - W x T( 23) 0,5 ± 0,07 0,5 ±0,1 - p (falta de ajuste) 0,100 0,491 0,184 1 R2 0,88 0,46 0,87 Valor previsto2 8,40 8,12 12,65 Valor observado2 8,4 ± 0,3 8,2 ± 0,6 13,00 ±0,22 p3 0,79 0,89 0,26 1
R2 é a proporção da variação explicada pelo modelo ajustado.
2
Valor aleatório para as variáveis codificadas.
3
Probabilidade obtido pelo teste t para variáveis independentes contra um valor fixo.
A Figura 40 e a Figura 41 mostram a variação do efeito do branqueamento da lipoxigenase, satisfatoriamente descrito pela regressão de segunda ordem, quando o tempo de fermentação varia de 2 a 6 h e quando a força da farinha varia de 231 a 258 x 10-4 Joules. Observa-se o efeito da lipoxigenase na tonalidade amarela (b) de acordo com diferentes tempos de fermentação (2 a 6 h), usando uma farinha de força média (245 x 10-4 Joules) para formular os pães (x2=0).
Valor b 16 15,5 15 14,5 14 13,5 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Atividade de lipoxigenase (x1) -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 T em p o de F er m e n taç ão (x3 ) 15.6 13.4 13.1 15.8 13.6 13,4 16.1 13.9 13.6
Figura 40. Curvas de contorno relativas ao efeito de branqueamento no miolo do pão (valor b) resultante da variação da atividade da lipoxigenase (x1) e o do tempo de fermentação (x3),
adotando-se a força media da farinha de trigo (x2 =0).
Valor b 14 13,6 13,2 12,8 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Atividade de lipoxigenase (x1) -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 F or ç a d a f ar inha de t ri go ( x2 ) 15.7 13.1 12.6 15.9 13.6 13.4 16.0 14.2 14.2
Figura 41. Curvas de contorno relativas ao efeito de branqueamento no miolo do pão (valor b) resultante da variação da atividade da lipoxigenase (x1) e o da força da farinha (x3), adotando-
Observa-se o efeito da variação de atividade da lipoxigenase na tonalidade amarela (b) de acordo com a variação da força da farinha (231 a 258 x 10-4 Joules), submetida a 4 h de fermentação (x3=0).
9. DISCUSSÃO
“
Your theory is crazy, but it's not crazy enough to be true.”
Niels Bohr (1885-1962). Prêmio Nobel de Física (1922).O presente trabalho procurou estudar como a lipoxigenase da soja interage com outros compostos habitualmente usados na indústria de panificação em duas etapas:
1ª) como proporções diferentes de cada composto promoveriam modificações de cor e de reologia na farinha de trigo, e posteriormente, quais alterações físico-químicas, sensoriais e reológicas poderiam ser observadas nos pães formulados com essas farinhas;
2ª) procurou-se também, identificar uma proporção otimizada entre os três compostos que explorasse o sinergismo funcional e sensorial, buscando branqueamento de carotenóides com as melhores propriedades reológicas.
A seguir, buscou-se uma melhor compreensão de como a ação da enzima lipoxigenase pode ser alterada em função da força da farinha e do tempo de fermentação da massa. Com base nos resultados obtidos os seguintes tópicos foram levantados para a discussão:
y Pode-se afirmar que a farinha de soja ativa integral utilizada neste
estudo apresentou alta atividade de lipoxigenase fração 1 (LOX1)?
A atividade enzimática da farinha de soja utilizada neste estudo (71 unidades/ µg/ml de proteína) foi considerada alta mediante a comparação com determinações de atividade em diversas variedades de soja (CD216, BR36, BRS184, CD201, BRS133, entre outras). A fração 1 da lipoxigenase foi escolhida para o presente estudo porque está mais associada à qualidade reológica e de cor em panificação que as demais frações encontradas na soja (KLEIN et al., 1984; CUMBEE; HILDEBRAND; ADDO, 1997; SERPEN; GÓKMEN, 2006) e a atividade desta fração na farinha de trigo foi ausente, eliminando assim a possibilidade de interferência.
É importante ressaltar a dificuldade em comparar os valores de atividade enzimática para LOX1 na literatura porque os autores costumam
expressá-la de formas diferentes. Por exemplo: unidades/g de amostra; nmol de oxigênio consumido/segundo; µmol de hidroperóxido/min; µmol de hidroperóxido/g de farinha; nmols de dienos conjugados/segundo/mg de proteína.
A decisão de se usar farinha de soja sem lipoxigenase (não- transgênica) como padrão negativo de atividade e não simplesmente a inativação térmica dos grãos usados para processar a farinha ativa foi baseada no seguinte ensaio: farinha de soja integral ativa contendo alta atividade de LOX1, caracterizada neste estudo como LOX +1 foi submetida a tratamento térmico (150 °C/3 min), de acordo com Ribotta et al. (2004). No entanto, nenhuma proteína foi extraída quando aplicado o mesmo método para medir a atividade da lipoxigenase nas amostras originais. Este fato pode ter sido devido a mudanças estruturais causadas pela desnaturação da proteína, que por sua vez, influencia propriedades funcionais como a solubilidade. Modificações no pH tampão e concentrações de sal não alteraram os resultados. Por essa razão, foi escolhido utilizar uma farinha integral obtida de grãos de soja sem lipoxigenase como padrão (-1), sendo o ponto central (0) resultado de uma mistura 50%/50% de ambas as amostras. Foi interessante observar que essa mistura das duas farinhas produziu uma atividade enzimática média linear, não apresentando interações que pudessem favorecer ou inibir a atividade da enzima.
y Porque a mistura de lipoxigenase a ácido ascórbico apresentou
sinergia na resistência à extensão da massa?
Os resultados reológicos iniciais na farinha de trigo sugeriram que a lipoxigenase poderia ter favorecido o efeito do ácido ascórbico no aumento da elasticidade da massa (P) conforme pode ser visto na Figura 25. A mistura FIS+AA, contendo 250 ppm de ácido ascórbico e 0,5% de lipoxigenase promoveu um aumento na elasticidade na massa maior que aquele observado na presença de 500 ppm de ácido ascórbico e 1% de FIS isoladamente, sugerindo que a lipoxigenase poderia contribuir para oxidação do ácido ascórbico em ácido desidroascórbico.
Nas avaliações sensoriais dos pães, aqueles formulados com a mesma proporção de farinha integral de soja e ácido ascórbico mostraram maior elasticidade e maciez que o controle. As evidências encontradas nesse estudo sugerem que a lipoxigenase da soja seria capaz de participar como um catalisador na oxidação do ácido ascórbico para ácido desidroascórbico que é o melhorador efetivo na reologia dos pães. Essa hipótese foi sugerida anteriormente em uma publicação de Cherdkiatgumchai e Grant (1986), porém sem detalhamento do mecanismo bioquímico.
A base teórica para essa hipótese é dada pelo papel catalítico dos íons de metais de transição na oxidação do ácido ascórbico para ácido desidroascórbico (STAUFFER, 1990; LARSON, 1997a). Segundo Eberhardt (2001), o íon metálico (Fe+2) pode facilitar a transferência de um elétron do ascorbato (AH-), que é a forma tautomérica predominante do ácido ascórbico: [AH2 ' AH– + H+] (BENDICH; MACHLIN; SCANDURRA, 1986;
WIRSTA et al., 2003) para o oxigênio, de acordo com as seguintes etapas:
AH– + Fe2+
'
[AH– + Fe2+] (1) [AH– + Fe2+] + O2'
[AH – + Fe2+ O2] (2) [AH– + Fe2+ O2]'
[AH – + Fe3+ O2• – ] (3) [AH– + Fe3+ O2• – ]'
A•– + Fe2+ + HO2• (4) A•– + O2 DHAA + O2• – (5)A oxidação consiste basicamente de duas etapas de transferência de um elétron. O primeiro passo é a transferência de um elétron do Fe2+ para o O2 que se torna um anion superóxido reativo (equação 3). O segundo passo
é a transferência de um elétron do ascorbato para o íon férrico, tornando-o Fe3+ e o próton (H+) para o anion superóxido (equação 4). Na etapa 5, o ascorbato radical perde um elétron para a molécula de O2, tornando-se um
O O H O H O O O O H O H O- O O O O2 O2-
Figura 42. Oxidação do ascorbato radical para ácido desidroascórbico na presença de oxigênio, correspondente à etapa (5) da reação acima descrita.
Fonte: Eberhardt (2001) [adaptado].
Uma questão importante acerca dessa hipótese é que, para ser aceita seria necessário que íons de ferro estivessem livres para reagir com o ascorbato. Neste caso, existiriam duas possíveis fontes do ferro: o ferro presente na soja e o ferro suplementado na mistura. O tipo de ferro escolhido para ser suplementado na mistura foi o ferro quelato em função de sua maior biodisponibilidade no pH fisiológico e também porque, segundo informação do fabricante (NAME, 2007), não haveria liberação do íon no pH 5,5, que é o pH da massa. Os resultados obtidos das amostras controle, em relação às misturas, evidenciaram que o ferro presente no ferro quelato não participou da reação proposta.
O ferro presente na soja também pode ter duas fontes: uma seria o próprio ferro endógeno da semente, que normalmente está ligado à fitatos (LYNCH, 1997), e o outro seria o ferro presente nas moléculas de lipoxigenase, que por sua vez estaria extremamente protegido por complexação e portanto, não disponível (SPITELLER, 2005).
Uma possível resposta para essa pergunta foi apresentada por Spiteller (2005). O autor afirma que durante a homogeneização (processo que ocorre durante o método de determinação da atividade da enzima, assim como durante o processo de moagem da soja), ocorre o rompimento e dano celular severo, destruindo a proteção da proteína que blinda os íons de ferro, resultando em liberação parcial dos íons metálicos. Um outro subproduto da homogeneização é que esse dano também ative as fosfolipases que clivam fosfolipídios gerando grandes
quantidades de ácidos graxos polinsaturados livres que são substrato para a ativação da enzima de Fe+2 para Fe+3.
A análise da concentração de ferro mostrou que a farinha de soja proveniente de soja com lipoxigenase tinha mais ferro do que a farinha da soja sem lipoxigenase. Desta forma, não foi possível confirmar se a reação catalítica com o ácido ascórbico foi causada pela maior concentração de ferro naturalmente presente na farinha de soja com lipoxigenase, ou pela presença da enzima, que contém ferro.
Uma hipótese semelhante também foi proposta por Roy e Kulkarni (1996) que vem a se somar e reforçar a hipótese central da sinergia entre a lipoxigenase e o ácido ascórbico. Estes autores concluíram que o ácido ascórbico poderia agir como um substrato a ser cooxidado na presença de ácidos graxos polinsaturados pela lipoxigenase de acordo com as seguintes etapas:
LOX-Fe3+ + LA LOX-Fe2+-LA• (1)
LOX-Fe2+-LA•+ O2 LOX-Fe2+-LAOO• (2)
LOX-Fe2+-LAOO•+ AH–
LOX-Fe2+-LAOOH + A•–
(3) A•– +O2 DHAA + O2• – (4) ou 2A•– +H+ DHAA + AH– (5)
É interessante observar que apesar dos autores proporem a síntese do ácido desidroascórbico através da reação com H+ (equação 5) é possível que esta etapa também ocorra, pela reação com o oxigênio (equação 4) conforme sugerido por Eberhardt (2001).
Além destas etapas de transformação do ácido ascórbico para o ácido desidroascórbico, Roy, Sajan e Kulkarni (1995) observaram que a lipoxigenase da soja pode também co-oxidar GSH para GSSH, contribuindo diretamente para a melhora da massa, uma vez que a oxidação do GSH é responsável por minimizar a despolimerização das proteínas do glúten (GROSCH; WIESER, 1999).
Considerando como estes estudos se entrelaçam, há evidências a partir dos resultados do presente trabalho de que a lipoxigenase da soja possa participar da ação reológica melhoradora do ácido ascórbico. A interação entre a lipoxigenase e o ácido ascórbico pode ser proposta de duas formas: 1ª) de acordo com a primeira hipótese, conforme Eberhardt (2001) onde o Ferro da LOX é o elemento que reage com o ácido ascórbico (Figura 43), ou 2ª) de acordo com a segunda hipótese, proposta por Roy, Sajan e Kulkarni (1995) onde a lipoxigenase ligado ao peróxido radical reage diretamente com o ácido ascórbico (Figura 44).
Figura 43. Mecanismo proposto para a interação entre o ferro e o ácido ascórbico na panificação.
Figura 44. Mecanismo proposto para a interação entre a LOX e o ácido ascórbico na panificação.
y Quais foram os efeitos causados pelo peróxido de benzoíla?
Um resultado inesperado foi que o oxidante peróxido de benzoíla alterou negativamente a reologia, aumentando significativamente a extensibilidade da massa e diminuindo sua elasticidade. Uma das hipóteses está nos estudos de Visschers e Jongh (2005) que verificaram que resíduos cisteína nas proteínas ocorrem na forma de sulfidrilas livres (CSH) ou oxidadas (CSSC), formando pontes SS. Os resíduos de cisteína podem exibir grande reatividade química a um elevado número de compostos, diretamente relacionada ao pKa (em torno de 8,3), o que implica que a
reatividade é fortemente reduzida em condições ácidas. Já foi demonstrado que para a panificação, a reatividade química de proteínas contendo cisteína estabiliza as células gasosas na matriz protéica do glúten (MOREL
et al., 2002). O metabólito mais estável na decomposição do peróxido de
benzoíla é o ácido benzóico (SAIZ; MANRIQUE; FRITZ, 2001) que, produzido na reação com os carotenóides, pode ter sido suficiente para promover condições levemente ácidas, diminuindo a elasticidade da massa.
O efeito de branqueamento, com redução da cor amarela na farinha, foi causado pela adição de peróxido de benzoíla, uma vez que a atividade de água nessa matriz é insuficiente para a ação da lipoxigenase. Os provadores identificaram o efeito do peróxido de benzoíla medido instrumentalmente e esse fato justifica a aplicação desse aditivo nas farinhas comerciais obtidas com alto grau de extração. No entanto, um dos produtos da sua reação é o ácido benzóico que pode causar danos à saúde (INCHEM, 2007), justificando-se a necessidade da redução desse aditivo artificial nos produtos processados.
y Por que a farinha de soja e o ácido ascórbico branquearam o miolo
dos pães?
Os ensaios com pães relativos à tonalidade amarela indicaram que a presença da lipoxigenase na mistura foi responsável por valores mais baixos de cor (b) devido a sua capacidade de oxidar carotenóides, tanto pela via aeróbica como anaeróbica. A interação com ácido ascórbico está
associada ao aumento de volume dos pães, e que leva à diluição dos carotenóides na superfície iluminada analisada pelo colorímetro, apontando valores menores de pigmentos amarelos.
y Efeito do ácido ascórbico, força da farinha e tempo de fermentação
nas características reológicas dos pães.
Como já esperado, o ácido ascórbico foi a principal variável responsável pelo aumento do volume específico. O volume dos pães depende de dois principais fatores: o aumento do gás produzido e a capacidade de retenção de gás da massa, este último sendo regido pela matriz do glúten (Clarke et al., 2003) que é reforçada pela ação melhoradora do ácido ascórbico conforme já discutido. Os resultados instrumentais e sensoriais também evidenciaram que o ácido ascórbico melhora a textura dos pães, mas também demonstraram que os pães com a mistura de farinha de soja com ácido ascórbico resultaram na melhora destes parâmetros comparados ao controle.
A força da farinha de trigo e o tempo de fermentação foram as principais variáveis para as respostas de volume específico e qualidade sensorial. A interação positiva observada entre a força da farinha e volume específico está de acordo com os resultados obtidos por Boggini, Tusa e Pogna (1995) e Rao, Mulvany e Dexter (2000) que correlacionaram positivamente o volume específico com o índice W. No entanto, as informações sobre tempo de fermentação e volume dos pães são ainda controversas. Os autores Zghal, Scanlon e Sapisten (2001) observaram que o tempo de fermentação aumentou significativamente o volume dos pães assim como alterou as propriedades mecânicas e de estrutura, devido principalmente à grande redução na densidade do miolo. Entretanto, Gómez
et al. (2004) observaram que, com tempo mais longo de fermentação, a
matriz do glúten perdeu estabilidade nos pães normais, produzindo pães de menor volume. Neste estudo, os resultados mostraram que tempo de fermentação mais extensos tiveram efeitos positivos no volume, mas contribuíram negativamente para a qualidade sensorial, confirmando que
volume é apenas um atributo notado entre outros parâmetros avaliados pelos provadores.
y Por que a Lipoxigenase não alterou a reologia?
Muito embora a lipoxigenase seja conhecida por promover melhor reologia da massa e maior volume (HOSENEY et al., 1980; ADDO et al., 1993; DELCROS et al., 1993; MOREL; REDL; GUILBERT, 2002; JUNQUEIRA et al., 2007), os pães com lipoxigenase ativa neste trabalho não exibiram esse efeito. Os autores Kerr, Faubion e Hoseney (1992) demonstraram que o efeito da lipoxigenase ocorreu durante a mistura na presença de oxigênio. Talvez essa seja uma das questões mais polêmicas sobre os resultados, porque apesar de ter sido observado uma melhora no parâmetro alveográfico P, o volume não se alterou. Entre as possíveis hipóteses pode-se citar: 1º) a presença de fortes compostos que na panificação agem como oxidantes (ácido ascórbico e azodicarbonamida) na formulação dos pães pode ter mascarado o efeito da lipoxigenase que produz variações reológicas menores quando comparadas aos compostos pró-oxidantes tradicionais. A decisão de se utilizar uma mistura de composto pró-oxidantes na formulação dos pães foi devido ao fato de massas sem esses compostos produzirem pães franceses disformes, sem volume e descaracterizados, não refletindo a realidade para o consumo regular (Figura 32) e também porque na prática a lipoxigenase seria adicionada às farinhas já contendo esses compostos. 2º) a decisão de se fazer pães do tipo ‘francês’. Ao contrário do pão de forma utilizada como modelo na primeira etapa deste estudo, o pão do tipo francês não tem sustentação física para o crescimento da massa, exigindo farinhas fortes e/ou oxidantes para obtenção de volume. Como no Brasil a força da farinha apresenta grande variabilidade, o uso de oxidantes para se fazer pães franceses se torna uma prática regular e quase obrigatória frente os hábitos da população. Ou seja, é possível que o efeito da ação da lipoxigenase no volume tivesse sido evidenciado caso o pão de forma tivesse sido produzido em lugar do pão francês.
Desta forma, a hipótese reológica na segunda parte deste estudo não pode ser verificada, uma vez que a lipoxigenase não teve efeito no volume e nas respostas de qualidade sensorial.
y Por que a lipoxigenase interagiu com o tempo de fermentação e
com a força da farinha na redução da tonalidade amarela (valor b )?
Houve uma interação positiva nos pães entre a adição de lipoxigenase e a força das farinhas. Esse efeito pode ser explicado pelo fato de que altos índices de extração normalmente praticados pelos moinhos de trigo incorporam mais casca e fragmentos de aleurona, acrescentando assim pigmentos carotenóides, glutationa e lipases, causando a típica cor amarela (FORTMANN; JOINER, 1971) e reduzindo o desempenho de panificação (GROSCH; WIESER, 1999; CARR; DANIELS; FRAZIER, 1992).
Portanto, estes fatos sugerem que farinhas obtidas com índices de extração baixos são fortemente correlacionadas com maior brancura e índices W altos, produzindo pães com miolo mais branco. Na presença de lipoxigenase, essas farinhas produzem pães com valores b acentuadamente reduzidos devido ao efeito de branqueamento da enzima tornar-se mais visível em um ambiente com menor quantidade de carotenóides. Isto nos leva a ponderar que, mesmo usando farinhas fortes com alto índice W, a suplementação com lipoxigenase proporciona uma vantagem adicional na oxidação de carotenóides.
Ainda analisando o efeito da lipoxigenase na cor, vimos que embora menos expressiva que as outras duas variáveis, o tempo de fermentação reduziu levemente os valores da tonalidade amarela (b), efeito que se torna muito mais relevante na presença de lipoxigenase, sugerindo a ação rápida da enzima; um dado novo, sem estudos conhecidos que tragam essa medida. A queda subseqüente durante o tempo de fermentação pode ser explicada devido à oxidação natural dos pigmentos carotenóides, causada pelo efeito combinado do oxigênio e do calor, e pela diluição desses pigmentos na superfície iluminada analisada pelo colorímetro, diluição esta resultante do aumento do volume dos pães.